巴曲酶在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用

田書娟 黃德暉 楊揚(yáng) 王曉 吳衛(wèi)平

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性，脫髓鞘疾病。MS主要的病理改變包括血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞、纖維蛋白沉積、炎性細(xì)胞浸潤、髓鞘脫失、少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失、反應(yīng)性膠質(zhì)增生和軸索破壞。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)是目前最佳的炎性脫髓鞘動(dòng)物模型，對(duì)EAE的研究有助于更進(jìn)一步理解炎性脫髓鞘的分子和細(xì)胞機(jī)制。在MS和EAE研究中發(fā)現(xiàn)，早在T細(xì)胞浸潤和脫髓鞘開始前腦白質(zhì)中即發(fā)現(xiàn)BBB破壞和纖維蛋白沉積，并伴有小膠質(zhì)細(xì)胞活化[1-6]，纖維蛋白沉積不僅發(fā)生在MS的早期，在MS的活動(dòng)期和慢性病變中也有大量沉積，且與脫髓鞘和T細(xì)胞浸潤有關(guān)[7-8]，表明纖維蛋白沉積參與了MS的整個(gè)致病過程且與炎性反應(yīng)有關(guān)。且研究發(fā)現(xiàn)降低纖維蛋白沉積可減輕炎性反應(yīng)，延遲脫髓鞘的發(fā)生[9]，并有效改善EAE模型發(fā)病動(dòng)物的臨床癥狀[10]。巴曲酶是蛇毒中提取的一種蛋白酶，具有分解纖維蛋白、降低人體內(nèi)纖維蛋白原的作用。本文作者團(tuán)隊(duì)之前的實(shí)驗(yàn)通過免疫后給予巴曲酶治療，發(fā)現(xiàn)巴曲酶能明顯減輕EAE小鼠的臨床癥狀和發(fā)病過程[11]。但EAE小鼠免疫前預(yù)防應(yīng)用巴曲酶是否也能起到保護(hù)作用尚不可知，故本研究于小鼠免疫前后分別給予巴曲酶預(yù)防及治療，觀察巴曲酶對(duì)EAE的作用。

另有研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)可以參與BBB的破壞過程，組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)和 MMP-2和-9均參與了BBB的破壞和MS的發(fā)病過程。這些酶的大量激活均依賴于纖溶酶，表明MMP和纖溶酶原激活酶系統(tǒng)之間存在功能相互作用[12-13]。但纖維蛋白沉積、纖溶活性改變及MMP-9表達(dá)間的關(guān)系目前尚未明了。因此本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)觀察纖維蛋白對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，以觀察巴曲酶是否會(huì)通過影響MMP-9的表達(dá)來影響EAE的發(fā)病。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑清潔級(jí)8～10周齡的C57BL/6(H-2b)雌性小鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量約18 g)。福氏完全佐劑(completely freund adjuvant，CFA)(美國Sigma公司)，百日咳活菌疫苗、結(jié)核桿菌凍干粉(北京天壇生物制品研究所)，巴曲酶(北京東菱醫(yī)藥生物科技有限公司提供)，鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；西安聯(lián)美生物有限公司)，兔抗CD3抗體、兔抗Fig抗體、鼠抗GFAP抗體、山羊抗MBP抗體及山羊抗MMP-9抗體(美國SANTA CRUZ公司)，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(河北博海生物工程開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及EAE造模：將8～10周齡的雌性C57BL/6小鼠55只，根據(jù)體重編號(hào)后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、EAE模型組(15只)、巴曲酶預(yù)防組(預(yù)防組，15只)、巴曲酶治療組(治療組15只)，后3組小鼠(簡稱EAE小鼠)均以MOG35-55多肽誘發(fā)EAE模型。各組小鼠具體干預(yù)方法見表1。

