實時PCR檢測食品中熒光假單胞菌方法的建立

閔 可，張 政，周雨蕾，侯溫甫，王宏勛，周 敏

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種嗜冷菌，革蘭氏陰性菌，一種典型的條件致病菌[1]?？煞置邳S綠色熒光色素，產(chǎn)生耐熱的蛋白酶和脂肪酶[2]。 熒光假單胞菌能在冷藏的高蛋白、高脂肪食品中快速大量繁殖，造成嚴重的腐敗問題[3]；污染血液制品會導致輸血病人休克[4]；污染奶制品會影響奶制品的物理品質(zhì)與感官品質(zhì)[5]。在高溫處理后這些酶依舊有活性，影響乳制品品質(zhì)、保質(zhì)期[6]。

目前，關(guān)于熒光假單胞菌的檢測國內(nèi)以培養(yǎng)法為標準，傳統(tǒng)檢測方法耗時長、成本高、重復性低。滿足當下高通量快速檢測食品、科研和生產(chǎn)等要求需要更先進的技術(shù)?；诜肿由飳W的發(fā)展，微生物檢測技術(shù)也都得到很大提升。Scarpellini等[7]針對16S rRNA基因設計引物用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測熒光假單胞菌，常被應用于檢測和鑒定熒光假單胞菌。黃迅辰[8]建立以免疫磁珠為基礎的ELISA方法。Liang Xin等[9]基于脂肪酶基因用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測牛奶中的熒光假單胞菌。楊一林等[10]針對gyrB基因建立了常規(guī)PCR檢測熒光假單胞菌方法并進行評價。食品因其成分復雜、結(jié)構(gòu)多樣、各種微生物動態(tài)變化含量未知、提取出的模板DNA可能有PCR抑制成分等造成食品微生物檢測難度增加[11-12]。引物特異性強可鑒別目的菌，降低假陽性結(jié)果；引物靈敏度高可在目的菌含量低的情況下也能檢出目的菌；較好的抗干擾能力是食品微生物檢測實際應用中的要求之一。

TaqMan探針real-time PCR因其耗時短、特異性強、靈敏度高被用于食源性致病菌的檢測[13-15]。本實驗針對gyrB基因設計3 對引物和探針，并通過初步特異性驗證，篩選1 對特異性最佳引物和TaqMan探針，建立熒光假單胞菌real-time PCR檢測體系，并對其進行系統(tǒng)評價，考察其特異性、靈敏度、抗干擾能力等指標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株：熒光假單胞菌11 株，假單胞菌屬其他種類細菌10 株，非假單胞菌的常見食源性致病菌17 株。標準菌株購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心、中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心、中國工業(yè)微生物菌種庫、中國檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心，本實驗室分離保存的熒光假單胞菌編號為AS1。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；緩沖蛋白胨水 青島海博生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技有限公司；Premix ExTaqTM、pMD19-T載體、gyrBF/R、TaqMan探針 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

DRP-9082恒溫菌種培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；SIGMA 3K15高速離心機、CFX CONNECT BIO-RAD MS-2 real-time PCR儀、ChemiDoc MP BIO-RAD化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、One ND-2000微量核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)熒光假單胞菌；同時37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)非熒光假單胞菌的所有菌株。

1.3.2 基因組DNA提取

按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取。

菌體收集：收集1.0 mL菌體，離心后棄上清液。

革蘭氏陽性菌裂解方法：加入500 μL緩沖液BS、50 μL溶菌酶充分吸打混勻，37 ℃水浴溫育60 min，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入180 μL緩沖液GL、20 μL的蛋白酶K和10 μL核糖核酸內(nèi)切酶充分吸打混勻，56 ℃水浴溫育10 min。加入200 μL緩沖液GB和200 μL純乙醇并混勻。革蘭氏陰性菌裂解方法：加入180 μL緩沖液GL、20 μL蛋白酶K和10 μL核糖核酸內(nèi)切酶充分振蕩混勻。56 ℃水浴消化裂解10 min，分別加入200 μL的緩沖液GB、純乙醇，再充分混勻。

將Spin Column安裝在Collection Tube上，溶液移至Spin Column柱中，12 000 r/min離心2 min，棄濾液。將500 μL的緩沖液WA加到柱內(nèi)，12 000 r/min離心2 min后棄濾液，重復1 次。加入80 μL重蒸水，靜止5 min后離心得基因組DNA，于4 ℃保存。

