超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測大豆主要過敏原蛋白

李麗芳，黃文勝，張九凱，王彥波，傅玲琳，韓曉祥，陳 穎,

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

大豆（Glycine max[L.] Merr.）是世界衛(wèi)生組織認定的八大食物過敏原之一[1]。大豆過敏原易在嬰幼兒和幼齡動物體內(nèi)引發(fā)IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型（I型）超敏反應(yīng)。目前尚無治愈食物過敏的有效療法，避免大豆及其制品的直接攝入是大豆過敏者預(yù)防過敏反應(yīng)的唯一方式。但由于大豆蛋白在食品工業(yè)（預(yù)制和加工食品）中應(yīng)用廣泛，很難將其從日常飲食中完全去除[2]。為保護大豆過敏消費者，歐盟、日本、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國家的食品標簽法規(guī)要求，任何含有大豆及其制品的食品，無論含量高低都須在包裝上明確標識[3]。 我國GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標簽通則》中也建議在食品包裝上標識相關(guān)致敏物質(zhì)。盡管各國標簽法規(guī)相繼頒布，但因交叉污染或違規(guī)而導(dǎo)致食物過敏原未按照規(guī)定進行標識的情況仍經(jīng)常發(fā)生[4]。因此，為督促食品生產(chǎn)者自覺遵守過敏原標識相關(guān)法規(guī)，幫助消費者判斷標簽標識的真實性，研發(fā)高靈敏度、快速準確的食物過敏原檢測方法至關(guān)重要。

目前，用于檢測大豆過敏原蛋白的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）[5-7]和高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)等[8-9]?；诳贵w的ELISA法應(yīng)用最早也最為廣泛，但食品加工中常用的高壓和熱處理等加工方式易引起蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性[5-7]。近年來，HPLC-MS法因其良好的特異性和靈敏度，在大豆過敏原檢測中的應(yīng)用逐漸增多。迄今為止，世界過敏原數(shù)據(jù)庫（http://www.allergenonline.org/）中共收錄了43 種大豆過敏原。其中，大豆球蛋白（包括G1、G2、G3、G4和G5亞基）和β-伴大豆球蛋白（包括α’、α和β亞基）、Gly m Bd 30K（P34蛋白）、Gly m Bd 28K（P28蛋白）以及Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（kunitz trypsin inhibitor，KTI）5 類是主要的大豆過敏原蛋白，組成大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的各亞基均已被證明具有獨立的免疫原性[10-12]。不同的大豆品種中過敏原蛋白的組成和含量存在差異，國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少有關(guān)P34等過敏原蛋白缺失[13]以及α’、α、β等亞基缺失[14-15]的大豆種質(zhì)資源。但現(xiàn)有的基于HPLC-MS技術(shù)的檢測方法通常僅以單一的大豆過敏原蛋白[16]/亞基[17-18]或某幾種大豆過敏原[11,19]為檢測目標，未涵蓋大豆中5 大類主要的過敏原蛋白及其亞基。

本研究利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）聯(lián)用技術(shù)，針對大豆5 大類主要過敏原蛋白的11 種過敏原，篩選出特征標識肽段，建立多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式質(zhì)譜檢測方法，以期為食物過敏原檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國內(nèi)外不同地區(qū)各類型大豆樣品24 份（表1），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家大豆種質(zhì)資源庫提供。

尿素、冰乙酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，ABC）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、乙腈（HPLC級）、甲酸（HPLC級）、10 kDa離心濃縮裝置 美國Sigma公司；胰蛋白酶蛋白酶（MS級） 美國Thermo Fisher-Pierce 公司；低分子質(zhì)量蛋白標準品Marker 美國Bio-Rad公司；考馬斯亮藍R250 北京克爾慧公司；超純水由Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)制備；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD XR液相色譜儀 日本Shimadzu公司； Q-TOF?6600質(zhì)譜、Q-TRAP?5500質(zhì)譜 美國AB Sciex 公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm，300 ?） 美國Waters公司； TissueLyser II型組織研磨儀 德國Qiagebn公司；ME403E型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Centrifuge 5418R型離心機、Concentrator plus型真空濃 縮儀 德國Eppendorf公司；Multiskan GO型酶標儀 美國Thermo Scientific公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國Scientific Industries公司；PowerPac Basic型凝膠電泳儀、ChemiDoc型凝膠掃描儀 美國Bio-Rad公司；HNDSY800型水浴搖床 德國Wiggens公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