表1 各組小鼠的干預(yù)方法

(1)EAE造模：以200 μg MOG35-55多肽溶入200 μL PBS液，再與等量CFA混和，添加結(jié)核桿菌使其終濃度為1.5 mg/mL，攪拌5～10 min使其充分乳化，于小鼠雙側(cè)側(cè)腹壁腹腔注射，免疫后0時(shí)(即腹腔注射MOG35-55多肽乳化液時(shí))及48 h腹腔內(nèi)注射100 μL百日咳活菌疫苗(含菌5×109)。造模操作后存活小鼠時(shí)參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)，EAE模型組15只，治療組14只，預(yù)防組12只。正常對(duì)照組：將200 μL PBS液與200 μL CFA乳化，取小鼠雙側(cè)側(cè)腹壁腹腔注射。

(2)發(fā)病情況及神經(jīng)功能評(píng)分：免疫后(對(duì)照組注射后)每日觀察各組小鼠發(fā)病情況并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，并計(jì)算發(fā)病率。

神經(jīng)功能評(píng)分：免疫后每日上午10時(shí)由同一人對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。Kono’s 5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]：0分，不發(fā)病；1分，尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙；2分，輕度后肢力弱；3分，后肢明顯力弱；4分，四肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)。

發(fā)病小鼠于發(fā)病高峰期處死，無發(fā)病者于觀察50 d后處死。發(fā)病高峰期一般表現(xiàn)為四肢癱瘓、瀕死狀態(tài)，或連續(xù)3 d癥狀無加重。

發(fā)病率的計(jì)算方法：發(fā)病率=(各組發(fā)病只數(shù)/各組總存活只數(shù))×100%。

1.2.2組織病理學(xué)檢查：各組小鼠給予10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉，冰上快速取出小鼠脊髓，分離腰膨大部分在4%多聚甲醛中固定(同時(shí)將脊髓其他部分組織，-80℃冷凍，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及RT-PCR檢測(cè))，標(biāo)本石蠟包埋，組織連續(xù)切片，厚度4 μm厚。每組脊髓切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色、Luxol fast blue染色、快速銀染。

(1)HE染色：每只小鼠隨機(jī)選5張切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組單個(gè)視野炎性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。(2)Luxol fast blue染色、快速銀染：均每只小鼠隨機(jī)選5張切片，每張切片隨機(jī)選5個(gè)100倍視野，觀察髓鞘及軸索結(jié)構(gòu)及著色情況。(3)免疫組化染色：常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，山羊血清37℃封閉，加入相應(yīng)的一抗〔兔抗CD3抗體(1︰50)、兔抗Fig抗體(1︰100)、鼠抗GFAP抗體(1︰50)、山羊抗MBP抗體(1︰100)、山羊抗MMP-9抗體(1︰100)〕4℃過夜，加入二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG)，37℃孵育20 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，脫水，透明，中性樹脂封片，每只小鼠隨機(jī)選5張切片，采用CMOS(日本OLYMPUS公司，美國Imaging技術(shù)公司專用軟件)多功能真彩色病理圖象分析系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，觀察染色后各指標(biāo)陽性表達(dá)情況，依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖象灰度選擇合適的灰度分割閾值，測(cè)定陽性免疫染色強(qiáng)度及面積，獲得免疫組化評(píng)分值。免疫組化評(píng)分(IHS)方法：結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面聯(lián)合評(píng)分：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)(0～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4)，B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)(0=陰性、1=弱陽性、2=陽性、3=強(qiáng)陽性)，A、B兩項(xiàng)乘積即為該組織的IHS值。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MBP mRNA表達(dá)水平：取各組小鼠剩余的脊髓組織，按Trizolz說明書提取組織總RNA，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt)作為內(nèi)參對(duì)照。并紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA純度鑒定及定量；用RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。采用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，選用20 μL為擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件：95℃，2 min，95℃ 2 s，60℃ 3 s，72℃ 11 s，循環(huán)45次。MBP引物序列：上游引物：5′-ACACTAACCTCGGTGGAAA-3′；下游引物：5′-GCAGTATTGGGCTACATCA-3′。按照2-△△CT計(jì)算MBP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)MMP-9 mRNA表達(dá)水平：總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄方法同前。MMP-9上游引物：5′-CCACCCTACAAAGTTGTCTTCT-3′；下游引物：5′-CTACGTGACCTACGACCT-3′。反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 3 min，60℃ 30 s，72℃ 10 min，38個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，采用ChampGel TM 2000凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠電泳條帶進(jìn)行掃描分析，獲得各條帶光密度，以MMP-9條帶光密度/hprt條帶光密度的比值作為MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間樣本均數(shù)比較進(jìn)行單因素完全隨機(jī)方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。小鼠發(fā)病率比較采用R×C卡方檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用卡方分割法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠發(fā)病情況正常對(duì)照組無發(fā)病，其余3組均有小鼠發(fā)病，其中EAE模型組發(fā)病率〔12(80.0%)〕最高，各組小鼠發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.7，P=0.005)，治療組〔7(50.0%)〕及預(yù)防組〔2(16.7%)〕發(fā)病率均低于EAE模型組(均P<0.05)。