1.3.3 引物與TaqMan探針的設計

使用軟件Primer express 3.0，以熒光假單胞菌AS1.823的gyrB基因為模板設計檢測引物和探針，結(jié)果如表1所示。

表1 引物和探針序列信息Table 1 Sequences of the primers and probes used in this study

1.3.4 real-time PCR體系組成與反應條件

表2 PCR體系組成Table 2 Composition of the PCR reaction system

PCR體系組成如表2所示。real-time PCR程序參數(shù)：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36 次。

1.3.5 標準曲線繪制

以10 倍梯度稀釋上述標準質(zhì)粒，并取每個梯度5 μL作為real-time PCR擴增的模板，重復3 次。標準曲線橫坐標為標準質(zhì)粒擴增得到的擴增循環(huán)數(shù)（Ct值），DNA模板量的對數(shù)（lgC）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.6 real-time PCR檢測體系評價

1.3.6.1 特異性評價

提取所有菌株基因組DNA，以雙蒸水為空白對照，采用本實驗方法對所有菌株檢測進行real-time PCR擴增。如果Ct值小于35，判斷檢出結(jié)果為陽性。

1.3.6.2 靈敏度評價

基因組DNA靈敏度評價：使用試劑盒提取熒光假單胞菌（AS1.823）基因組DNA。將基因組DNA進行10 倍梯度稀釋后測定核酸濃度，對每個稀釋度分別進行PCR擴增，每個梯度重復3 次，能得到明顯擴增曲線的最低濃度梯度即為real-time PCR檢測體系靈敏度。

如在強化學生關(guān)于側(cè)面描寫和正面描寫兩種寫作技巧時，筆者選取了《口技》一文作為講解范例，筆者讓學生在已經(jīng)理解文意的基礎上再次閱讀，并根據(jù)“夢中驚醒”“漸入夢鄉(xiāng)”和“火起群亂”三方面梳理文章的寫作順序，剖析該文章描寫技巧的使用，而在學生對側(cè)面描寫與正面描寫有所認知后，筆者又布置了與之相關(guān)的“音樂”描寫，并讓學生在寫作過程中采用側(cè)面描寫與正面描寫兩種寫作技巧，使得學生所掌握的理論知識能夠快速有效地與實踐經(jīng)驗結(jié)合，真正提升其寫作水平。

純培養(yǎng)物水平靈敏度檢測：熒光假單胞菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進行10 倍梯度稀釋，選擇10-6、10-7和10-8這3 個稀釋倍數(shù)的菌液進行平板計數(shù)。提取基因組DNA，以ddH2O為空白對照，分別進行real-time PCR，重復3 次。

1.3.6.3 抗干擾能力評價

選取類產(chǎn)堿假單胞菌（P. pseudoalcaligenesIQCC12603）、門多薩假單胞菌（P. mendocinaCICC21629）、惡臭假單胞菌（P. putidaCICC21884）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosaIQCC12625）4 株干擾菌，與熒光假單胞菌分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，1 0 倍梯度稀釋后，選擇平板計數(shù)法得到菌量。將4 種干擾菌混合，設置1 04、1 06、1 083 個干擾濃度，與熒光假單胞菌不同梯度稀釋液（1 0-4～ 10-10）分別混合，以不加入熒光假單胞菌的干擾菌混合液為空白對照，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，于第0小時和第15小時分別取樣1 次，使用試劑盒提取基因組DNA，分別進行real-time PCR。

1.3.6.4 樣品接菌檢測驗證

選取熒光假單胞菌菌液接入NB培養(yǎng)基中，放置于搖床28 ℃、150 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10 倍梯度稀釋，進行平板計數(shù)。向225 mL選擇性增菌液中接入25 mL全脂滅菌純牛奶，分別接入0.1～1、1～10、10～100 CFU/mL 3 個梯度的菌液1 mL平行3 次，于0～24 h內(nèi)每隔3 h取樣一次，試劑盒提取基因組DNA，分別進行real-time PCR擴增，以無菌水為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針的篩選與特異性評價