所有大豆樣品均在液氮作用下研磨成粉末，過80 目篩，4 ℃保存。確稱取1 g大豆粉末并置于50 mL離心管中，以料液比1∶10（g/mL）加入超純水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至10.0，50 ℃振蕩1 h；4 ℃、4 500 r/min離心20 min后取上清液；將沉淀重懸于10 倍體積的提取緩沖液中，重復(fù)上述步驟；將2 次提取的上清液合并，過400 目濾布即得大豆全蛋白提取液；分裝后保存于-80 ℃待用。

1.3.2 提取液蛋白含量的測定

采用Bradford法[20]測定大豆總蛋白的含量。用0.15 mol/L NaCl溶液配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的BSA標準曲線溶液。將樣品大豆蛋白原液稀釋30 倍。分別吸取各系列質(zhì)量濃度BSA標準溶液與各樣品稀釋液30 μL，加入1 mL考馬斯亮藍染料，輕搖混勻，室溫靜置2～3 min。使用酶標儀于595 nm波長處測定標準蛋白溶液和樣品稀釋液的OD值，根據(jù)標準曲線計算樣品總蛋白含量，實驗重復(fù)3 次。提取液中的蛋白質(zhì)提取率按照下式計算[21]：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

SDS-PAGE分析參照Laemmli[22]的方法：根據(jù)Bio-Rad推薦配方分別制備質(zhì)量分數(shù)為12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白樣品稀釋至1 μg/μL并與上樣緩沖液1∶1混勻，95 ℃水浴10 min，上樣量為15 μL，加樣完畢后接通電源，開始時濃縮膠電泳電壓為80 V，到達分離膠后調(diào)節(jié)電壓為120 V，待溴酚藍指示劑距分離膠底部5 mm時結(jié)束電泳，取出凝膠用考馬斯亮藍R250染色約2 h，染色結(jié)束后倒去染色液，以適量體積的超純水清洗凝膠以去除殘留染料，再用脫色液（甲醇-冰乙酸-水（4∶1∶5，V/V））脫色至背景無色，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，利用Quantity One軟件進行圖像分析。

1.3.4 胰蛋白酶消化

參考Wisniewski等[23]的過濾輔助樣品制備（filtration auxiliary sample preparation，F(xiàn)ASP）法進行蛋白質(zhì)酶解。取約200 μg的大豆總蛋白提取物于10 kDa截留超濾管中，加入100 μL 10 mmol/L DTT溶液（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5），37 ℃孵育1 h；加入10 μL 50 mmol/L IAA（8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5）于室溫避光放置15 min，將蛋白烷基化；在室溫下以12 000 r/min離心10 min，用100 μL Buffer1（8 mol/L尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗滌樣品；加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，至超濾管上沒有殘留液體。在超濾管中加入100 μL 50 mmol/L ABC溶液，再以1∶50質(zhì)量比加入4 μL胰蛋白酶（1 μg/μL，溶于50 mmol/L乙酸溶液中），渦旋混勻，37 ℃過夜酶切。酶解液12 000 r/min離心10 min，然后用100 μL 25 mmol/L ABC溶液洗滌3 次，使小分子肽段進入濾液中。將濾液旋轉(zhuǎn)干燥，加入質(zhì)譜水除鹽，重復(fù)旋轉(zhuǎn)蒸干3 次，最后加入100 μL流動相A（0.1%甲酸-2%乙腈-98%水）溶液復(fù)溶。

1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS檢測條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，98% A、2% B；0.1～0.5 min，98%～92% A、2%～8% B；0.5～25 min，92%～78% A、8%～22% B；25～31 min，7 8%～6 5% A、2 2%～3 5% B；3 1 ～3 3 m i n，65%～20% A、35%～80% B；33～39 min，20% A、80% B；39～39.5 min，20%～98% A、80%～2% B；39.5～44 min，98% A、2% B。

AB SCIEX TripleTOF?6600質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）正離子掃描模式；離子化電壓5 000 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；氣簾氣壓力35 psi；質(zhì)譜掃描模式：信息依賴型采集工作模式（information dependent acquisition，IDA）；TOF MS模式m/z 350～1 500，500 ms；IDA TOF MS/MS模式m/z 350～1 500， 40 MS/MS，100 ms，IDA閾值100 cps，母離子電荷選擇范圍為＋2～＋5；滾動碰撞能量enabled；動態(tài)排除時間12 s；運行時間44 min。

