GoldenBraid酶切連接反應(yīng)體系的優(yōu)化

徐美慧 張耀杰 唐克軒， 苗志奇

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

合成生物學(xué)是將現(xiàn)代工程學(xué)原理和方法應(yīng)用到生物學(xué)的一種新的研究領(lǐng)域［1-2］。合成生物學(xué)通過采用自下而上的研究方法實現(xiàn)了人工生物體系的建立［3-5］，已經(jīng)應(yīng)用于藥物合成［6-9］和個性化醫(yī)療［10-15］等多個領(lǐng)域。DNA組裝是合成生物學(xué)的重要基礎(chǔ)技術(shù)，是構(gòu)建基因表達(dá)系統(tǒng)乃至整個染色體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［16-17］。傳統(tǒng)的基于限制性消化和連接的克隆方法較為冗長耗時，而且不適合高通量DNA組裝和多個DNA片段的同時組裝，無法進(jìn)行需要更高效率和保真度的復(fù)雜DNA結(jié)構(gòu)設(shè)計［18-19］。近年來，為了適應(yīng)快速發(fā)展的基因組設(shè)計，已經(jīng)開發(fā)大量新的高效率、高保真度并且模塊化的DNA組裝方法［20-22］。

Golden Gate是一種利用ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)DNA組裝的新方法，可以實現(xiàn)多個DNA片段的高效“無縫”組裝，已經(jīng)被用于擁有重復(fù)的復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的激活子的拼接和多重CRISPR-Cas9基因編輯等領(lǐng)域［16，23-25］。Golden Gate的主要優(yōu)點是可以將其模塊化，而模塊化是合成生物學(xué)的一個標(biāo)志，但和許多方法一樣Golden Gate在標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性方面存在一定限制［26-27］。GoldenBraid（GB）是一種基于Golden Gate的標(biāo)準(zhǔn)化組裝系統(tǒng)，可以在一個反應(yīng)中實現(xiàn)多個標(biāo)準(zhǔn)化元件的無痕定向快速組裝，并允許由標(biāo)準(zhǔn)化DNA片段組成的可重復(fù)使用的基因模塊通過二進(jìn)制組合無限生長［27］。GB系統(tǒng)不需要進(jìn)行額外的PCR擴(kuò)增和載體線性化的步驟，還允許在一步反應(yīng)中進(jìn)行限制消化-連接循環(huán)，使反應(yīng)結(jié)束時只保留正確的組合，極大地提高了反應(yīng)效率并節(jié)省了實驗時間［24］。

GB是一種迭代組裝方法，反應(yīng)僅使用兩種限制性內(nèi)切酶，工具包較小，組裝的轉(zhuǎn)錄單位更易于在其他組裝中重復(fù)使用［26］。GB的簡單高效、可重復(fù)性和可交換性的特性促進(jìn)了實驗之間元件的重復(fù)使用和研究小組之間的元件交換，成為植物分子生物學(xué)家構(gòu)建復(fù)雜多基因結(jié)構(gòu)的有效方法［26，28］，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于Cas9和Cas12a介導(dǎo)的植物基因編輯等領(lǐng)域，同時在酵母、真菌等生物上也已經(jīng)得到應(yīng)用［29-33］。

GB是一種基于ⅡS型限制性內(nèi)切酶的限制連接反應(yīng)，內(nèi)切酶實現(xiàn)元件的釋放，T4連接酶完成后續(xù)的元件定向組裝，從而形成目標(biāo)重組載體。GB標(biāo)準(zhǔn)方案采用ligase buffer，在進(jìn)行較多DNA片段的組裝時，LB平板上目標(biāo)重組載體對應(yīng)的白色菌落稀少，大多為空載體對應(yīng)的藍(lán)色菌落，我們推測很可能內(nèi)切酶在ligase buffer中難以發(fā)揮完全的酶切功能導(dǎo)致酶切連接反應(yīng)效率較低。除緩沖體系外，酶切連接反應(yīng)效率還可能受到酶切時間、緩沖體系、ⅡS型限制性內(nèi)切酶來源和底物配伍等多個因素影響，本研究通過對GB反應(yīng)體系的參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，探討酶切連接反應(yīng)的最適條件，旨為今后應(yīng)用GB系統(tǒng)進(jìn)行更復(fù)雜的通路設(shè)計提供一種行之有效的組裝方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、純化DNA片段以及元件供體質(zhì)粒（表1）為實驗室保存，pUPD2、pDGB3 α1/2和pDGB3 Ω1/2受體載體質(zhì)粒來自Addgene提供的GoldenBraid 2.0 kit。