表3 菌種編號及特異性檢測結(jié)果Table 3 Strains used in specificity evaluation of PCR

使用常規(guī)PCR初步篩選引物，得出引物gyrB8-1特異性最好。再通過real-time PCR特異性篩選，得出探針gyrB TaqMan1效果最好。利用引物gyrB8-1、探針gyrB TaqMan1對所有實驗菌株分別進行檢測，結(jié)果如表3所示。以熒光假單胞菌的基因組DNA為模板時，擴增Ct值均小于35，而以非熒光假單胞菌基因組DNA為模板則未出現(xiàn)PCR擴增。與常規(guī)PCR比較，基于TaqMan探針的real-time PCR方法采用了特異探針可識別目的片斷，與擴增引物的特異性相疊加，且回避了分析擴增產(chǎn)物大小來判斷擴增結(jié)果，可有效增強體系的特異性；不需在擴增結(jié)束后分析熔解曲線，更縮短了檢測時長[17]。

2.2 標準曲線繪制

按照本實驗制得的標準質(zhì)粒D N A 質(zhì)量濃度為 3.55 ng/μL，換算為9.58×109copies/μL，根據(jù)1.3.5節(jié)方法單獨繪制標準曲線（圖1），得到y(tǒng)=-0.235 9x＋11.053，相關(guān)系數(shù)R2為0.99，表明該曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，本體系擴增效率很好。

圖1 熒光假單胞菌定量檢測標準曲線Fig. 1 Standard curve of real-time PCR

2.3 靈敏度評價

提取出的DNA初始質(zhì)量濃度為1.43×104fg/μL，以10 倍梯度稀釋，最小質(zhì)量濃度為1.43×10-2fg/μL。如表4所示，在基因組DNA模板的終質(zhì)量濃度為14.3 fg/μL（2～3 copies/μL）時，3 個平行都能讀出Ct值。而當模板終質(zhì)量濃度為1.43 fg/μL時，3 個平行中只有1 個能讀出Ct值，說明該real-time PCR檢測體系的擴增靈敏度為14.3 fg/μL。

表4 DNA質(zhì)量濃度與值關(guān)系（AS1.823）Table 4 Relationship between DNA concentration and Ct (AS1.823)

將培養(yǎng)12 h的熒光假單胞菌AS1.823進行平板計數(shù)，算得起始菌液濃度為3.0×109CFU/mL。如表5所示，在稀釋度為10-7時3 個平行都能讀出Ct值，而在稀釋度為10-8時3 個平行都不能讀出Ct值，則該real-time PCR檢測體系的純培養(yǎng)物水平靈敏度為3.0×102CFU/mL。

表5 純培養(yǎng)物濃度與Ct值關(guān)系（AS1.823）Table 5 Relationship between pure culture of AS1.823 and Ct

2.4 抗干擾能力評價

熒光假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌（IQCC12603）、門多薩假單胞菌（CICC21629）、惡臭假單胞菌（CICC21884）、銅綠假單胞菌（IQCC12625）4 株干擾菌活化后分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進行平板計數(shù)，計算得到起始菌液濃度分別為1.4×109、5.7×108、3.4×109、4.5×109、6.0×108CFU/mL。如表6所示，添加低濃度約1.4×104CFU/mL的干擾菌純培養(yǎng)物時，不影響本實驗real-time PCR檢測體系的靈敏度，而添加高濃度約5.6×108CFU/mL的干擾菌純培養(yǎng)物時，本實驗中real-time PCR檢測體系的檢測限下降到3.0×103CFU/mL。楊一林等[10]建立的常規(guī)PCR檢測方法靈敏度為3.0×104CFU/mL。 說明本實驗設計的引物gyrB8-1探針gyrB TaqMan1 real-time PCR方法與常規(guī)PCR系統(tǒng)相比較具有更強的抗干擾能力。在實際的食品微生物檢測中，樣品自帶的各種微生物會形成干擾，檢測體系的抗干擾能力強有助于檢測方法的實際推廣。從這一角度看，TaqMan探針法熒光定量體系更適合實際檢測[18-19]。

表6 添加干擾菌情況下對檢測靈敏度的影響Table 6 Effect of adding interfering bacteria on the sensitivity of PCR

2.5 樣品接菌檢測驗證

將濃度為22、2.2、0.22 CFU/mL的菌液按照1.3.6.4節(jié)的操作方法加入全脂滅菌純牛奶，每個濃度3 組平行，0～24 h每隔3 h取樣1 次進行real-time PCR檢測。如表7所示，當接入22 CFU/mL的熒光假單胞菌，增菌12 h可檢測到熒光假單胞菌；當接入2.2 CFU/mL的熒光假單胞菌，增菌15 h檢測呈陽性；接菌量為0.22 CFU/mL、增菌24 h后僅有1 組被檢出。實驗表明適當?shù)脑鼍蓭椭鷻z出熒光假單胞菌。

