聯(lián)苯三唑醇磁性分子印跡聚合物的制備及其在食品檢測中的應(yīng)用

田景升，張展展，秦思楠，高文惠

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000）

聯(lián)苯三唑醇是一種常見的廣譜、高效、低毒、內(nèi)吸性三唑類殺菌劑[1]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。三唑類農(nóng)藥不僅可以通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使膜滲漏加劇，從而鏟除病原菌；而且可以緩解植物葉綠素分解、提高內(nèi)源脫落酸分解以達(dá)到治療植物的目的；更可通過種子內(nèi)吸進(jìn)入植株根系，長時(shí)間存留在種子區(qū)或根圍土壤中，進(jìn)而對植物起保護(hù)作用，它主要用于防治果樹黑星病、腐爛病、麥葉穿孔病等[2-6]。但是由于施藥不合理及超量使用，使三唑類農(nóng)藥在食品中殘留甚至超標(biāo)，進(jìn)而對人體健康產(chǎn)生危害，造成較為嚴(yán)重的食品安全問題[7]，因此建立相關(guān)的檢測方法具有重要意義。目前針對三唑類農(nóng)藥的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-10]、氣相色譜法[11]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[12-17]等。近年來，采用分子印跡技術(shù)制備聯(lián)苯三唑醇印跡聚合物對樣品進(jìn)行前處理已有報(bào)道[18-20]，但對其磁性分子印跡聚合物（magnetic molecularly imprinted polymer，MMIP）的研究鮮見報(bào)道。

圖1 聯(lián)苯三唑醇的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of bitertanol

磁性聚合物微球是近些年來分子印跡技術(shù)重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一，磁性聚合物微球可以在外磁場的作用下迅速與溶液分離，無需離心或者過濾即可達(dá)到主動(dòng)識(shí)別和分離[21-23]；與此同時(shí)，由于增大了聚合物微球的比表面積，使得聚合物的網(wǎng)絡(luò)中存在很多印跡空穴，所以該材料具有高度的識(shí)別選擇性[24-26]；目前磁性聚合物微球已在物質(zhì)的提取與分離[27]、特異性識(shí)別[28-29]、食品安全檢測[30]等 方面得到應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以Fe3O4作為磁核，通過包覆SiO2并在其表面接枝硅烷偶聯(lián)劑KH570（甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷）得到磁性載體，然后采用表面印跡法，以聯(lián)苯三唑醇為模板分子，制備具有核-殼結(jié)構(gòu)的MMIP?？疾煲译嬗昧?、聚合溫度及充氮?dú)鈺r(shí)間等條件對印跡聚合物印跡效果的影響。以MMIP為固相萃取材料富集和凈化樣品，并結(jié)合HPLC對食品樣品中三唑類農(nóng)藥進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米、小麥、白菜、梨、蘋果均為市售。

聯(lián)苯三唑醇（純度99%） 江蘇常州市武進(jìn)振華化工廠；FeCl2·4H2O（純度99.7%）、FeCl3·6H2O（純 度99%） 上海市寶山區(qū)合眾化工廠；硅酸四乙酯（純度99%）、硅烷偶聯(lián)劑（KH-570，純度97%） 籃西科技有限公司；α-甲基丙烯酸酯（methacrylic acid，MAA，分析純）、2,2’-二偶氮異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN，分析純） 常州暢通化工有限公司；二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethylene dimethacrylate，EDMA， 分析純） 四川海諾威科技有限公司；氨水、乙酸、乙腈、甲醇、無水乙醇、異丙醇（均為分析純） 成都欣正通化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-1260型HPLC儀 美國安捷倫科技有限公司； SHZ-82A型恒溫水浴振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-4型恒溫水浴鍋 上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司；DZF-6320型真空干燥箱 四川中浪科技有限公司；KH5200型超聲波清洗器 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SHB-3A 型循環(huán)水式真空泵 陜西太康生物科技有限公司；TENSOR37型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker 公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 磁核載體的制備及改性