1.1.2 酶和試劑 ⅡS限制性核酸內(nèi)切酶：BsmBI/Esp3I（ER0451）、FastDigestEsp3I（FD0454）和FastDigestEco31I（FD0293），Thermo Fisher Scientific- CN產(chǎn)品，BsaI（#R0535），NEB（北京）產(chǎn)品；DNA連接 酶：T4 DNA連接酶（M1804），Promega（北京）產(chǎn)品；ATP Solution（R0441），Thermo Fisher Scientific - CN產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 限制連接組裝反應(yīng) 使用BsaI或BsmBI作為限制酶和T4連接酶建立限制連接反應(yīng)，使DNA序列被馴化成標(biāo)準(zhǔn)化元件，并實現(xiàn)多個標(biāo)準(zhǔn)元件的組裝和連接。限制連接反應(yīng)的原始方案根據(jù)表2搭建反應(yīng)體系，反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行，熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為37℃ 2 min，16℃ 5 min，25個循環(huán)。

1.2.2 GB反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 將-80℃冰箱保存的E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上解凍，取2 μL的GB反應(yīng)產(chǎn)物加入50 μL的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，置于冰上孵育30 min，然后42℃水浴90 s，迅速放回冰上繼續(xù)孵育2-5 min，在超凈工作臺中向離心管中分別加入1 mL LB培養(yǎng)基（不含抗生素）輕輕混勻，隨后37℃水浴45 min。在超凈工作臺中取50 μL菌液涂布于含有IPTG（0.5 mmol/L）、X-gal（40 μg/mL）和受體載體對應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板上，37℃過夜孵育以篩選陽性克隆。（pUPD2：CamR；pDGB3 α1/2：KanR；pDGB3 Ω1/2：SpeR）

1.2.3 GB反應(yīng)評價方法 統(tǒng)計每組3次重復(fù)實驗中LB平板上包含目標(biāo)重組載體的白色菌落和包含完整受體載體的藍(lán)色菌落的數(shù)量，計算總菌落數(shù)。定義酶切連接效率作為GB反應(yīng)的綜合評價指標(biāo)。

式中，E表示酶切連接效率（%），N表示有效克隆數(shù)量，即為白色菌落數(shù)量，P表示有效克隆比例（%），即白色菌落數(shù)量與總菌落數(shù)量的比例。當(dāng)酶切連接效率達(dá)到97%以上時，由于接近理想極限，對體系優(yōu)化不再敏感。

1.2.4 GB反應(yīng)優(yōu)化實驗

1.2.4.1 酶切時間對GB反應(yīng)的影響 將酶切連接反應(yīng)中37℃熱孵育時間由原方案的2 min延長到4 min。觀察統(tǒng)計總菌落數(shù)量和有效克隆數(shù)量，分析酶切時間對元件組裝效率的影響。

1.2.4.2 緩沖體系對GB反應(yīng)的影響 將原方案中l(wèi)igase buffer替 換 成FastDigest Buffer和FastDigest Buffer（ATP）預(yù)混液，預(yù)混液的配置方法為10 μL 10×FastDigest Buffer中加入1 μL ATP（100 mmol/L）取1.1 μL預(yù)混液加入10 μL反應(yīng)體系，因此，反應(yīng)體系中ATP終濃度為1 mmol/L。觀察統(tǒng)計總菌落數(shù)量和有效克隆數(shù)量，考察緩沖體系對元件組裝效率的影響。

1.2.4.3 限制性內(nèi)切酶對GB反應(yīng)的影響 酶切連接反應(yīng)中37℃熱孵育時間設(shè)定4 min，緩沖體系使用FastDigest Buffer（ATP）預(yù)混液。將原方案中1 μL fermentasBsmBI/Esp3I分 別 替 換 成0.5 μL fermentasBsmBI/Esp3I和0.5 μL FastDigestEsp3I，將1 μL NEBBsaI分別替換為0.5 μL NEBBsaI和0.5 μL FastDigestEco31I，觀察統(tǒng)計總菌落數(shù)量和有效克隆數(shù)量，考察不同來源內(nèi)切酶對元件組裝效率的影響。

1.2.4.4 底物配伍對GB反應(yīng)的影響 酶切連接反應(yīng)中37℃熱孵育時間設(shè)定為4 min，使用FastDigest Buffer（ATP）預(yù)混液和0.5 μL FastDigest限制性內(nèi)切酶。將原方案中按質(zhì)量比計算各組分加入量更改為按摩爾比計算各組分加入量。針對不同的元件供體載體和受體載體摩爾比設(shè)置3個處理，處理Ⅰ元件供體載體和受體載體摩爾比為1∶3；處理Ⅱ元件供體載體和受體載體摩爾比為1∶1；處理Ⅲ元件供體載體和受體載體摩爾比為3∶1。不同摩爾比的底物濃度見表3。觀察統(tǒng)計總菌落數(shù)量和有效克隆數(shù)量，考察底物配伍對元件組裝效率的影響。可用以下公式計算DNA摩爾數(shù)［26］：

