尿源性干細(xì)胞外泌體對移動性牙根吸收修復(fù)的影響及其作用機(jī)制▲

顧 磊 戴紅衛(wèi) 周雯雯 周建萍

(1 重慶市消防總隊(duì)醫(yī)院口腔科，重慶市 401122，電子郵箱：guoaili1982@126.com；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2 正畸科，3 修復(fù)科，重慶市 404100)

2008年美國維克森林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究中心首次從人尿液中分離純化得到了一種具有無限自我更新能力和體外繁殖能力的細(xì)胞，其具備祖細(xì)胞特征，故將其命名為“人尿源祖細(xì)胞”。后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，該類細(xì)胞具有與間充質(zhì)干細(xì)胞類似的多向分化潛能，因此將其更名為“人尿源性干細(xì)胞”[1]。眾所周知，干細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新和多向分化能力，一直以來在藥物篩選和疾病治療中研究最為廣泛，臨床上利用自體干細(xì)胞移植治療急性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等疾病，治愈率高，且安全可靠[2]。雖然大部分干細(xì)胞來源較為廣泛，但對其獲取途徑要求極高，制備難度較大，而尿源干細(xì)胞制備方便，安全可靠，來源廣泛且不存在倫理學(xué)爭議，因此具有極好的臨床治療前景[3]。近年來，隨著對尿源干細(xì)胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在皮膚系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及運(yùn)動系統(tǒng)疾病中均具有較好的治療效果[4]。

正畸力作用于牙齒時，可利用牙周膜進(jìn)行傳遞力量，傳遞至牙槽骨后可導(dǎo)致牙槽骨改建或牙周膜更新，最終造成牙齒移動。牙齒在移動過程中會出現(xiàn)不同程度的牙根吸收，發(fā)生率為3%～100%，而牙根吸收長度超過3 mm的發(fā)生率可達(dá)30%[5-7]。牙根吸收作為正畸治療的常見并發(fā)癥之一，其致病原因以及發(fā)生機(jī)制目前尚未十分清楚。本研究利用大鼠移動性牙根吸收修復(fù)模型，探討尿源性干細(xì)胞外泌體對移動性牙根吸收修復(fù)的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)動物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 10只周齡為10周的健康SD大鼠，均為雄性，體重230～260 g，購自北京維通利華公司(動物合格證號：SCXK20060009)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：將大鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物中心，濕度設(shè)置為(55±5)%，溫度設(shè)置為(25±5)℃，并設(shè)置晝夜節(jié)律為12 h，標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)、自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其按照隨機(jī)數(shù)表法分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只大鼠。

1.2.2 建立正畸移動性牙根吸收模型：參考J?ger等[8]的方法建立模型。首先以3 mL/kg的劑量給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉。麻醉后將大鼠仰臥固定于鼠板上，采用低速金剛砂車針在上頜第一磨牙的近中牙頸部和中切牙的牙頸部磨出深度為0.2 mm的淺凹。正畸矯治力施加在左上頜，在大鼠上頜左側(cè)第一磨牙與上切牙之間安置直徑為8 mm的彈簧，彈簧兩端用細(xì)結(jié)扎絲進(jìn)行固定，利用測力器施加100 g的矯治力[9]，使磨牙向近中方向移動，并對結(jié)扎絲末端進(jìn)行調(diào)整，避免牙齦受到不良刺激。在施加矯治力的過程中注意避免損傷周圍軟組織，手術(shù)過程須精細(xì)謹(jǐn)慎，并對動物做好適當(dāng)保暖工作，保持大鼠呼吸道暢通，切忌過量注射麻醉劑，以免造成實(shí)驗(yàn)動物死亡。另外，實(shí)驗(yàn)人員需每日檢查彈簧加力裝置，如發(fā)現(xiàn)裝置脫落或損壞須及時重新安裝，以保證矯治力持續(xù)作用。連續(xù)施加矯治力14 d后，小心拆除彈簧加力裝置。

1.2.3 注射尿源干細(xì)胞外泌體：以3 mL/kg的劑量給予大鼠腹腔注射濃度為10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉后拆除加力裝置，將其固定于特制的鼠板上，實(shí)驗(yàn)組大鼠于左側(cè)上頜第一磨牙近中根頰側(cè)黏膜轉(zhuǎn)折處，注射200 μL含100 μg(蛋白含量)尿源性干細(xì)胞外泌體(由西安齊岳生物公司提供)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，對照組大鼠則在相同位置注射200 μL PBS，兩組均每隔3 d注射1次，共注射5次[10]。