1.3.6 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水溶液；流動相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈溶液；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃，進樣體積10 μL。梯度洗脫程序：0～0.1 min，97% A、3% B；0.1～10 min，97%～70% A、3%～30% B；10～13 min，7 0%～4 5% A、3 0%～5 5% B；1 3 ～1 3.1 m i n，45%～20% A、55%～80% B；13.1～16 min，20% A、80% B；16.1～20 min，20%～97% A、80%～3% B；20～20.1 min，97% A、3% B。

AB QTRAP?5500質(zhì)譜條件：ESI正離子掃描參數(shù)：氣簾氣壓力35 psi，碰撞氣：Medium，離子化電壓4 500 V，離子源溫度500 ℃，霧化氣壓力65 psi，輔助氣壓力50 psi；正離子掃描Scheduled MRM模式：MRM檢測窗口120 s；掃描時間3 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用高分辨質(zhì)譜和計算機對胰蛋白酶酶解肽的質(zhì)荷比（m/z）、保留時間（retention time，RT）和響應(yīng)強度等原始數(shù)據(jù)進行IDA，生成wiff文件。從Uniprot數(shù)據(jù)庫（UniprotKB，http://www.uniprot.org）中檢索并下載大豆蛋白數(shù)據(jù)庫并導(dǎo)入AB SCIEX公司的ProteinPilot v.5.0軟件，對原始數(shù)據(jù)進行搜庫處理。ProteinPilot v.5.0軟件參數(shù)設(shè)定如下：樣品類型：鑒定；Cys烷基化：IAA；消化：胰蛋白酶；搜索工作：完整蛋白信息（identity document，ID）；ID焦點：生物學(xué)修飾；檢測到的蛋白質(zhì)閾值（Unused ProtScore（Conf））：＞0.05（10.0%）；運行錯誤發(fā)現(xiàn)率分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

樣品蛋白的高效提取是質(zhì)譜鑒定分析的前提，因此本實驗對大豆蛋白提取緩沖液的組成與pH值、提取料液比及提取溫度和時間等條件進行優(yōu)化。由于大豆蛋白在堿性溶液中具有良好的溶解性[19]，本實驗對比3 種提取緩沖液（緩沖液a：H2O；緩沖液b：0.03 mol/L Tris-HCl；緩沖液c：0.1 mol/L ABC）在堿性條件下（pH 9.0和pH 10.0）對大豆中可溶性蛋白總回收率的影響。結(jié)果顯示，緩沖液a在pH 9.0和pH 10.0時獲得的大豆蛋白提取率均高于緩沖液b和緩沖液c（圖1A）；并采用HPLC-MS/MS 方法檢測不同緩沖液在pH 10.0條件下提取的大豆蛋白酶解肽中目標致敏原特征肽段的得率，經(jīng)比較分析，當(dāng)使用堿性水溶液作為提取溶劑（緩沖液a）時，各過敏原特征肽段的響應(yīng)強度可達到最高值（圖1B），故本研究最終選擇以1 mol/L NaOH溶液作為堿化介質(zhì)調(diào)節(jié)的水溶液作為大豆蛋白的提取緩沖液。在此基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)提取緩沖液的pH值（pH 8.0～12.0），發(fā)現(xiàn)pH值為10.0時大豆蛋白提取率最高（圖1C）。通過評估不同料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20（g/mL））下的提取效率，發(fā)現(xiàn)料液比為1∶10時大豆蛋白提取效果最佳（圖1D）。為增加大豆蛋白的溶解度，需輔助進行加熱和振蕩處理，進一步考察提取溫度（25～60 ℃）和振蕩提取時間（15～120 min）對其提取效率的影響。結(jié)果表明，在50 ℃和60 min的提取條件下獲得了大豆蛋白的最佳提取率（圖1E和圖1F）。在優(yōu)化的提取條件下完成了所有大豆樣品的蛋白提取，利用Bradford法測得24 個品種中大豆蛋白含量在252.89～329.85 mg/g之間。

圖1 提取條件對大豆蛋白提取效果的影響Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction efficiency of soybean protein

2.2 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE技術(shù)分析24 個大豆樣品的蛋白組成，通過與已知的各過敏原相對分子質(zhì)量進行比對，可準確定位大豆球蛋白的酸性多肽鏈A（34～44 kDa）和堿性多肽鏈B（18～20 kDa）、β-伴大豆球蛋白的α’（72 kDa）、α（68 kDa）和β（52 kDa）亞基、P34（30～34 kDa）、P28（28 kDa）及KTI（24 kDa）相應(yīng)的條帶位置。由圖2可知，利用本實驗方法提取的大豆總蛋白包括了上述主要大豆過敏原，各過敏原條帶清晰可見，未發(fā)生降解，且不同品種間大豆蛋白質(zhì)的亞基組成及含量存在差異。

