解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens T-6的分離鑒定及抗病促生潛力

要雅倩 成娜娜 李培根盧毅王彥剛 林榕姍 周波

王冰1，2

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018；2. 山東鹽堿地植物-微生物聯(lián)合修復(fù)工程技術(shù)研究中心，泰安 271018；3. 寧夏中青農(nóng)業(yè)科技有限公司，寧夏 750000）

桃（Amygdalus persica L.）起源于我國(guó)西北高原地區(qū)，是我國(guó)最古老的栽培樹(shù)種之一［1］。近年來(lái)，桃類(lèi)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，桃樹(shù)種植面積逐年上升，許多老果園亟待更新，但受用地及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制，很多果園都需要在原地重建。桃樹(shù)自身的自毒作用加上農(nóng)藥化肥的長(zhǎng)期濫用，土壤理化性質(zhì)惡化、營(yíng)養(yǎng)失衡、病原物增多，加劇了桃樹(shù)栽培過(guò)程中病蟲(chóng)害的發(fā)生［2-3］。

桃樹(shù)根腐病，別稱(chēng)爛根病（Peach root rot），是桃樹(shù)連作障礙中重要的土傳病害。該病害一般由土壤習(xí)居菌鐮刀菌侵染所致［4-5］，常發(fā)生在地勢(shì)低洼，土壤黏重，排水不良的地塊。此病害最先危害桃樹(shù)根部，先是須根變褐枯死，而后是側(cè)根和主根，隨著病害的加重，病斑不斷變大甚至可深達(dá)木質(zhì)部，最后整段根都枯死［6］。目前，多用化學(xué)手段來(lái)防控桃樹(shù)根腐病，并沒(méi)有一種真正意義上有效且環(huán)境友好的防治措施?？捎糜诜乐胃鞣N作物病害的芽胞桿菌菌劑就成為了化學(xué)農(nóng)藥和化肥的極佳替代品。

芽胞桿菌（Bacillusspp.）廣泛存在于自然界中，具有對(duì)不良環(huán)境極強(qiáng)的抗逆性，是一種可以形成芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌［7-9］。作為生物防治中的明星菌種，芽胞桿菌可以顯著影響植物根際土壤中關(guān)鍵酶的活性以及微生物的多樣性。本研究從桃樹(shù)根腐病發(fā)病桃園健康植株根際分離篩選，獲得對(duì)多株土傳病原菌具有較好拮抗效果的生防芽胞桿菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)系統(tǒng)性鑒定，對(duì)其抗病和促生效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)，為可防治桃樹(shù)根腐病等多種土傳病害的生物肥料與生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌株和土壤樣品 供試土樣：2018年12月采集江蘇泗洪縣桃樹(shù)根腐病發(fā)病果園中健康植株根際土壤，裝入到無(wú)菌樣品袋中、密封、編號(hào)，于實(shí)驗(yàn)室中4℃保存。

抗菌譜供試病原菌：AMCC100027串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、AMCC100029腐皮鐮刀菌（F. solani）、AMCC100025層出鐮刀菌（F. proliferatum）、AMCC100030絲核菌（Rhizoctonia solani）、AMCC400016普 通 瘡 痂 鏈 霉菌（Streptomyces scabieis）、AMCC400044酸瘡痂鏈霉菌（S. acidiscabies）、AMCC辛1-3腫痂鏈霉菌（S.Turgidis）、鏈霉菌AMCC400023均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)AMCC資源與環(huán)境微生物研究室保藏。

1.1.2 供試材料 盆栽試驗(yàn)番茄品種為3716。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.0-7.5。

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2-7.4。

脫脂奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉5.0 g，瓊脂18.0 g，水1 L，pH 7.0。

纖維素培養(yǎng)基：C6H7O2（OH）2CH2COONa 1.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 1.0 g，KH2PO40.1 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，pH自然。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2。

果膠培養(yǎng)基：果膠5.0 g，蛋白胨2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，瓊脂20.0 g，水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的篩選