EAE小鼠在在免疫后13 d左右陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，尾部張力減低、消失，雙后肢無力、癱瘓，可伴有大小便失禁。癥狀嚴(yán)重者，前肢也逐漸出現(xiàn)無力、癱瘓，以致不能爬動(dòng)、翻身。與EAE模型組比較，巴曲酶預(yù)防組和治療組發(fā)病及達(dá)峰時(shí)間均延遲(P<0.05)，神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05，預(yù)防組與治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 各組EAE小鼠發(fā)病、達(dá)峰時(shí)間及評(píng)分比較

2.2 各組小鼠脊髓中炎性反應(yīng)、髓鞘脫失和軸索損害比較HE染色顯示免疫后小鼠脊髓內(nèi)不同程度出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，小血管明顯擴(kuò)張，炎性細(xì)胞聚集在血管周圍形成袖套樣改變，以白質(zhì)為著。EAE各組小鼠的脊髓中炎性細(xì)胞浸潤的數(shù)量均較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，預(yù)防組及治療組脊髓中炎性細(xì)胞浸潤的數(shù)量與EAE模型組相比明顯減少(P<0.05)，預(yù)防組與治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見表3。

Luxol fast blue染色顯示正常對(duì)照組髓鞘連續(xù)，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的脫失；EAE模型組小鼠脊髓白質(zhì)疏松呈泡沫狀，髓鞘不連續(xù)，部分白質(zhì)區(qū)髓鞘呈片狀脫失，預(yù)防組及治療組脊髓內(nèi)髓鞘脫失明顯輕于EAE模型組，且預(yù)防組髓鞘脫失較治療組輕微(圖1)。

快速銀染結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠軸索染色可見銀染色結(jié)構(gòu)完整、著色均勻，EAE模型組、治療組及預(yù)防組均可見脊髓內(nèi)纖維結(jié)構(gòu)松散，銀染著色淺，軸索廣泛缺失，其中以EAE模型組軸索損害最為嚴(yán)重(圖2)。

圖1 各組小鼠脊髓中髓鞘脫失比較(Luxol fast blue染色×100)：正常對(duì)照組(A)髓鞘連續(xù)，未見脫失；EAE模型組(B)白質(zhì)疏松呈泡沫狀，髓鞘不連續(xù)，可見片狀脫失；治療組(C)部分泡沫狀白質(zhì)疏松，髓鞘不連續(xù)；預(yù)防組(D)部分髓鞘不連續(xù) 圖2 各組小鼠脊髓中軸索損害比較(快銀染色×100)：正常對(duì)照組(A)軸索結(jié)構(gòu)完整，著色均勻；EAE模型組(B)結(jié)構(gòu)松散，著色淺，軸索廣泛缺失；治療組(C)及預(yù)防組(D)結(jié)構(gòu)較松散，著色不均勻