2 結(jié)果

2.1 酶切時間對酶切連接效率的影響

實驗結(jié)果表明，當(dāng)酶切時間為2 min（原方案）時，BsmBI-GB反應(yīng)LB平板上的菌落基本上是藍(lán)色，有效克隆比例只有8.08%；BsaI-GB反應(yīng)LB平板上的菌落也以藍(lán)色為主，有效克隆比例只有23.43%，對應(yīng)酶切連接效率分別為0.3%和7.96%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1。將酶切時間由2 min延長到4 min，發(fā)現(xiàn)有效克隆比例分別提升到23.66%（BsmBI）和72.59%（BsaI），比2 min實驗提升了2倍左右。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，不同酶切時間對應(yīng)的有效克隆比例存在顯著差異，P＜0.01（圖1），說明酶切時間從2 min延長到4 min，體系得到明顯優(yōu)化?？紤]到酶切時間繼續(xù)延長會導(dǎo)致實驗進(jìn)程過于冗長，所以我們建議在后續(xù)的實驗中將每個循環(huán)的酶切時間設(shè)置為4 min。

表3 不同摩爾比對應(yīng)底物濃度

圖1 酶切時間對有效克隆比例的影響

2.2 緩沖體系對酶切連接效率的影響

GB原方案采用ligase buffer作為整個反應(yīng)的緩沖體系，在實驗中發(fā)現(xiàn)即使在酶切時間延長到4 min后，LB平板上的菌落仍然以藍(lán)色為主，特別是BsmBI-GB反應(yīng)酶切連接效率只有18.71%，而選擇更為合適的緩沖體系可能成為進(jìn)一步提升GB反應(yīng)效率的有效手段。實驗表明，當(dāng)緩沖體系替換為FastDigest Buffer（ATP）時，BsmBI-GB反應(yīng)和BsaIGB反應(yīng)的LB平板上基本是白色菌落，有效克隆比例達(dá)到99.50%（圖2-A），有效克隆數(shù)量超過了600個/皿（圖2-B），酶切連接效率都達(dá)到了99.90%以上。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)astDigest Buffer（ATP）相比于ligase buffer，能夠顯著提升GB體系的有效克隆比例，P＜0.0001。所以我們建議在后續(xù)的實驗中緩沖體系使用FastDigest Buffer（ATP）。

圖2 緩沖體系對有效克隆比例和有效克隆數(shù)的影響

2.3 不同來源限制性內(nèi)切酶對酶切連接效率的影響

限制性內(nèi)切酶的用量決定了GB反應(yīng)的成本，所以我們嘗試在限制性內(nèi)切酶減半的情況下，考察不同來源限制性內(nèi)切酶的效果。首先，我們嘗試在酶切時間延長到4 min并使用FastDigest Buffer（ATP）的基礎(chǔ)上，將GB體系中fermentasBsmBI/Esp3I和NEBBsaI的用量減半（0.5 μL）發(fā)現(xiàn)，LB平板上仍然有很多藍(lán)色菌落，有效克隆比例分別是66.17%（BsmBI）和52.43%（BsaI），對應(yīng)酶切連接效率分別為90.45%和87.38%。將上述方案中的fermentas和NEB核酸內(nèi)切酶替換為FastDigest限制性內(nèi)切酶，實驗發(fā)現(xiàn)有效克隆比例分別提高到90.80%（FastDigestEsp3I）和97.61%（FastDigestEco31I），是原內(nèi)切酶方案的1.5倍左右，酶切連接效率都達(dá)到了98.00%以上。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)astDigest限制性內(nèi)切酶相比于原方案內(nèi)切酶，能夠顯著提高GB體系的有效克隆比例（P＜0.0001，圖3）。我們建議在后續(xù)的實驗中使用0.5 μL FastDigest限制性內(nèi)切酶以節(jié)省實驗成本。