1.2.1.1 生防菌分離 將10 g采集的土壤樣品加入90 mL無(wú)菌水中（含Φ3.5 mm玻璃珠），充分振蕩后，80℃水浴0.5 h，靜置15 min。將上清液梯度稀釋?zhuān)?0-3-10-5）后，于LB培養(yǎng)基上涂布，37℃培養(yǎng)24 h，挑取不同的菌落分離純化，2-3次后，將獲得的菌株編號(hào)后保藏。

1.2.1.2 生防菌初篩 將病原腐皮鐮刀菌活化到長(zhǎng)滿平板，用無(wú)菌的打孔器（Φ10 mm）打成均勻的圓形菌塊，轉(zhuǎn)接到PDA平板中間，28℃培養(yǎng)2 d后用接種環(huán)挑取純化好的細(xì)菌接種到距病原真菌菌餅邊緣2 cm處，28℃繼續(xù)培養(yǎng)4-5 d。待病原真菌菌體長(zhǎng)滿平板，觀察有無(wú)抑菌帶出現(xiàn)。

1.2.1.3 生防菌復(fù)篩 采用雙層平板牛津杯法［10］進(jìn)行試驗(yàn)。將待試菌株發(fā)酵培養(yǎng)得種子發(fā)酵液。將各菌株種子液接種到0.1 L的LB液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，4℃離心20 min，經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾得無(wú)菌發(fā)酵上清液。將100 μL（105CFU/mL）腐皮鐮刀菌的發(fā)酵液均勻涂布，用鑷子將牛津杯放置在平板兩側(cè)，吸取100 μL濾菌發(fā)酵上清液至牛津杯中?？瞻诪閮H涂布等量病原發(fā)酵液。待病原長(zhǎng)滿平板，測(cè)量抑菌圈直徑以及抑菌率（抑菌圈直徑/病原菌生長(zhǎng)直徑）。

1.2.1.4 生防菌株抗菌譜的測(cè)定 將供試菌株活化后培養(yǎng)備用。將100 μL濃度為105CFU/mL的各供試病原菌（共8種）的發(fā)酵液涂布，刮取少量的待測(cè)細(xì)菌菌苔均勻點(diǎn)接于距離培養(yǎng)基中心2.5 cm處，對(duì)照組是將等量105CFU/mL的各病原菌發(fā)酵液均勻涂布。待對(duì)照組各病原菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，測(cè)量抑菌圈直徑以及病原菌生長(zhǎng)半徑r，對(duì)照組半徑為平板半徑r0，利用公式（r0-r）/r0計(jì)算抑菌率。

結(jié)合初篩、復(fù)篩及抑菌譜結(jié)果，從待測(cè)細(xì)菌中選取抑菌效果突出的一株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 生防菌T-6系統(tǒng)鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［11］中形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀察菌落性狀，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

1.2.2.2 生理生化鑒定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行葡萄糖、淀粉水解試驗(yàn)等反應(yīng)測(cè)定。

1.2.2.3 Biolog系統(tǒng)分析 TSA培養(yǎng)基33℃培養(yǎng)生防菌16-24 h，用無(wú)菌棉棒蘸取IF-B接種液后，將接種液攪拌均勻。調(diào)整濁度儀濁度到90%-98%T，將菌懸液倒入加樣水槽中，用移液槍依次接種到鑒定板上，每孔100 μL。反應(yīng)24-36 h后，放入讀數(shù)儀中，設(shè)置參數(shù)后讀取菌株的代謝指紋信息。

1.2.2.4 分子鑒定

（1）16S rDNA序列擴(kuò)增：用康為試劑生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取生防菌的基因組DNA后 進(jìn) 行16SrDNA序 列PCR擴(kuò)增［12］。引 物 為通用引物27F-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR產(chǎn)物測(cè)序工作委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成，將所得到的序列在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)分析，最后用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