圖2 大豆蛋白粗提物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE profiles of crude soy protein extracts from different cultivars

2.3 大豆蛋白胰蛋白酶肽的UPLC-Q-TOF-MS分析

按1.3.5節(jié)色譜及質(zhì)譜條件，利用UPLC-Q-TOF-MS對24 份大豆樣品的全蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物進行分析，得到其在全掃描模式下具有代表性的總離子流色譜圖。以綏農(nóng)1號大豆種質(zhì)為例，大豆蛋白酶解產(chǎn)物的分離情況較好，其色譜圖譜峰尖銳，響應(yīng)強度較高，峰形對稱且重復(fù)性好，數(shù)據(jù)采集情況良好（圖3）。

圖3 大豆蛋白酶解產(chǎn)物在全掃描模式下的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatograms of tryptic digestion products from soybean protein extracts

2.4 特征肽段的篩選

在Uniprot數(shù)據(jù)庫中搜索并下載大豆蛋白的氨基酸序列，使用ProteinPilot軟件結(jié)合Paragon算法針對大豆蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析得到的MS2譜進行搜庫處理，以生成蛋白質(zhì)、肽序列、豐度和修飾信息的列表，實現(xiàn)蛋白質(zhì)和多肽的鑒定。在95%置信度下，針對性地鑒定出11 種大豆主要過敏原，即大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基，β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28及KTI。為確定質(zhì)譜檢測的標志物，對經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫結(jié)果比對后得到的一系列肽段進行篩選。篩選原則如下：長度在7～21 個氨基酸之間；m/z＜1 250；不含任何修飾氨基酸（半胱氨酸（C）與蛋氨酸（M））；不含內(nèi)部胰蛋白酶切割位點；在酶切位點處沒有連續(xù)的精氨酸（R）或賴氨酸（K）殘基[24-28]。根據(jù)上述原則，每個目標過敏原篩選得到1～4 條預(yù)選特征肽段，共計29 條（表2），其中11 條為本研究首次發(fā)現(xiàn)。將所選擇的預(yù)選特征肽段利用BLAST分析工具進行UniProtKB數(shù)據(jù)庫比對，以檢查物種間同源性，確保這些肽段對于其所屬的大豆過敏原具有特異性。比對結(jié)果表明，所選特征肽段僅存在于其所屬大豆過敏原中，均可作為大豆過敏原定性定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的候選靶肽。

表2 大豆中11 種主要過敏原的特征肽段信息及其MRM參數(shù)Table 2 Information about signature peptides and MRM parameters for 11 major allergens in soybean

2.5 大豆主要過敏原特征肽段的三重四極桿質(zhì)譜驗證

本實驗利用Skyline軟件對所選特征肽段進行模擬酶解，獲得各肽段適用于質(zhì)譜分析的理論傳輸離子對（母離子Q1和子離子Q3）、RT、碰撞能量（collision energy，CE）以及去簇電壓（declustering potential，DP）等MRM參數(shù)信息，并通過三重四極桿質(zhì)譜MRM模式對所選特征肽段進行驗證。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后，帶電荷的肽段碎裂成許多小片段，產(chǎn)生y離子和b離子（肽段主鏈片段離子在N和C端保持正電荷），導(dǎo)致每個肽段出現(xiàn)多個峰。之前研究表明，每個特征肽段應(yīng)至少選擇3 個子離子進行監(jiān)測，其中響應(yīng)值最高的離子可作為定量離子，其余兩個離子輔助定性分析[29-30]。以β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR為例，在m/z526.272＋處觀察到該肽的雙質(zhì)子化離子信號強度最高，該離子的MS2分析結(jié)果如圖4所示。m/z580.28＋（y5）、m/z693.37＋（y6）和m/z840.44＋（y7）處的片段碎裂效果最佳，其中y5子離子的響應(yīng)強度在C-末端y-系列產(chǎn)物離子中最高，適用于MRM監(jiān)測，而y6子離子和y7子離子分別具有第2和第3高的響應(yīng)強度。因此，選擇m/z 526.272＋～580.28＋、m/z 526.272＋～693.37＋和 m/z 526.272＋～840.44＋的離子躍遷用于該特征肽段的鑒定。同上方法，獲得其余肽段適用于MRM監(jiān)測的離子對信息。以綏農(nóng)1號大豆作為實驗樣本，對特征肽段的RT、CE值和DP值等MRM參數(shù)進行優(yōu)化，最終的HPLC-MRM方法能夠同時監(jiān)測上述11 種大豆主要過敏原的29 條特征肽段（表2）。圖5顯示了正離子采集模式下綏農(nóng)1號大豆樣品中上述過敏原特征肽段的提取離子色譜圖，各特征肽段在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下均得到較好的檢測結(jié)果，對應(yīng)的色譜峰分離效果良好、峰形對稱且響應(yīng)強度高。