1.3.1.1 共沉淀法制備Fe3O4

分別稱取4.72 g FeCl3·6H2O和1.72 g FeCl2·4H2O，放入250 mL的三口燒瓶中，然后向其加入80 mL水，在通入氮?dú)夂退囟葹?0 ℃的反應(yīng)條件下，逐滴加入10 mL 30%氨水溶液，800 r/min攪拌條件下，熟化30 min，再使用磁鐵將所得產(chǎn)物分離，然后使用除氧水將產(chǎn)物洗至中性，無水乙醇洗滌3 次后，于50 ℃真空干燥24 h，即得實(shí)驗(yàn)用Fe3O4。

1.3.1.2 SiO2包覆Fe3O4

稱取300 mg Fe3O4，置于250 mL三口瓶中，分別加入4 mL水和50 mL異丙醇，超聲混勻20 min，800 r/min連續(xù)攪拌條件下，加入5 mL 30%氨水，再將2 mL硅酸四乙酯逐滴加入，在室溫條件下反應(yīng)12 h，然后用磁鐵將產(chǎn)物分離，用水將產(chǎn)物洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌3 次，隨后在50 ℃真空干燥24 h，得到實(shí)驗(yàn)用Fe3O4@SiO2。

1.3.1.3 Fe3O4@SiO2接枝KH570

稱取200 mg Fe3O4@SiO2，置于250 mL三口瓶中，加入50 mL甲醇，超聲混勻。550 r/min連續(xù)攪拌條件下，逐滴加入3 mL KH570，在室溫條件下反應(yīng)24 h，用磁鐵將產(chǎn)物分離后，用無水乙醇和水交替洗滌產(chǎn)物數(shù)次，并在50 ℃真空干燥24 h，得到實(shí)驗(yàn)用Fe3O4@SiO2-KH570。

1.3.2 MMIP的制備

取0.2 mmol聯(lián)苯三唑醇和0.8 mmol MAA溶于乙腈中，超聲振蕩30 min，放入冰箱內(nèi)預(yù)聚合6 h，使MAA與聯(lián)苯三唑醇充分作用，隨后加入100 mg Fe3O4@SiO2-KH570、1.5 mL EDMA和40 mg AIBN，對其進(jìn)行超聲脫氣，充氮?dú)?0 min使其內(nèi)部無氧，密封后150 r/min恒溫振蕩24 h；并用甲醇-乙酸（9∶1，V/V）對磁分離得到的聚合物產(chǎn)物進(jìn)行洗滌，以去除模板分子和未反應(yīng)的功能單體、交聯(lián)劑等，再用甲醇洗滌去除乙酸。60 ℃真空干燥（0.04 MPa）至質(zhì)量恒定后得到MMIP，放入干燥器內(nèi)。在不加聯(lián)苯三唑醇的條件下，按上述制備過程制得磁性非分子印跡聚合物（magneticnon-imprinted polymer，MNIP）。

1.3.3 不同聚合物吸附性能

在具塞玻璃管中分別放入適量按不同乙腈用量（15、30、50、70 mL）、不同充氮?dú)鈺r(shí)間（5、10、15、20 min）、不同聚合溫度（50、60、70 ℃）條件下制備的MMIP及MNIP，再分別加入5 mL 0.1 mmol/L聯(lián)苯三唑醇-乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，25 ℃恒溫振蕩24 h，10 000 r/min 離心5 min，靜置，取上清液。采用HPLC對聚合物吸附平衡后的濃度進(jìn)行測定，聚合物對目標(biāo)物的吸附量用溶液濃度的差值進(jìn)行計(jì)算，平行測定3 次后取其平均值，吸附量計(jì)算如式（1）所示。用印跡因子（imprinting factor，IF）評價(jià)印跡效果，計(jì)算如式（2）所示：

式中：Q為吸附量/（μmol/g）；C為聯(lián)苯三唑醇的初始濃度/（μmol/L）；Ce為聯(lián)苯三唑醇的平衡 濃度/（μmol/L）；V為吸附溶液的體積/mL；m為聚合物的質(zhì)量/mg。