（2）特異性PCR：經(jīng)16S鑒定發(fā)現(xiàn)該菌株與枯草芽胞桿菌遺傳關(guān)系較近，遂采用枯草菌群特異性PCR技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)一步鑒定。各引物信息為：解淀粉芽胞桿菌（L100-AAATCTGCCCGTATCGTCG，R836-GCGTCACGGCGRATCTCAA）；枯草芽胞桿菌（BSL72-CGTAGAGCCACTTGAGCG，BSR328-CTGCCGTTACAGTTCCTT）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 0.5 min；61.7℃ 0.5 min；72℃ 0.4 min；延伸72℃ 10 min循環(huán)29次（NYT2066-2011）。

1.2.3 生防菌T-6抗病促生檢測(cè)與驗(yàn)證

1.2.3.1 生防菌拮抗因子檢測(cè)

（1）蛋白酶檢測(cè)：將菌株T-6接種到脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2 d，看有無(wú)透明圈產(chǎn)生。（2）果膠酶檢測(cè)：將菌株T-6接種到果膠培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2 d，觀察是否有透明圈。（3）幾丁質(zhì)酶檢測(cè)：將生防菌株T-6接種到幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2 d，觀察有無(wú)透明圈出現(xiàn)。（4）纖維素酶檢測(cè)：用纖維素培養(yǎng)基平板培養(yǎng)生防菌株2 d，0.5%剛果紅染液染色，靜置1 h后倒出染液。用5%的NaCl溶液洗脫1 h后倒出，看有無(wú)透明圈出現(xiàn)。

1.2.3.2 生防菌促生指標(biāo)檢測(cè)

（1）溶磷、解磷指標(biāo)的測(cè)定：將菌株接種到有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷平板中，28℃ 培養(yǎng)2-5 d，觀察是否有透明圈。（2）解鉀指標(biāo)的測(cè)定：生防菌三區(qū)劃線到硅酸鹽培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)72 h，觀察是否有光滑透明油滴狀菌落。

1.2.3.3 番茄幼苗抗病促生盆栽試驗(yàn)

（1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)設(shè)置為CK、病原菌、生防菌、病原菌+生防菌4個(gè)處理。取3-4片真葉健康、長(zhǎng)勢(shì)均一的番茄幼苗，定植4-5 d后，2、4處理組灌病原菌發(fā)酵液（105CFU/mL）100 mL，其余加等量PDA液體。7 d后，后兩個(gè)處理組每株灌100 mL生防菌發(fā)酵液（107CFU/mL），其余加等量LB液體。病原與生防菌隔7 d灌一次，各灌3次，管理45 d測(cè)量農(nóng)藝性狀。

（2）測(cè)定方法：將植株105℃處理30 min，90℃烘干稱(chēng)重。葉綠素含量用CT（mg/L）=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663來(lái)計(jì)算，Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度。用根系掃描儀來(lái)觀察根系情況。

病害調(diào)查采用番茄根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無(wú)?。?級(jí)：莖上出現(xiàn)水漬狀的病斑；2級(jí)：莖上病斑擴(kuò)展，但不超過(guò)株高 1/4，不萎蔫；3級(jí)：病部超過(guò)整株 1/4，延伸至根部不超過(guò)株高 3/4，莖基部輕微萎蔫；4級(jí)：病部蔓延至全株，包括根和葉柄，莖基部嚴(yán)重溢縮，葉片枯萎，死亡。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別）/（調(diào)查總株數(shù)×最大級(jí)數(shù)）×100。防治

效果（%）=（空白對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/空白對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.2.4 運(yùn)用Excel 2010和SPSS19.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果

2.1 桃樹(shù)根腐病生防菌的分離篩選

2.1.1 桃樹(shù)根腐病生防菌初篩 初篩共獲得6株對(duì)靶標(biāo)腐皮鐮刀病原菌有拮抗作用的生防芽孢菌，編號(hào)為T(mén)-1-T-6，如圖1所示。

圖1 生防菌株T-1-T-6拮抗腐皮鐮刀菌初篩結(jié)果

2.1.2 桃樹(shù)根腐病生防菌復(fù)篩 以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，在復(fù)篩中T-3、T-6菌株的發(fā)酵上清液對(duì)桃樹(shù)根腐病病原腐皮鐮刀菌有較好的抑菌效果，抑菌率如表1所示分別可達(dá)21.16%與22.61%。