表7 人工污染樣品的PCR檢測結(jié)果Table 7 Results of PCR detection of artificial contamination

3 討 論

熒光假單胞菌的快速檢測對食品工業(yè)和公眾健康至關(guān)重要。雖然熒光假單胞菌對健康人不具有致病性，日常烹飪加熱即可殺死，但隨著冰箱的普及，人們對奶、肉制品的需求增多，食用涼拌食品，熒光假單胞菌比以往更能威脅公眾健康[20]。

分子生物學的發(fā)展為食品檢測提供了新的檢測方法，相比傳統(tǒng)檢測方法，分子生物學方法擁有傳統(tǒng)檢測方法達不到的優(yōu)勢[21]。聚合酶鏈反應衍生出一系列的新技術(shù)，例如real-time PCR、變性梯度凝膠電泳、多重PCR、巢式PCR、免疫PCR、熱啟動PCR、環(huán)介導等溫核酸擴增等，這些先進的方法已被用于病原體、致病微生物、寄生蟲、比病理檢測等[22-24]。

通過監(jiān)視插入染料、熒光標記引物或序列特異性探針產(chǎn)生的熒光，real-time PCR可在整個熱循環(huán)過程中的計算機屏幕上觀察每個DNA擴增周期。特異性探針有助于提高特異性、提高靈敏度，real-time PCR檢測的好處超過傳統(tǒng)的端點檢測方法包括動態(tài)范圍大，交叉污染的風險降低，可擴展以用于高通量應用，并有可能精確目標量化[25]。 而real-time PCR另一個主要優(yōu)點是不需要瓊脂糖凝膠電泳可視化擴增的目標DNA，這大大縮短了分析時間[26]。

本研究基于前人基礎，選擇熒光假單胞菌特異靶位點gyrB基因[27]，建立的標準曲線DNA濃度與Ct值呈良好線性關(guān)系，R2=0.99，設計的引物與探針對除熒光假單胞菌以外的假單胞菌、常見食源性致病菌均無擴增、沒有假陽性、特異性好，與高琳等[28]建立基于gyrB基因以及apr基因的食品中熒光假單胞菌雙重PCR檢測方法比較，得出靈敏度為16.9 fg/μL，本實驗在基因組DNA方面評價靈敏度為14.3 fg/μL，且本實驗做了不同濃度純培養(yǎng)物提取DNA檢測靈敏度，結(jié)果為3.0× 102CFU/mL?？紤]到實際檢測中樣品含未知的不同病原菌，本實驗設計了添加4 種假單胞菌屬的其他菌作為干擾菌評價本檢測方法的抗干擾能力，結(jié)果表明低干擾菌存在下對檢測結(jié)果無影響，高濃度干擾菌添加組經(jīng)過15 h增菌檢測限依舊可達到3.0×103CFU/mL，依然比常規(guī)培養(yǎng)檢測方法快速。

檢驗檢測技術(shù)已取得長足發(fā)展，各種先進方法都在為食品安全、人民健康保駕護航。在熒光假單胞菌檢測以及其他病原微生物檢測中仍有許多目標沒有達到，比如滿足現(xiàn)場檢測、進一步提高檢測速度、實驗儀器微型化降低成本、提高實驗可重復性、減少假陽性等[29-30]。2 種及以上的分子檢測手段聯(lián)合使用可提高檢測速度同時保證分析的準確性[31]，將是未來檢測熒光假單胞菌的研究方向。

4 結(jié) 論

本研究基于引物gyrB8-1、探針gyrB TaqMan1建立real-time PCR法，可特異性檢測熒光假單胞菌；基因水平擴增靈敏度為14.3 fg/μL；添加低濃度非熒光假單胞菌，干擾濃度添加高濃度約5.6×108CFU/mL時，檢測限下降到3.0×103CFU/mL；熒光假單胞菌22 CFU/mL污染樣品，增菌12 h，對熒光假單胞菌的檢測結(jié)果無影響。本檢測方法特異性強、靈敏度高、抗干擾性好、檢測限低，可縮短檢測周期、節(jié)約試劑與人力成本、符合大批量檢測要求，可用于快速檢測熒光假單胞菌。