式中：QMIP為印跡聚合物吸附聯(lián)苯三唑醇 的量/（μmol/g）；QNIP為非印跡聚合物吸附聯(lián)苯三唑醇的量/（μmol/g）。

1.3.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

在具塞玻璃管中分別放入適量的MMIP及MNIP，并分別加入5 mL濃度為0～5 μmol/L聯(lián)苯三唑醇-乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，25 ℃恒溫振蕩24 h后，用HPLC檢測聯(lián)苯三唑醇的濃度，并計(jì)算平行測定3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，聚合物對目標(biāo)物的吸附量用溶液濃度的差值計(jì)算，以初始溶液濃度C0為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)作圖，并對其進(jìn)行Scatchard分析[31]。

1.3.5 MMIP產(chǎn)率的測定

根據(jù)制備過程和需要對聚合物進(jìn)行稱量，獲得以下質(zhì)量數(shù)據(jù)以計(jì)算聚合物產(chǎn)率：1）稱取干燥的圓底燒瓶（100 mL）質(zhì)量m1。2）稱取加入了反應(yīng)液（模板分子＋ MAA＋乙腈）的燒瓶質(zhì)量m2。3）向已在冰箱中放置過夜的裝有反應(yīng)液的燒瓶中加入EDMA、磁性微球后，稱量反應(yīng)體系的質(zhì)量m3。4）加入AIBN，超聲除氧氣，60 ℃水浴反應(yīng)24 h，此過程宜避光進(jìn)行。5）待反應(yīng)完成后，自然放置至室溫，稱量其質(zhì)量m4。6）將反應(yīng)體系中的固體聚合物與液體分離開，待其自然晾干后，稱量裝有聚合物的燒瓶質(zhì)量m5。7）向上述裝有聚合物的燒瓶中加入適量的乙腈，浸洗2 次后，待其自然晾干，稱量裝有聚合物的燒瓶質(zhì)量m6。8）用甲醇-乙酸（9∶1，V/V）對聚合物進(jìn)行超聲，使其分散，然后洗脫去除模板分子，再用甲醇洗去殘留在聚合物中的乙酸，最后在真空干燥箱內(nèi)（60 ℃、0.04 MPa）進(jìn)行干燥。稱量裝有聚合物的燒瓶質(zhì)量m7（本實(shí)驗(yàn)采用的計(jì)算方法中聚合物的質(zhì)量不包括模板分子的質(zhì)量，因此需要洗脫掉聚合物中的模板分子再對其進(jìn)行稱量），聚合物產(chǎn)率計(jì)算 如式（3）所示：

1.3.6 聚合物的表征

1.3.6.1 傅里葉變換紅外光譜的測定

表征樣品與溴化鉀混合后進(jìn)行研磨、壓制，于400～4 000 cm-1范圍內(nèi)對Fe3O4、Fe3O4@SiO2、MMIP和MNIP進(jìn)行掃描，得到所對應(yīng)的紅外光譜，掃描扣除CO2干擾。

1.3.6.2 透射電子顯微鏡的測定

將少量Fe3O4、MMIP放入離心管中，用無水乙醇對其溶解，超聲使其分散均勻，分散后取一小滴放到銅網(wǎng)上，用紅外燈照射使其干燥，然后用透射電子顯微鏡進(jìn)行測定。

1.3.6.3 磁響應(yīng)性能的測定

稱取少量MMIP置于10 mL離心管中，加入5 mL乙腈溶液，超聲10 min混合均勻。在離心管側(cè)面放置磁鐵，并連續(xù)拍照，記錄聚合物的磁分離過程。

1.3.7 樣品測定

1.3.7.1 樣品的預(yù)處理

分別稱取樣品（小米、小麥、白菜、梨、蘋果等）10.000 g，磨碎或切碎，果蔬樣品中加入無水硫酸鈉5.000 g，除去過多的水分（谷物中不加），用20 mL 乙腈溶解，進(jìn)行提取（分2 次，每次10 mL），攪勻，超聲20 min，1 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL經(jīng)MMIP萃取，用20 mL水淋洗，再用10 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）洗脫，收集洗脫液進(jìn)行檢測[32]。