1.2.4 Micro-CT活體掃描：參照相關(guān)研究[11]改進(jìn)micro-CT活體掃描方法。于注射尿源干細(xì)胞外泌體前及注射5次后分別使用micro-CT活體掃描儀(Latheta公司，型號：LCT200)對大鼠左側(cè)加力牙齒周圍牙槽骨和上頜第一、二磨牙進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)設(shè)置為8 W、114 kVp，厚度設(shè)置為10 μm，視角直徑設(shè)置為38.9 mm，整合時間設(shè)置為0.35 s，每只大鼠單次掃描時間為40 min，掃描時注意盡量調(diào)整大鼠頭部使其腭平面與地面平行。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 牙根表面吸收陷窩體積測定：利用Mimics 10.0軟件，在micro-CT掃描得到的斷層處，采用三維凸包算法計(jì)算每只大鼠左側(cè)上頜第一磨牙的近中根分叉處至尖端的表面吸收陷窩體積[12]，測量3次取平均值。

1.3.2 骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)測定：根據(jù)micro-CT掃描圖像，在距離牙根表面200 μm處選取一700 μm×700 μm的區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)域[13-14]，利用計(jì)算機(jī)對感興趣區(qū)域?qū)嵤┤S重建，測定骨小梁相關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)、骨體積/組織體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)比值、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，測量3次取平均值。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測：采用蛋白免疫印跡法檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨保護(hù)素、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappaB ligand，RANKL)的表達(dá)水平。采用RIPA裂解液(Regal公司，生產(chǎn)批號：SJH0995)提取總蛋白后，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流220 mA轉(zhuǎn)膜1 h，分子量40～60 kd恒流280 mA轉(zhuǎn)膜1 h；取下膜后用PBS洗滌4次，5 min/次；將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中37℃封閉1 h；用PBS稀釋一抗(1 ∶1 000)，膜在一抗稀釋液中4℃過夜封閉；次日將膜取出后用PBS洗滌4次，5 min/次；用含5%脫脂奶粉的封閉液稀釋二抗(1 ∶2 000)，膜在二抗中37℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中用PBS洗滌4次，5 min/次；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，利用電化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光。采用Image J軟件檢測灰度值，以蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值作為所測蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)注射前后比較采用配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具體統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組牙根表面吸收陷窩體積的比較 注射尿源性干細(xì)胞外泌體前，兩組大鼠的牙根表面吸收陷窩體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。注射尿源性干細(xì)胞外泌體后，兩組大鼠牙根表面吸收陷窩體積均較注射前減小，且實(shí)驗(yàn)組體積低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組牙根表面吸收陷窩體積的比較(x±s，×107 μm3)

2.2 兩組骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較 注射尿源性干細(xì)胞外泌體前，兩組大鼠的Tb.N、Tb.Sp、BV/TV比值、Tb.Th比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。注射尿源性干細(xì)胞外泌體后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的BV/TV、Tb.Th高于注射前水平及對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較(x±s)

組別nBV/TV比值注射前注射后t值P值Tb.Th(mm)注射前注射后t值P值對照組50.47±0.130.69±0.152.478 0.0380.10±0.020.13±0.051.246 0.248實(shí)驗(yàn)組50.43±0.090.89±0.088.542<0.0010.09±0.010.22±0.039.192<0.001 t值0.5662.6311.0003.451P值0.5870.0300.3470.009

2.3 兩組BMP-2、BSP、骨保護(hù)素、RANKL相對表達(dá)水平的比較 實(shí)驗(yàn)組的BMP-2、BSP表達(dá)水平均高于對照組(均P<0.05)，兩組的骨保護(hù)素、RANKL表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3和圖1。

表3 兩組BMP-2、BSP、骨保護(hù)素、RANKL相對表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 兩組BMP-2、BSP、骨保護(hù)素、RANKL表達(dá)水平

