RP-HPLC混標(biāo)加樣增量法快速測(cè)定食品中的阿斯巴甜和阿力甜

高向陽(yáng)，張 芳

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，鄭州市食品安全快速檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450064）

阿斯巴甜即天門冬酰苯丙氨酸甲酯，是一種天然功能性低聚糖，甜度是蔗糖的200 倍。在pH 3～5的溶液中穩(wěn)定，高pH值或高溫下會(huì)水解而導(dǎo)致甜味喪失[1-3]。阿力甜又稱為天胺甜精，甜度為蔗糖的2 000 倍以上，極易溶于水或溶于含羥基的溶劑中。室溫下，阿力甜在pH 4的條件下能穩(wěn)定2 a，在pH 5～8的水溶液中能穩(wěn)定 4 a以上[4-5]。阿斯巴甜和阿力甜復(fù)合使用可以協(xié)同增效、降低成本、改善口感、提高甜味的穩(wěn)定性，不但甜度高、味質(zhì)好，且儲(chǔ)存期長(zhǎng)、無(wú)熱量，是常用的食品甜味劑。但若使用過(guò)量可能會(huì)出現(xiàn)人體肝臟被破壞、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、致癌等不良影響[6-10]。

目前，食品中測(cè)定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色譜法[11-18]、超高效液相色譜法[19]、反相高效液相色譜法[20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[24-26]、離子色譜法[27]等，而且常用外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法或歸一化法進(jìn)行定量分析。

外標(biāo)法需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液要分開(kāi)進(jìn)行測(cè)定，不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)、同步分析，容易受到儀器條件以及環(huán)境因素的影響。內(nèi)標(biāo)法需要先用標(biāo)準(zhǔn)液求得各待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)校正因子，代入相應(yīng)公式計(jì)算結(jié)果。對(duì)復(fù)雜樣品，有時(shí)很難找到合適的內(nèi)標(biāo)物，也無(wú)法確定樣品中是否不含所用的內(nèi)標(biāo)物，很難及時(shí)開(kāi)展工作。歸一化法要求樣品中所有組分全部出峰、并產(chǎn)生測(cè)定信號(hào)，樣品中各組分的相對(duì)含量之和應(yīng)為100%。要求知道各組分的校正因子，操作較為繁瑣。這些測(cè)定方法操作繁雜，需測(cè)定空白溶液、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行復(fù)雜計(jì)算，工作效率較低。

混標(biāo)加樣增量法是一種新型分析技術(shù)，克服了上述分析方法的不足，只需取2 份完全相同的阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入不同體積的試液，混勻后在同一條件下進(jìn)行測(cè)定。以同一保留時(shí)間下組分色譜峰信號(hào)是否有增加進(jìn)行定性分析，以混合標(biāo)準(zhǔn)液加樣后色譜峰信號(hào)值代入公式進(jìn)行定量分析，無(wú)需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定空白溶液，具有成本低、工作效率高、測(cè)定速度快、干擾少、準(zhǔn)確度高、適用范圍廣等突出優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可口可樂(lè)、菊花晶、酸奶、濃縮果汁、巧克力制品 市售。

甲醇（色譜純）、乙醇（優(yōu)級(jí)純）、阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品（C14H25N3O4S，CAS號(hào)：80863-62-3，純度為99.2%） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品（C14H18N2O5，CAS號(hào)：22839-47-0，純度為95%） BePune實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A100250多管渦旋混合儀 月旭科技股份有限公司； MS150/MS205DU電子天平（十萬(wàn)分之一） 長(zhǎng)沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司；Dynamica V18R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限 公司；Utimate3000(2017LH131)高效液相色譜儀、Hypersil GOLD C18色譜柱（150 mm×4.6 mm） 美國(guó)賽默飛科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)混合液的制備

乙醇溶液：取40 mL乙醇，與20 mL水均勻混合；80%甲醇溶液：取80 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中；50%甲醇溶液：取50 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

阿斯巴甜和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制（0.50 mg/mL）： 稱取阿斯巴甜0.026 32 g（精確至0.000 1 g），稱取阿力甜0.025 20 g（精確至0.000 1 g），用水將阿斯巴甜和阿力甜分別溶解至50 mL容量瓶?jī)?nèi)并定容至刻度，置于4 ℃左右的冰箱中保存，有效期為90 d。

1.3.2 試液的制備和測(cè)定

阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)工作液系列的配制：將阿斯巴甜和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋，并將2 種標(biāo)準(zhǔn)溶液等濃度等體積混合。分別制得50.00、45.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃左右冰箱保存，有效期為30 d。

1.3.2.1 碳酸飲料、固體飲料樣品處理

稱取約5.000 0 g（精確到0.001 g）碳酸飲料試樣于50 mL燒杯中，超聲振蕩除去二氧化碳，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用水定容，備用。

稱取約1.000 0 g（精確到0.001 g）固體飲料試樣于50 mL燒杯中，加10 mL水，超聲振蕩提取20 min，移入25 mL容量瓶中；再向燒杯中加入10 mL水超聲振蕩提取10 min，將2 次提取液移入同一個(gè)25 mL的容量瓶中，用水定容，備用。