1.3.7.2 MMIP對模板分子的磁萃取分離與測定

稱量10 mg MMIP置于10 mL具塞三角瓶中，加入5.00 mL試樣液，室溫條件下，150 r/min振蕩5 h，磁分離收集平衡液。然后用2 mL乙腈分2 次洗去聚合物微球表面非特異性吸附的干擾物質(zhì)，磁分離棄去洗滌液。再用2 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）分2 次將吸附在磁性聚合物上的目標(biāo)化合物洗脫下來，磁分離收集洗脫液。然后，對洗脫液進(jìn)行蒸發(fā)、干燥，用1.00 mL甲醇對其進(jìn)行復(fù)溶，用0.45 μm微孔濾膜過濾，待HPLC檢測。

1.3.7.3 HPLC測定條件

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

采用Origin 8.0和Excel 2007對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測量3 次，數(shù)據(jù)均為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合條件對聚合物吸附性能的影響

表1 聚合條件對聚合物吸附性能的影響Table 1 Effect of different polymerization conditions on the adsorption properties of polymers

固定聯(lián)苯三唑醇、功能單體和交聯(lián)劑的條件不變，通過考察乙腈用量、充氮?dú)鈺r(shí)間、聚合溫度研究其對聚合物吸附性的影響。從表1可見，乙腈50 mL、充氮?dú)?5 min、聚合溫度60 ℃時(shí)吸附量大且印跡效果好。因?yàn)?，?dāng)乙腈用量為15 mL時(shí)，聚合反應(yīng)與本體聚合效果相當(dāng)，即生成的聚合物為塊狀；隨著乙腈用量的增加，乙腈不僅起到溶解作用，而且也有致孔作用，導(dǎo)致聚合物會(huì)更加松散，當(dāng)乙腈用量為50 mL時(shí)能形成較多聚合物，但當(dāng)乙腈用量增加到70 mL時(shí)，聚合物不易形成，因此，實(shí)驗(yàn)選擇50 mL為最佳乙腈用量。實(shí)驗(yàn)研究了充氮?dú)鈺r(shí)間，當(dāng)沖入氮?dú)? min時(shí)，產(chǎn)生的聚合物很少，這是由于充入的氮?dú)饬可俨荒軐⒀鯕馔耆s出；充氮?dú)?0 min時(shí)產(chǎn)生的聚合物明顯少于充氮?dú)?5 min，這是因?yàn)槌錃鈺r(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致致孔劑揮發(fā)；而充氮?dú)?0 min時(shí)生成聚合物所需時(shí)間過長，只有在充氮?dú)?5 min條件下，反應(yīng)8 h左右聚合物基本全部生成。實(shí)驗(yàn)還研究了聚合溫度對聚合物的影響，隨著溫度的升高，聚合速率加快，70 ℃時(shí)，在6 h能生成大量的MMIP；60 ℃時(shí)，8 h左右出現(xiàn)大量MMIP；50 ℃時(shí)，反應(yīng)24 h以后，能夠生成較多的MMIP；實(shí)驗(yàn)還嘗試在45 ℃聚合，反應(yīng)48 h以后，反應(yīng)液仍為澄清，無聚合物生成。結(jié)果表明，聚合溫度過高（如70 ℃）時(shí)，體系容易發(fā)生爆聚，導(dǎo)致聚合物結(jié)構(gòu)不均一；而低溫制備的聚合物其分子識(shí)別性好，但是如果溫度過低，就不能達(dá)到引發(fā)劑AIBN進(jìn)行熱分解的溫度，不能發(fā)生聚合反應(yīng)，因此實(shí)驗(yàn)中選用60 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 聚合物的吸附性能

2.2.1 靜態(tài)吸附等溫線

圖2 MMIP和MNIP對聯(lián)苯三唑醇的靜態(tài)吸附等溫線Fig. 2 Static adsorption isotherms of MMIP and MNIP toward bitertanol

以初始質(zhì)量濃度C0為橫坐標(biāo)、吸附量Q為縱坐標(biāo)作圖，得到MMIP和MNIP的靜態(tài)吸附等溫線，如圖2所示?？梢钥闯?，MMIP比MNIP對模板分子有更好的吸附性能，在相同的濃度下，MMIP的吸附量遠(yuǎn)大于MNIP，這是由于在MMIP的合成過程中其內(nèi)部形成的空間結(jié)構(gòu)能夠與模板分子吻合，形成印跡空穴，它可以“記住”模板分子，可以特異吸附模板分子。而MNIP中不存在模板分子，也不能形成印跡空穴，因此MNIP對模板分子無特異吸附性。