2.3各組小鼠脊髓中T細(xì)胞浸潤、纖維蛋白沉積及GFAP、MBP及MMP-9蛋白表達(dá)比較

2.3.2各組小鼠脊髓中纖維蛋白沉積比較：在正常對(duì)照組小鼠脊髓切片中未見到纖維蛋白沉積，而EAE模型組，發(fā)病小鼠脊髓白質(zhì)的大、小血管周圍、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中，均可見到明顯的Fig陽性物質(zhì)沉積，其沉積的范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于炎性細(xì)胞浸潤的范圍；免疫組化評(píng)分各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與較EAE模型組比較，預(yù)防組及治療組小鼠Fig陽性物質(zhì)沉積明顯減少(均P< 0.01)(表3、圖4)。

表3 各組檢測(cè)指標(biāo)比較

圖3 各組小鼠脊髓中T細(xì)胞浸潤比較(免疫組化×400)：正常對(duì)照組(A)、治療組(C)及預(yù)防組(D)均可見散在少量陽性細(xì)胞，EAE模型組(B)可見較多的陽性細(xì)胞(圖中箭頭所示) 圖4 各組小鼠脊髓中纖維蛋白沉積比較(免疫組化×400)：正常對(duì)照組(A)未見纖維蛋白沉積；EAE模型組(B)可見大量的纖維蛋白沉積，治療組(C)與預(yù)防組(D)少量纖維蛋白沉積(圖中箭頭所示)

2.3.3各組小鼠脊髓中GFAP及MBP蛋白表達(dá)比較：正常對(duì)照組可見GFAP表達(dá)，突起正常，未見免疫活性增強(qiáng)，MBP表達(dá)均勻，髓鞘結(jié)構(gòu)正常，EAE模型組可見豐富的GFAP表達(dá)，免疫活動(dòng)增強(qiáng)，突起增多，呈彌漫性分布，而MBP表達(dá)減少，治療組和預(yù)防組較EAE模型組GFAP表達(dá)減少，MBP表達(dá)增多(P<0.05)(表3、圖5)。

圖5 各組小鼠脊髓中GFAP、MBP、MMP-9蛋白表達(dá)比較(免疫組化×400)：正常對(duì)照組可見GFAP表達(dá)，細(xì)胞突起正常；MBP表達(dá)均勻，髓鞘結(jié)構(gòu)正常；未見MMP-9陽性表達(dá)。EAE模型組GFAP表達(dá)豐富，突起增多，部分胞體腫脹；MBP少量表達(dá)，分布不均勻，結(jié)構(gòu)紊亂；MMP-9陽性表達(dá)明顯。治療組與預(yù)防組GFAP表達(dá)稍多，部分突起增多；MBP少量表達(dá)，但較圖EAE模型組增多，分布欠均勻；MMP-9陽性表達(dá)明顯

2.3.4各組小鼠脊髓中MMP-9蛋白表達(dá)比較：正常對(duì)照組脊髓內(nèi)未見MMP-9的陽性表達(dá)。EAE組中，MMPs-9在脊髓膜、白質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍單個(gè)核細(xì)胞、部分膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外間質(zhì)內(nèi)表達(dá)均明顯增加，治療組和預(yù)防組小鼠脊髓中MMP-9表達(dá)與EAE模型組無明顯差異(P>0.05)(表3、圖5)。

2.4 各組小鼠脊髓中MBP mRNA、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各組間MBP mRNA表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.71，P<0.01)。EAE模型組、預(yù)防組和治療組MBP mRNA表達(dá)較對(duì)照組均明顯下調(diào)(P<0.05)，預(yù)防組及治療組MBP mRNA的表達(dá)均較EAE模型組上調(diào)(P<0.05)，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.97)。具體見表3。

普通RT-PCR結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠脊髓中可檢測(cè)到MMP-9 mRNA的表達(dá)，三組EAE小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P< 0.05)，但三組EAE小鼠間MMP-9的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見表3、圖6 。

圖6 各組小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達(dá)情況(RT-PCR法)