將上述容量瓶的液體分別4 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm的水系濾膜過(guò)濾后得待測(cè)試液，用于液相色譜分析。

1.3.2.2 酸奶、乳飲料樣品處理

稱取5.000 0 g（精確到0.001 g）酸奶試樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇，沉淀酸奶試樣中的蛋白質(zhì)，蓋緊蓋子；上下輕輕顛倒離心管5 次（不能振搖），將離心管混勻渦旋10 s后，靜置1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液濾入25 mL容量瓶中，濾渣用8 mL乙醇溶液洗滌后再離心，離心后的上清液移入同一個(gè)容量瓶，用乙醇溶液定容至25 mL，混勻，用0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后得待測(cè)試液，用于液相色譜分析。

1.3.3 色譜分析

取2 份完全相同的混合標(biāo)準(zhǔn)液于離心管A和B中，離心管A中加入體積為VA的待測(cè)試液，離心管B中加入體積為VB的待測(cè)試液，其中VB＞VA；在同一色譜條件下，對(duì)離心管A中混合液進(jìn)行色譜分析，得出阿斯巴甜保留時(shí)間tA1及對(duì)應(yīng)的出峰信號(hào)hA1，阿力甜保留時(shí)間tA2及對(duì)應(yīng)的出峰信號(hào)hA2；對(duì)離心管B中混合液進(jìn)行色譜分析得出阿斯巴甜的保留時(shí)間tB1及對(duì)應(yīng)的出峰信號(hào)hB1，阿力甜的保留時(shí)間tB2及對(duì)應(yīng)的出峰信號(hào)hB2。當(dāng)tA1＝tB1，hB1-hA1＞0，則待測(cè)食品中含有阿斯巴甜；當(dāng)tA2＝tB2，hB2-hA2＞0，則待測(cè)食品中含有阿力甜。

1.3.4 測(cè)定原理和公式

在一定條件下測(cè)定時(shí)，測(cè)定信號(hào)與待測(cè)組分的量呈正比，因此有：

在完全相同的條件下測(cè)定時(shí)，比例常數(shù)k相同， 式（1）除以式（2）有：

式中：ρ 為試液中阿斯巴甜或阿力甜的質(zhì)量濃 度/（μg/μL）；ms為混合標(biāo)準(zhǔn)液中阿斯巴甜或阿力甜的質(zhì)量/μg；VA為離心管A中加入試液的體積/μL；VB為離心管B中加入試液的體積/μL；mA和mB分別為試液加入A管和B管中的組分質(zhì)量/μg；V樣為總的試液體積/μL； m樣為總樣品質(zhì)量/g；m為總樣品中阿斯巴甜或阿力甜的質(zhì)量/μg；hA、hB分別為A、B離心管中阿斯巴甜或阿力甜測(cè)得峰高信號(hào)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件的選擇

2.1.1 色譜流動(dòng)相的選擇

用不同比例梯度的甲醇和水作為流動(dòng)相，阿斯巴甜和阿力甜能很好得到分離，最佳流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60，V/V），流速為0.8 mL/min。

2.1.2 波長(zhǎng)的選擇

基于阿斯巴甜和阿力甜在紫外光區(qū)的檢測(cè)靈敏度，選擇200 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，確定阿斯巴甜和阿力甜的保留時(shí)間如圖1所示，結(jié)果表明，阿斯巴甜與阿力甜出峰較好。

圖1 阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間色譜圖Fig. 1 Chromatograms showing retention times of mixed standard solution of aspartame and alitame

2.2 加樣增量法色譜圖比較分析

圖2 阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液加不同量可口可樂(lè)色譜圖Fig. 2 Chromatograms of in aspartame and alitame in Coca-Cola added with different amounts of mixed standard solution

取2 個(gè)相同的離心管A、B，各加10 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，再向離心管A中加入100 μL可口可樂(lè)待測(cè)試液，向離心管B中加入200 μL可口可樂(lè)待測(cè)試液，均定容至1.00 mL，混勻后進(jìn)行色譜分析。由圖2 可知，阿斯巴甜和阿力甜在各自保留時(shí)間下，加入不同體積的可口可樂(lè)試液后，各自的峰高均有增加，保留時(shí)間允許的誤差范圍內(nèi)tA1＝tB1，hB1-hA1＞0，則可口可樂(lè)中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2＞0，則可口可樂(lè)中含有阿力甜，以此進(jìn)行定性分析。

由圖2A可得，阿斯巴甜保留時(shí)間tA1為3.643 min，峰高h(yuǎn)A1為10.188 mAU，阿力甜保留時(shí)間tA2為6.527 min，峰高h(yuǎn)A2為6.260 mAU；如圖2B所示：阿斯巴甜保留時(shí)間tB1為3.633 min，峰高h(yuǎn)B1為11.464 mAU，阿力甜保留時(shí)間tB2為6.520 min，峰高h(yuǎn)B2為7.163 mAU。根據(jù)色譜圖的峰高，依據(jù)式（3）、（4）可對(duì)樣品中的組分進(jìn)行定量分析。