2.2.2 Scatchard分析

使用Scatchard模型對聚合物的吸附性能進(jìn)行評價(jià)，如式（4）所示：

式中：Qmax為結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀量/（μmol/g）；Q為MMIP吸附模板分子的量/（μmol/g）；C0為模板分子的初始質(zhì)量濃度/（μmol/L）；Kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 HaploView 4.2軟件進(jìn)行SNPs的 Hardy-Weinberg平衡、連鎖不平衡水平(LD)分析。SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析入組人群與其他地區(qū)人群的差異，χ2檢驗(yàn)分析基因型及等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

以Q為橫坐標(biāo)，Q/C0為縱坐標(biāo)繪制Scatchard曲線，如圖3所示。

圖3 MIP吸附性的Scatchard曲線Fig. 3 Scatchard curve of MIP adsorption

圖3 表明，Q/C0與Q不存在單一的線性關(guān)系，表示MMIP中的結(jié)合位點(diǎn)不是等價(jià)的，說明MMIP吸附目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，作用位點(diǎn)非均一，其具有2 類結(jié)合位點(diǎn)，分別為特定孔穴引起的高結(jié)合位點(diǎn)和一些非共價(jià)鍵引起的低結(jié)合位點(diǎn)，每種結(jié)合形式有獨(dú)特的作用性質(zhì)。由圖3可看到2 條直線，故可推斷它們之間有2 種結(jié)合位點(diǎn)，說明聯(lián)苯三唑醇與MAA在形成聚合物時(shí)有2 種結(jié)合形式，并且在洗脫模板分子后形成2 種結(jié)合性質(zhì)不同的結(jié)合位點(diǎn)。通過作圖擬合，得到2 個(gè)線性方程：第1類吸附位點(diǎn)的方程為y＝62.051-0.337x，Kd1＝2.97 μmol/L，Qmax1＝ 184.29 μmol/g；第2類吸附位點(diǎn)的方程為y＝0.070 7x＋26.089，Kd2＝14.14 μmol/L，Qmax2＝368.90 μmol/g。

2.3 聚合物產(chǎn)率分析

在固定其他反應(yīng)條件不變的前提下考察聚合物產(chǎn)率隨聚合時(shí)間的變化關(guān)系，結(jié)果顯示當(dāng)聚合時(shí)間為24 h時(shí)，聚合物產(chǎn)率最高；當(dāng)聚合時(shí)間超過24 h后，聚合物產(chǎn)率增加幅度趨于平穩(wěn)，因此確定最佳聚合時(shí)間為24 h。在此條件下改變引發(fā)劑使用量考察引發(fā)劑用量對聚合物產(chǎn)率的影響。結(jié)果表明，隨著引發(fā)劑用量的增加，功能單體和交聯(lián)劑聚合的愈發(fā)充分，聚合物產(chǎn)率逐漸增加；當(dāng)引發(fā)劑用量超過40 mg時(shí)，聚合物產(chǎn)率增加的速度趨于平緩，這是因?yàn)榇藭r(shí)分散體系中可以利用的功能單體和交聯(lián)劑都消耗殆盡，化學(xué)反應(yīng)接近終點(diǎn)，無法形成更多的聚合物。綜上所述聚合時(shí)間為24 h且引發(fā)劑用量為40 mg時(shí)聚合物產(chǎn)率最高，最高產(chǎn)率為76.4%。