3 討論

現(xiàn)有病理生理學(xué)研究證實(shí)，炎性反應(yīng)和凝血過程也是相互關(guān)聯(lián)互為整體的，很多炎性反應(yīng)以凝血激活和纖維蛋白沉積為特征[15]。在炎性反應(yīng)的短時(shí)間內(nèi)凝血酶能引起血管通透性的增加，從而導(dǎo)致急劇、短暫的BBB通透性增高與凝血酶活性增加、纖維蛋白形成并沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)血管周圍，BBB的開放，進(jìn)一步促進(jìn)了纖維蛋白的沉積[16]，定量研究顯示纖維蛋白原沉積與炎性細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞)的積累呈正相關(guān)，且纖維蛋白原沉積的高峰與脫髓鞘和軸索丟失的發(fā)生一致。另外在纖維蛋白原缺乏的EAE小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)其發(fā)病時(shí)間明顯推遲，疾病嚴(yán)重程度也有所降低，也支持纖維蛋白原在炎性脫髓鞘病變的早期發(fā)病機(jī)制和持續(xù)炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[17-18]。目前已知巴曲酶具有降解纖維蛋白原、誘發(fā)t-PA釋放、增強(qiáng)t-PA的作用、減少纖維蛋白溶酶原激活劑抑制物(plasminogen activator inhibitor，PAI)生成等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[19]。而清除EAE動(dòng)物體內(nèi)的纖維蛋白原，可延遲脫髓鞘的發(fā)生，減輕臨床癥狀，改善預(yù)后[9-10]。本研究也表明應(yīng)用巴曲酶降纖治療可使EAE小鼠發(fā)病率下降，發(fā)病時(shí)間延遲，臨床癥狀減輕，病理學(xué)提示巴曲酶預(yù)防組和治療組病灶內(nèi)炎性浸潤減輕，纖維蛋白沉積減少。其中值得關(guān)注的是，本實(shí)驗(yàn)中預(yù)防組免疫前使用巴曲酶進(jìn)行系統(tǒng)降纖，其發(fā)病率與發(fā)病時(shí)間均明顯低于免疫后3 d開始使用巴曲酶的治療組，但兩組在EAE達(dá)峰時(shí)間、最大神經(jīng)功能評(píng)分以及病理學(xué)炎性反應(yīng)方面均無明顯差別，提示纖維蛋白原可能是EAE發(fā)病的一個(gè)先決條件，一旦發(fā)病后，對(duì)臨床表現(xiàn)及炎性改變可能無明顯影響，這也支持了纖維蛋白原主要在病灶形成和臨床癥狀出現(xiàn)前起作用，即作用在EAE誘導(dǎo)階段的觀點(diǎn)。故可以推測(cè)，對(duì)于復(fù)發(fā)緩解型MS患者，在病程緩解期，給予巴曲酶降低血漿中纖維蛋白含量可以有效預(yù)防復(fù)發(fā)，其預(yù)防效果可能要大于其治療效果。

一直以來免疫介導(dǎo)的CNS髓鞘破壞和少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失被認(rèn)為是MS的主要病理表現(xiàn)，但是MS導(dǎo)致永久的神經(jīng)功能障礙主要與軸索丟失有關(guān)[20-21]。多項(xiàng)有關(guān)MRI、MRS、fMRI的影像學(xué)研究均證明進(jìn)行性軸索丟失是導(dǎo)致MS患者發(fā)生不可逆神經(jīng)功能障礙的主要原因[22-25]。在本實(shí)驗(yàn)中，MOG誘發(fā)的EAE小鼠脊髓中可見到明顯的軸索丟失、破壞，而使用巴曲酶干預(yù)的小鼠軸索損害明顯減輕，其與臨床癥狀、炎性浸潤和髓鞘脫失程度一致，表明巴曲酶可能有效減輕軸索的損害進(jìn)而改善預(yù)后，但巴曲酶對(duì)軸索的保護(hù)作用是直接作用還是間接通過改善炎性反應(yīng)、髓鞘保護(hù)等起作用，尚需進(jìn)一步行體外細(xì)胞培養(yǎng)等研究進(jìn)行證實(shí)。