表1 樣品的測(cè)定結(jié)果Table 1 Results obtained from determination of aspartame and alitame in real samples

2.3 加樣增量法測(cè)定結(jié)果及精密度

由表1可知，5 種試樣測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%。由色譜峰高值，可簡(jiǎn)便、快速計(jì)算出食品中待測(cè)組分的含量，也可用峰面積數(shù)據(jù)代入相應(yīng)公式計(jì)算。

2.4 樣品的檢出限和定量限結(jié)果

表2 樣品的檢出限和定量限Table 2 Detection limits and quantitation limits for real samples

根據(jù)表1，按3 倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算檢出限，按10 倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算定量限，見(jiàn)表2。由GB 5009.263—2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定》的檢出限和定量限可知[28]，碳酸飲料、液態(tài)乳飲料中的阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為 1 mg/kg，定量限為3 mg/kg，巧克力制品、水果及其制品、固體飲料及其制品中的阿斯巴甜和阿力甜的檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg。該方法的檢出限和定量限均低于國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)中的檢出限和定量限。

2.5 加標(biāo)回收率結(jié)果

以酸奶測(cè)定加標(biāo)回收率，分別對(duì)樣品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收，每個(gè)水平做6 次平行測(cè)定，檢驗(yàn)無(wú)可疑值后，取峰高平均值計(jì)算，見(jiàn)表3。

表3 樣品的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries for spiked samples

由表3 可知， 酸奶中阿斯巴甜的回收率為90.5%～98.3%，阿力甜的回收率為93.2%～95.8%。由于各組分在色譜柱中得到了充分分離，互不干擾，尤其適用于多組分的色譜定性和定量分析，由各組分依次出現(xiàn)的色譜峰信號(hào)值，可快速計(jì)算各組分含量和回收率。

2.6 國(guó)標(biāo)法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.6.1 國(guó)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

按國(guó)標(biāo)法規(guī)定的波長(zhǎng)和色譜條件，以5 0.0 0、45.00、40.00、35.00、30.00、25.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.00 μg/mL和0.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液各進(jìn)樣5 μL測(cè)定，以組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出阿斯巴甜的回歸直線方程為Y＝4.692 1x-1.464 9，阿力甜的回歸直線方程為Y＝2.883 6x-1.194 4，相關(guān)系數(shù)r均為0.999 9。

2.6.2 國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果

表4 國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果Table 4 Comparison of results obtained from determination of aspartame and alitame in real samples by the proposed method and the national standard method

按國(guó)標(biāo)法操作步驟，各樣品均進(jìn)行6 次平行測(cè)定，檢驗(yàn)無(wú)可疑值后，取平均值報(bào)告，見(jiàn)表4。國(guó)標(biāo)法采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，阿斯巴甜和阿力甜含量最低的為酸奶，最高的為巧克力，RSD前者為0.7%～4.8%，后者為0.48 %～2.2%。

2.7 顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

表5 本實(shí)驗(yàn)方法與國(guó)標(biāo)法對(duì)照測(cè)定結(jié)果Table 5 Comparative statistical analysis of aspartame and alitame contents of yogurt determined by the proposed method and the national standard method

以酸奶為樣品，樣品前處理依據(jù)GB 5009.263—2016，用該法和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，各樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。由表5數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)[29]可知：F值＜F0.05＝5.05，表明混標(biāo)加樣增量法與國(guó)標(biāo)法之間不存在顯著的偶然誤差；t值＜t0.05＝2.23，表明混標(biāo)加樣增量法與國(guó)標(biāo)法間也不存在顯著的系統(tǒng)誤差，結(jié)論的置信度為95%。

3 結(jié) 論

方法所用標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)液和試劑量少，成本低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、無(wú)需測(cè)定空白和復(fù)雜計(jì)算，可快速獲得分析結(jié)果。實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)溶液和試液在同溶液背景、同體系、同方法、同儀器、同條件、同步操作下進(jìn)行同時(shí)定性、定量分析，準(zhǔn)確度得到保障和提升，有一定的創(chuàng)新性。由于各組分在色譜柱中得到了充分的分離，相互之間不干擾，尤其適用于色譜多組分的同時(shí)定性和定量分析。與國(guó)標(biāo)法對(duì)照，用于測(cè)定食品中的阿斯巴甜和阿力甜，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異。

該法不僅適用于液相色譜法，也適用于氣相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、毛細(xì)管電泳色譜法，以及化學(xué)發(fā)光、分子熒光、磷光分析法、生物發(fā)光分析法、原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、原子熒光光譜和紫外、可見(jiàn)分子吸收光譜等諸多分析技術(shù)。不僅適用于阿斯巴甜和阿力甜的測(cè)定，也適用于其他物質(zhì)諸多組分的測(cè)定。根據(jù)所用方法不同，測(cè)定信號(hào)可以是色譜峰峰高、色譜峰峰面積、相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度、吸光度等，可行性和推廣應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。