2.4 MMIP的表征

2.4.1 紅外光譜分析

由圖4a可見，572 cm-1為Fe—O的特征吸收峰，說明已制備了Fe3O4粒子。圖4b中1 097、952、563 cm-1處分別為Si—O—Si的反對稱伸縮振動(dòng)峰，Si—O—H的彎曲振動(dòng)吸收峰和Fe—O的特征峰，794 cm-1和468 cm-1處分別為Si—O的伸縮和彎曲振動(dòng)峰，這些特征峰的增加說明SiO2已成功包裹在Fe3O4粒子上。圖4c為MMIP的紅外譜圖，3 440、1 094、948、578 cm-1處分別為硅膠表面的O—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰、Si—O—Si反對稱伸縮振動(dòng)峰、Si—O—H的彎曲振動(dòng)吸收峰和Fe—O的特征峰，803 cm-1和463 cm-1處分別為Si—O的伸縮和彎曲振動(dòng)峰，除此之外，2 990、1 736 cm-1處為飽和C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰和C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 631 cm-1處對應(yīng)的C＝C伸縮振動(dòng)吸收峰很小，說明交聯(lián)劑與功能單體大部分進(jìn)行了交聯(lián)聚合反應(yīng)，這些特征峰的增加說明在包裹了SiO2的Fe3O4表面有聚合物生成。圖4d為MNIP的紅外譜圖，它的吸收峰位置與圖4c的吸收峰位置基本一致，但1 736 cm-1處C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰相對于1 093 cm-1處Si—O—Si反對稱伸縮振動(dòng)峰，相對峰值明顯減小，說明在磁性微球表面發(fā)生聚合的MNIP較少。結(jié)果表明，功能單體MAA與模板分子聯(lián)苯三唑醇在磁性微球表面預(yù)聚合形成復(fù)合物時(shí)有利于聚合物的聚合。MNIP的吸收峰位置與MMIP基本一致，證明MMIP與MNIP 2 種交聯(lián)共聚物骨架結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成相同。結(jié)果表明，在包覆SiO2的磁性Fe3O4載體表面有印跡聚合反應(yīng)發(fā)生。

圖4 Fe3O4（a）、Fe3O4@SiO2（b）、MMIP（c）和 MNIP（d）的紅外光譜圖Fig. 4 IR spectra of Fe3O4 (a), Fe3O4@SiO2 (b), MMIP (c) and MNIP (d)

由聯(lián)苯三唑醇的分子結(jié)構(gòu)分析可知，聯(lián)苯三唑醇分子中含有三唑環(huán)，存在著帶有孤對電子的N原子，電負(fù)性較大，可與羧基中的H形成氫鍵；聯(lián)苯三唑醇分子中還含有羥基，可與MAA中羰基上的O形成氫鍵；此外聯(lián)苯三唑醇分子還顯示一定的堿性，可以和功能單體MAA的羧基產(chǎn)生離子作用；由此可推測印跡分子聯(lián)苯三唑醇與功能單體MAA的作用形式，如圖5所示。

圖5 聯(lián)苯三唑醇與功能單體作用形式Fig. 5 Action form between bitertanol and functional monomer

2.4.2 透射電子顯微鏡分析

通過透射電子顯微鏡表征Fe3O4和MMIP形貌，由圖6A可知，F(xiàn)e3O4為大小約10 nm的球形粒子，且有一定的團(tuán)聚，說明制備所得Fe3O4為納米級(jí)粒子。由圖6B可知，MMIP粒徑約為100 nm，其粒徑較Fe3O4粒子大很多，說明在Fe3O4表面確實(shí)形成聚合物層。2.4.3 磁響應(yīng)性能分析

圖6 Fe3O4（A）和MMIP（B）的透射電子顯微鏡圖Fig. 6 Transmission electron micrographs of Fe3O4 (A) and MMIP (B)

為了考察印跡聚合物的磁響應(yīng)性能，將其溶于乙腈溶劑中，超聲使其均勻分散，并將其置于磁鐵的一側(cè)，每隔1 s拍照一次，記錄其在外加磁場下與溶液的分離過程，拍攝的照片如圖7A所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMIP在磁場作用下，能迅速聚集在與磁鐵右端接觸的管壁上，當(dāng)與磁鐵接觸10 s時(shí)MMIP即完全聚集在管壁上，溶液澄清。當(dāng)撤走外加磁場后，聚合物粒子很快會(huì)重新分散在乙腈溶劑中，得到穩(wěn)定的磁流體，如圖7B所示。結(jié)果表明，在乙腈溶劑中，MMIP具有良好的磁響應(yīng)和再分散性能。

圖7 在外磁場作用下印跡聚合物聚集過程（A）和 分散性能（B）的照片F(xiàn)ig. 7 Photographs showing the aggregation process of imprinted polymers (A) under external magnetic field and dispersion performance (B)