圖4 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR的二級質(zhì)譜圖Fig. 4 Tandem mass spectrum of signature peptide NPFLFGSNR of β-conglycinin α subunit

圖5 大豆主要過敏原特征肽段的提取離子色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of signature peptides of major allergens in soybean

2.6 特異性驗證實驗結(jié)果

用于檢測的特征肽段應(yīng)具有序列保守性，覆蓋絕大多數(shù)大豆品種，因此進一步利用24 個代表性大豆品種對所選擇的特征肽段進行特異性驗證。結(jié)果表明，同一條特征肽段在不同大豆品種中的響應(yīng)強度存在差異，如 β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段ESYFVDAQPK在焉耆黃豆中的響應(yīng)強度最高，而在瑞金青皮豆中的響應(yīng)強度最低；大豆球蛋白G1亞基的特征肽段VLIVPQNFVVAAR在焉耆黃豆中的響應(yīng)強度與在上饒八月白中的響應(yīng)強度相差一個數(shù)量級；KTI的特征肽段FIAEGHPLSLK在青豆中的響應(yīng)強度為泌陽小籽黃的300多倍等。雖然不同大豆品種的肽段/蛋白質(zhì)的組成和含量不同，但所選擇的29 條特征肽段均存在于被測的24 個大豆品種中（圖6），體現(xiàn)出良好的特異性。該結(jié)果與Ma Yingtao等[31]報道的桃脂轉(zhuǎn)運蛋白（LTPI）的Pru p 3.01過敏原蛋白在不同栽培品種中的含量存在顯著差異的結(jié)果一致。

圖6 不同大豆品種中預(yù)選特征肽段的質(zhì)譜檢測結(jié)果Fig. 6 Mass spectrometry verification of signature peptides selected for different soybean cultivars

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫和Skyline等生物信息學(xué)軟件完成肽段匹配，成功篩選到可用于表征11 種大豆主要過敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亞基， β-伴大豆球蛋白的α′、α和β亞基，P34、P28以及KTI）的特征肽段共29 條，并優(yōu)化了這些肽段的三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的MRM檢測參數(shù)，利用24 個代表性大豆品種對特征肽段的特異性進行驗證，從而建立了11 種大豆主要過敏原的UPLC-MS/MS-MRM定性檢測方法。與現(xiàn)有大豆過敏原的HPLC-MS/MS檢測方法相比，本方法檢測目標包含了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的所有亞基，檢測結(jié)果能夠全面、準確地代表大豆品種和大豆制品中所含的過敏原。

引起食物過敏免疫應(yīng)答的不是整個過敏原蛋白，而是其中某一段連續(xù)的氨基酸序列（線性抗原表位）或由幾段不連續(xù)氨基酸序列形成的空間構(gòu)象（構(gòu)象表位）?，F(xiàn)階段，本實驗所確定的特征肽段中，有些屬于抗原表位的組成部分（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段NPFLFGSNR和ESYFVDAQPK），有些則與抗原表位無關(guān)（如β-伴大豆球蛋白α亞基的特征肽段EQQQEQQQEEQPLEVR）。由于在加工食品中蛋白質(zhì)易發(fā)生降解，此時應(yīng)用本實驗中某些特征肽段得到的過敏原含量可能無法與實際樣品的致敏性強弱相關(guān)聯(lián)[32]。

本研究下一步將以挖掘到的特征肽段為檢測靶標，合成相應(yīng)的穩(wěn)定同位素標記多肽，詳盡考察定量限、檢出限、回收率、重復(fù)性等方法學(xué)要素，最終建立食品中11 種大豆主要過敏原的定量檢測方法，為大豆過敏研究、大豆脫敏試劑開發(fā)以及低致敏性大豆品種培育、嬰幼食品中大豆蛋白含量檢測等提供技術(shù)支持，為完善我國食物過敏標簽立法和食品安全監(jiān)管提供技術(shù)保障。