2.1.3 生防菌抗菌譜測(cè)定 復(fù)篩中所用6株生防菌株對(duì)串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌、絲核菌等病原菌的抑制作用。如表2所示，T-4、T-5、T-6菌株的綜合

表1 生防菌株T-1-T-6拮抗腐皮鐮刀菌復(fù)篩結(jié)果

拮抗效果較好。圖2中T-6菌株對(duì)4種病原真菌的抑菌效果均可達(dá)20%以上，對(duì)普通瘡痂鏈霉菌的抑制效果可高達(dá)33.81%，體現(xiàn)了較為廣譜的抗性，因此，選定T-6菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖3為T(mén)-6菌株拮抗部分真菌與鏈霉菌的結(jié)果。

2.2 生防菌T-6系統(tǒng)鑒定

2.2.1 生防菌T-6形態(tài)學(xué)鑒定 從圖4中可以看出T-6菌株的菌落呈白色，邊緣不規(guī)則，中間呈嵴狀突起，濕潤(rùn)無(wú)光澤。革蘭氏染色試驗(yàn)表明該生防菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌株。

2.2.2 生防菌T-6生理生化鑒定 通過(guò)生理生化指標(biāo)測(cè)定分析，菌株T-6可以利用葡萄糖作為碳源，苯丙氨酸脫氨酶、接觸酶指標(biāo)均為陽(yáng)性，符合芽胞桿菌屬的生理特性。鑒定結(jié)果如表3所示。

2.2.3 生防菌T-6 Biolog分析 通過(guò)Biolog系統(tǒng)鑒定分析，將所得鑒定板結(jié)果（表4）與標(biāo)準(zhǔn)板布局圖比對(duì)，可以初步確定生防菌株T-6為芽胞桿菌，與解淀粉芽胞桿菌的特性類(lèi)似。

2.2.4 生防菌T-6分子生物學(xué)鑒定

2.2.4.1 生防菌T-6 的16S rDNA序列擴(kuò)增 將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast同源性比對(duì)后，利用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖5所示，菌株T-6與B.amyloliquefaciens和B. methylotrophicus的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)

表2 拮抗菌株的抗菌譜測(cè)定抑菌圈結(jié)果

圖2 菌株T-6抗菌譜抑菌結(jié)果

圖3 T-6菌株拮抗串珠鐮刀菌（A）及T-6菌株拮抗普通瘡痂鏈霉菌（B）部分結(jié)果

圖4 生防菌T-6的形態(tài)特征

表3 生防菌株T-6的部分生理生化特性

系最近，自展值可達(dá)97%。

2.2.4.2 生防菌T-6特異性PCR擴(kuò)增 通過(guò)特異性PCR，發(fā)現(xiàn)菌株T-6可以用B. amyloliquefaciens的特異性引物擴(kuò)增出條帶（圖6）。結(jié)合前面的鑒定結(jié)果，可以確定該菌株是B. amyloliquefaciens。

表4 T-6菌株的Biolog鑒定結(jié)果

2.3 生防菌T-6抗病促生檢測(cè)與驗(yàn)證

2.3.1 生防菌T-6拮抗因子檢測(cè) 檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，T-6菌株的菌落在果膠和纖維素培養(yǎng)基上不產(chǎn)生透明圈，在脫脂奶粉、幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上可產(chǎn)生明顯的透明圈，說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的能力。

2.3.2 生防菌T-6促生性指標(biāo)測(cè)定 T-6菌株溶磷、解磷、解鉀試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。圖8-A、圖8-B圖中，菌落周?chē)休^小的透明圈，圖8-C圖中培養(yǎng)基上可長(zhǎng)出產(chǎn)莢膜的光滑透明油滴狀菌落，說(shuō)明該菌株具有一定的溶磷、解磷和解鉀的功能。

圖5 菌株T-6的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 菌株T-6特異性PCR結(jié)果