3 討 論

導(dǎo)致牙根吸收的原因主要分為患者自身因素和治療相關(guān)因素，其中患者自身相關(guān)因素主要包括年齡、牙周狀態(tài)、牙齒形態(tài)、牙齒結(jié)構(gòu)等，而治療相關(guān)因素主要包括矯治技術(shù)及其過程中矯治力的大小、矯治時間、牙移動方式以及拔牙與否等[15]。牙根吸收作為正畸治療的主要并發(fā)癥之一，其主要危害在于降低冠根比而破壞矯治效果，并影響患者口頜功能，造成面目美觀感缺陷，因此正畸治療醫(yī)師和患者均面臨較大的考驗(yàn)[16]。移動性牙根吸收可分為3個等級：表層吸收(牙骨質(zhì)表面吸收和改建)，即吸收僅發(fā)生在牙骨質(zhì)表面，能夠快速進(jìn)行改建和再生；深層吸收(牙本質(zhì)吸收)，即吸收深度已到達(dá)牙本質(zhì)淺層，僅針對吸收陷窩進(jìn)行牙骨質(zhì)樣物質(zhì)修復(fù)，該修復(fù)過程無法使牙根狀態(tài)恢復(fù)正常；根尖吸收，根尖吸收后會引起牙根長度縮短，且無法進(jìn)行修復(fù)[17]。有專家指出牙根吸收可見于大多數(shù)正畸患者，并且吸收程度較弱，僅涉及表層吸收，因此可自身完成修復(fù)[18]。本研究結(jié)果顯示，注射尿源性干細(xì)胞外泌體后，實(shí)驗(yàn)組大鼠牙根表面吸收陷窩體積小于對照組，BV/TV、Tb.Th高于對照組(P<0.05)。說明通過局部注射干細(xì)胞可以促進(jìn)移動性牙根吸收的修復(fù)。

BMP-2是BMP家族成員之一，具有極強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，能夠促進(jìn)牙槽骨細(xì)胞增殖再生；BSP是由成骨樣細(xì)胞分泌的糖蛋白之一，具有促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的功能；骨保護(hù)素和RANKL是破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡并抑制其分化[19]。BMP-2、BSP的表達(dá)上調(diào)能夠發(fā)揮成牙骨質(zhì)效應(yīng)，促進(jìn)牙骨質(zhì)、牙槽骨增生，與BMP-2在牙根發(fā)育過程中發(fā)揮的作用類似。BSP作為成骨分化成熟的重要標(biāo)志物之一，在牙周修復(fù)中的新生牙槽骨和牙骨質(zhì)中均有表達(dá)，與BMP的表達(dá)水平一致[20]。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子 β超家族的重要成員，具有誘導(dǎo)軟骨內(nèi)成骨、胚胎發(fā)育、骨骼生長重建及再生等作用，其中BMP-2是最主要的功能蛋白之一。目前研究表明，BMP-2能夠誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2、堿性磷酸酶、骨鈣素和BSP等相關(guān)基因，促進(jìn)成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞向分化，從而引起牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生[21]；與其他轉(zhuǎn)化生長因子一樣，BMP-2能夠誘導(dǎo) Smad 信號傳導(dǎo)通路等激活和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，而這些信號傳導(dǎo)完全不同于 Wnt/β-肌動蛋白信號通路，但可能與其協(xié)同促進(jìn)成骨/成牙骨質(zhì)形成[22]。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)，BMP-2 能夠通過刺激低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5 的表達(dá)來抑制 β-肌動蛋白的磷酸化，促進(jìn) β-肌動蛋白在前成骨細(xì)胞/成骨細(xì)胞中積累，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，β-肌動蛋白的缺失導(dǎo)致 BMP-2 介導(dǎo)的成骨效應(yīng)減弱。本研究結(jié)果還顯示，實(shí)驗(yàn)組的BMP-2、BSP表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，兩組的骨保護(hù)素、RANKL表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示尿源干細(xì)胞外泌體可促進(jìn)移動性牙根吸收的修復(fù)，促進(jìn)牙骨質(zhì)再生，并且不會導(dǎo)致破骨細(xì)胞過度凋亡，但關(guān)于尿源干細(xì)胞外泌體可能促進(jìn)移動性牙根吸收修復(fù)的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，尿源性干細(xì)胞外泌體可促進(jìn)移動性牙根吸收的修復(fù)，有效改善牙槽骨密度，并上調(diào)磨牙及其周圍牙槽骨組織中BMP-2、BSP表達(dá)水平上調(diào)，從而誘導(dǎo)牙周細(xì)胞的增殖分化。