Akassoglou等[26]通過建立動(dòng)物坐骨神經(jīng)損傷模型觀察到給予巴曲酶處理可減少纖維蛋白在神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)中的沉積，促進(jìn)施萬細(xì)胞分化，增加髓鞘化軸突的數(shù)量，即神經(jīng)軸突的再髓鞘化而促進(jìn)損傷后坐骨神經(jīng)的再生。雖然中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生能力與周圍神經(jīng)不同，但本研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用巴曲酶清除纖維蛋白原后MBP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，MBP mRNA表達(dá)上調(diào)，提示在CNS中，調(diào)控纖維蛋白原的沉積/清除可能是神經(jīng)損傷后修復(fù)的一個(gè)關(guān)鍵因素。Petzold等[27]研究發(fā)現(xiàn)GFAP水平高低與患者臨床殘疾評(píng)分呈正相關(guān)，故可以將其作為不可逆損害的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中EAE模型組小鼠脊髓中有大量纖維蛋白沉積，星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增生明顯，引起的臨床癥狀嚴(yán)重，造成了神經(jīng)功能的不可逆損害，而巴曲酶干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，臨床癥狀輕且預(yù)后好，降低了造成神經(jīng)功能不可逆損害的機(jī)率，這也與本文作者團(tuán)隊(duì)之前的研究結(jié)果相一致，提示降纖治療可能改善臨床患者的預(yù)后。

EAE早期BBB的破壞除與凝血-纖溶系統(tǒng)有關(guān)外，還需特別關(guān)注另一種蛋白酶——MMPs。MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，參與了腦缺血、MS和帕金森病等多種神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展。其中，MMP-9在MS和EAE相關(guān)研究中涉及最多。在MS發(fā)病過程中，MMP-9主要參與了BBB破壞、炎細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失等多個(gè)環(huán)節(jié)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在EAE組小鼠發(fā)病急性期，病灶區(qū)、血管周圍單個(gè)核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均可見到MMP-9表達(dá)，并且EAE組小鼠MMP-9 mRNA表達(dá)均有明顯增加，這些結(jié)果與以往文獻(xiàn)結(jié)果一致。既往多項(xiàng)研究已證實(shí)，EAE動(dòng)物脊髓中MMP-9 mRNA表達(dá)升高程度與臨床癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，臨床表現(xiàn)越重者則MMP-9 mRNA表達(dá)越高[29]。基于此，本研究進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與預(yù)期，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)防組和治療組小鼠脊髓中MMP-9 mRNA表達(dá)與EAE模型組無明顯差異，其原因尚不清楚。但有研究發(fā)現(xiàn)纖溶酶系統(tǒng)在MMPs激活過程中起決定性的作用，t-PA和尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-tyoe plasminogen activator，u-PA)將纖溶酶原激活為纖溶酶，纖溶酶進(jìn)而激活MMP-3和MMP-1，二者可使MMP-9前體裂解轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腗MP-9，另外，tPA還能以纖溶酶非依賴的方式作用于MMP-9，間接調(diào)節(jié)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄，并在EAE發(fā)病中與MMPs協(xié)同誘導(dǎo)，參與炎性反應(yīng)和軸索損傷[30]。由上推測(cè)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與使用巴曲酶后機(jī)體內(nèi)tPA活性增高有關(guān)。

綜上，本次研究表明長期、間斷給予巴曲酶可以減緩EAE小鼠炎性反應(yīng)發(fā)生及髓鞘的損傷，EAE造模時(shí)在免疫前使用效果最佳，并且未發(fā)現(xiàn)持續(xù)給予巴曲酶的小鼠有出血傾向及其他毒副作用。纖維蛋白沉積是促進(jìn)MS發(fā)生、進(jìn)展的重要因素之一，它可能涉及到炎性反應(yīng)、BBB通透性增高、神經(jīng)膠質(zhì)增生、軸索損害等多個(gè)方面。巴曲酶對(duì)于MS患者是否有效，用藥時(shí)機(jī)、劑量及療程長短均需進(jìn)一步研究，但以纖維蛋白為治療靶點(diǎn)的抗凝治療對(duì)炎性脫髓鞘疾病可能有潛在的治療益處，值得進(jìn)一步研究探討。