圖7 生防菌T-6產(chǎn)蛋白酶（A）、幾丁質(zhì)酶（B）能力測(cè)定結(jié)果

2.3.3 生防菌T-6抗病促生盆栽驗(yàn)證 從菌株T-6番茄盆栽結(jié)果中植株（圖9）與根（圖10）的長(zhǎng)勢(shì)上來(lái)看，腐皮鐮刀根腐病菌很大程度上影響了植株的生長(zhǎng)，導(dǎo)致病原菌處理過(guò)的番茄幼苗長(zhǎng)勢(shì)在對(duì)照和3個(gè)處理組中最弱；而生防菌處理組的番茄幼苗長(zhǎng)勢(shì)最好；其次是生防菌+病原菌處理組，可見(jiàn)生防菌T-6對(duì)病原菌與番茄生長(zhǎng)均有一定的影響。經(jīng)統(tǒng)計(jì)（表5），將生防菌T-6單處理組與CK進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩組幼苗在干重、根總長(zhǎng)與葉綠素3個(gè)方面呈極顯著差異，分別提高31.81%、50.79%、35.11%，其余3個(gè)性狀呈顯著差異（P＜0.05），表明了該生防菌株明顯的促生性能。與病原處理組相比，病原菌+生防菌混合處理組的鮮重、干重、株高、莖粗等6個(gè)指標(biāo)均明顯提高，且差異極為顯著（P＜0.01），其中鮮重、干重增長(zhǎng)69.43%、77.57%，說(shuō)明T-6菌株在盆栽試驗(yàn)中突出的抗病效果。

圖8 T-6菌株溶磷（A）、解磷（B）、解鉀（C）能力測(cè)定結(jié)果

在病原菌+生防菌的混合處理組中，番茄苗的干重較比CK提高了23.37%，具有極顯著的差異，其余鮮重、株高、莖粗等5個(gè)參數(shù)均表現(xiàn)出顯著的差異。這兩個(gè)處理組的比較結(jié)果，充分證明生防菌T-6菌株在盆栽試驗(yàn)中明顯的拮抗病原菌與促進(jìn)作物生長(zhǎng)的能力。

第3次接種病原菌5 d后，病原菌對(duì)照組的植株矮小，莖基部萎蔫，出現(xiàn)根腐病的癥狀，病情指數(shù)可達(dá)85.25，病原菌+生防菌T-6處理組的病情指數(shù)和防效分別為37.09和 56.49%（表6）。說(shuō)明了T-6菌株具有一定防治根腐病的潛力。

表5 菌株T-6番茄盆栽結(jié)果

表6 菌株T-6對(duì)番茄根腐病的防治結(jié)果

圖9 菌株T-6番茄盆栽試驗(yàn)

圖10 番茄幼苗掃根結(jié)果

3 討論

根腐病主要致病菌為半知菌亞門(mén)的鐮刀菌，這類(lèi)病原菌宿主廣泛，可引起桃樹(shù)、番茄等多種作物的根腐病害。傳統(tǒng)防治過(guò)程中，農(nóng)藥化肥長(zhǎng)期的濫用迫使土壤中的有益微生物數(shù)量驟減，減弱了土壤自身的修復(fù)能力［13］。作為一種無(wú)毒、無(wú)害且生態(tài)友好型的方法，生物防治越來(lái)越受到人們的歡迎。目前報(bào)道的根腐病生防菌，多為枯草芽胞桿菌等常見(jiàn)菌種［14］，對(duì)解淀粉芽胞桿菌研究較少。2015年，Sunar等［15］發(fā)現(xiàn)B. altitudinis對(duì)黃瓜根腐病防效可達(dá)66.6%。此外，馬鈴薯瘡痂病作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中又一種土傳病害，已經(jīng)成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)重要的挑戰(zhàn)。其病原菌主要有S. scabies［16］，S. turgidiscabies［17-18］，S.galilaeus［19］等。本研究室的Li等［20］2019年發(fā)現(xiàn)生防菌B. altitudinisAMCC101304對(duì)馬鈴薯瘡痂病有良好的防治效果。本研究分離獲得一株對(duì)桃樹(shù)根腐病、馬鈴薯瘡痂病等土傳病害病原菌抑制效果明顯的生防菌株T-6，經(jīng)系統(tǒng)鑒定后確定該菌株為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）。