2.5 線性范圍與檢出限

實(shí)驗(yàn)將4 種三唑類農(nóng)藥儲(chǔ)備液（100 μg/mL）分別配制成不同質(zhì)量濃度（0.01～100 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)測定后，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。聯(lián)苯三唑醇線性范圍為0.06～100 μg/mL，三唑酮、戊唑醇和烯唑醇的線性范圍為0.03～100 μg/mL，線性關(guān)系好（r≥0.999 6），檢出限在0.01～0.02 μg/mL之間。

表2 4 種三唑類農(nóng)藥線性關(guān)系及檢出限Table 2 Linear relationships and detection limits for four triazole pesticides

2.6 聯(lián)苯三唑醇MMIP對樣品的凈化和吸附能力

以聯(lián)苯三唑醇MMIP作為固相萃取材料，樣品按1.3.7.1節(jié)方法處理，在1.3.7.3節(jié)HPLC測定條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所測的多種樣品中均未檢出上述4 種三唑類農(nóng)藥。代表性樣品的色譜分離圖見圖8、9。

圖8 分子印跡固相萃取小米樣品吸附凈化效果譜圖Fig. 8 Chromatograms of four triazole pesticide residues extracted from mille by molecularly imprinted solid phase extraction

圖9 分子印跡固相萃取梨樣品吸附凈化效果譜圖Fig. 9 Chromatograms of four triazole pesticide residues purified from pear fruit by molecularly imprinted solid phase extraction

由圖8a、b與圖9a、b可知，聚合物不能吸附雜質(zhì)，可以很好地凈化樣品。由圖8c和圖9c可知，磁性分子印跡萃取材料只能吸附模板分子和它的結(jié)構(gòu)類似物，這充分表明了它可以很好地分離和富集復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物質(zhì)。

2.7 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用本方法對小米、小麥、白菜、梨、蘋果等多種樣品在添加量為0.1 μg/mL和10 μg/mL條件下進(jìn)行測定，其結(jié)果見表3。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Table 3 Recovery and precision of the proposed method (n= 5)

由表3 可知， 4 種農(nóng)藥的平均回收率在87.7%～104.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.39%～3.46%（n＝5）。該檢測方法對三唑類農(nóng)藥的回收率高、精密度好。將實(shí)驗(yàn)制備的印跡傳感器與其他文獻(xiàn)方法檢測實(shí)際樣品進(jìn)行比較，如表4所示，該方法樣品前處理簡便，且檢出限更低。

表4 該方法與其他測定聯(lián)苯三唑醇的方法比較Table 4 Comparison of this method with other methods for the determination of bitertanol

3 結(jié) 論

以Fe3O4@SiO2為磁性載體，聯(lián)苯三唑醇為模板分子，通過表面印跡的方法，合成了具有核殼結(jié)構(gòu)的聚合物微球，并優(yōu)化了聚合工藝，當(dāng)致孔劑乙腈用量50 mL、聚合溫度60 ℃、充氮?dú)鈺r(shí)間15 min時(shí)IF最高，特異性吸附能力最好，且聚合物產(chǎn)率為76.4%。靜態(tài)吸附結(jié)果表明，MMIP有很好的吸附性；由Scatchard分析可知，聯(lián)苯三唑醇和MAA有2 種結(jié)合位點(diǎn)，Kd1＝2.97 μmol/L、Kd2＝14.14 μmol/L。通過紅外光譜、透射電子顯微鏡及磁響應(yīng)對聚合物進(jìn)行表征，結(jié)果表明，MMIP聚合成功印跡聚合物粒徑約為100 nm，且聚合物磁響應(yīng)性能和再分散性能較好。以最優(yōu)條件下制備的聚合物為固相萃取材料，對多種樣品進(jìn)行萃取凈化，并采用HPLC法進(jìn)行測定。結(jié)果為樣品加標(biāo)回收率為87.7%～104.3%，RSD為1.39%～3.46%（n＝5）。該方法簡單快速、選擇性強(qiáng)，有利于促進(jìn)樣品的快速前處理實(shí)現(xiàn)。