生防菌在根際土壤中廣泛存在，可主動(dòng)調(diào)節(jié)作物根際土壤中的微生物組分與土壤生態(tài)功能［21-22］，促進(jìn)養(yǎng)分的吸收［23-24］，增強(qiáng)抗病性，提高品質(zhì)［25-26］。2017年，本研究室的Chen等［21］報(bào)道生防菌Brevibacillus laterosporuAMCC100017有利于土壤中有益功能菌的增殖，可增加土壤群落中微生物多樣性。在多數(shù)情況下，芽胞桿菌的抑菌活性與其合成抗生素或其他化合物抑制或直接殺死病原生物的能力有關(guān)［27-28］。Bacillus可通過(guò)核糖體或非核糖體兩種途徑來(lái)合成抗生素、細(xì)菌素及抗菌肽等多種抗菌物質(zhì)［29］。迄今為止，已揭示的芽胞桿菌生防機(jī)制有競(jìng)爭(zhēng)、拮抗與誘導(dǎo)寄主抗性等內(nèi)容［30］。本研究在檢測(cè)生防菌株T-6抑菌物質(zhì)酶活時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌株具有產(chǎn)蛋白酶與幾丁質(zhì)酶的活性，推測(cè)其抑菌特性與這兩種酶解能力緊密相關(guān)。通過(guò)盆栽試驗(yàn)測(cè)定T-6菌株對(duì)番茄根腐病的防治效果發(fā)現(xiàn)，灌入生防菌T-6發(fā)酵液后的混合處理組對(duì)比單病原對(duì)照組病情指數(shù)明顯降低，防效可達(dá)54.69%。

芽胞桿菌還可通過(guò)分泌植物激素［31］或通過(guò)磷增溶、鐵還原等方式為植物提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)直接促進(jìn)作物生長(zhǎng)［32］。Chowdhury等［33］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽胞桿菌FZB42防治茄根枯萎病時(shí)，可顯著提高生菜的生物量。本研究經(jīng)對(duì)T-6菌株進(jìn)行促生指標(biāo)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株具有解磷、溶磷及解鉀的能力。在后期番茄盆栽試驗(yàn)中，該菌株在CK與生防菌處理組、病原菌與病原菌+生防菌處理組以及CK與病原菌+生防菌處理組這3組比較結(jié)果中，有部分指標(biāo)可達(dá)差異極顯著水平，表現(xiàn)出了該生防菌株顯著的促生和抗病效果。分析其原因可能是該菌株通過(guò)分泌酶類(lèi)物質(zhì)抑制病原菌的增殖與通過(guò)解磷和解鉀的方式為植株提供營(yíng)養(yǎng)，從而極大地促進(jìn)了番茄幼苗的生長(zhǎng)。結(jié)合盆栽中其顯著的防治效果，說(shuō)明T-6菌株確實(shí)具有一定的促生與生防潛力。

芽胞桿菌菌劑的生產(chǎn)，從菌株的篩選鑒定、功能驗(yàn)證到后期的大田應(yīng)用，需要經(jīng)歷相對(duì)復(fù)雜漫長(zhǎng)的過(guò)程［34］，這期間芽胞桿菌要受許多內(nèi)在因素與外界環(huán)境的影響，因此，本試驗(yàn)獲得的生防芽胞桿菌菌株還需要后期進(jìn)一步的大田驗(yàn)證與系統(tǒng)優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究篩選出的T-6生防芽胞桿菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、Biolog生理生化和分子生物學(xué)系統(tǒng)鑒定，確定為B. amyloliquefaciens。該生防菌株具有一定的促生及廣譜的抗菌活性，在防治桃樹(shù)根腐病等土傳病害方面具有較大的潛力。