圖3 限制性內(nèi)切酶對有效克隆比例的影響

2.4 底物配伍對酶切連接效率的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)元件供體載體與受體載體摩爾比為1∶3時，LB平板上大部分菌落是藍(lán)色，有效克隆比例在40.36%左右，對應(yīng)酶切連接效率為56.03%，因為體系中多余的受體載體會作為空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌以藍(lán)色菌落的形式存在，導(dǎo)致有效克隆比例下降；將元件供體載體與受體載體摩爾比提升到1∶1時，發(fā)現(xiàn)有效克隆比例增加到90.80%，酶切連接效率提升到98.16%，達(dá)到可用水平，但LB平板上仍有小部分藍(lán)色菌落；進(jìn)一步將元件供體載體與受體載體摩爾比提高到3∶1時發(fā)現(xiàn)，有效克隆比例在98.50%左右，LB平板上幾乎沒有藍(lán)色菌落，酶切連接效率達(dá)到99.86%。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，元件供體載體與受體載體摩爾比3∶1時可以有效提高GB體系的有效克隆比例（P＜0.0001，圖4）。所以我們建議在后續(xù)的實驗中元件供體載體和受體載體按3∶1的摩爾比加入。

圖4 元件供體載體和受體載體摩爾比對有效克隆比例的影響

3 討論

GoldenBraid（GB）標(biāo)準(zhǔn)化組裝系統(tǒng)利用BsaI和BsmBI兩種不同的ⅡS型內(nèi)切酶可以實現(xiàn)連續(xù)的迭代組裝以構(gòu)建多基因表達(dá)載體，平臺和工具包的不斷改進(jìn)使GB成為最快速簡便的DNA組裝方法之一［34］。Sarrion-Perdigones等［27］在一個反應(yīng)中同時將5個標(biāo)準(zhǔn)化元件和一個受體載體組裝在一起，通過二進(jìn)制組裝后得到14.5 kb的多基因結(jié)構(gòu)。GB原則上允許多基因結(jié)構(gòu)的無限增長，唯一的限制是載體能力和細(xì)菌的生物限制［28］，但是隨著元件的數(shù)量和大小的增加反應(yīng)效率會降低，當(dāng)GB反應(yīng)中存在線性化片段時效率也會降低［26］，因此多個DNA線性片段的組裝較為困難，與此同時高昂的ⅡS限制性內(nèi)切酶費用也使GB反應(yīng)的成本一直居高不下［35］。提高GB反應(yīng)的效率不僅可以解決DNA線性片段組裝的問題，還可以減少內(nèi)切酶的用量以節(jié)約成本。

作為一個限制-連接組裝反應(yīng)（圖5），限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的工作效率對GB反應(yīng)是至關(guān)重要的。當(dāng)限制性內(nèi)切酶不能有效工作時，大部分底物不能被消化，導(dǎo)致用于連接反應(yīng)的DNA線性片段的濃度較低，LB平板上總菌落數(shù)很多但有效克隆較少。當(dāng)T4 DNA連接酶不能有效工作時，消化得到的線性片段無法連接在一起，LB平板上總菌落數(shù)較少。

當(dāng)限制性內(nèi)切酶不能有效工作時，合適的酶切時間、緩沖體系和限制性內(nèi)切酶可以使更多的底物被消化連接。適當(dāng)?shù)脑黾用盖袝r間是提高酶切效率最簡便的方法［36］。酶切時間增加到4 min時，有更多的元件被釋放出來連接成目標(biāo)載體，有效克隆比例和酶切連接效率明顯提高，有效克隆比例已經(jīng)達(dá)到72.59%（BsaI），考慮到有效克隆比例的最高理論值為100%，繼續(xù)延長時間無法再明顯提升實驗效果，反而會大幅度增加實驗耗時，綜上考慮采用4 min酶切時間，后續(xù)實驗中再通過其他優(yōu)化策略進(jìn)一步提高反應(yīng)效率。緩沖體系是決定酶是否發(fā)揮其最大催化效能的關(guān)鍵因素，選用合適的緩沖體系可以有效提升酶的催化能力。ligase buffer是T4 DNA連接酶最佳緩沖體系，但并不是內(nèi)切酶的最優(yōu)緩沖體系，可能會導(dǎo)致酶切不充分。FastDigest Buffer通過優(yōu)化緩沖鹽的配伍和牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）［36-39］的添加使內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶在其中可以同時保持幾乎100%的活性，產(chǎn)品說明書建議使用T4 DNA連接酶時需要在反應(yīng)體系中加入0.5 mmol/L ATP（https：//www.thermofisher.com），為 保險起見，本實驗我們加入了1 mmol/L ATP以保證T4 DNA連接酶可以高效工作。此時反應(yīng)酶切連接效率已經(jīng)達(dá)到99%，為了節(jié)約成本，我們考慮將內(nèi)切酶的用量減半。在相同用量條件下，F(xiàn)astDigest限制性內(nèi)切酶進(jìn)行底物DNA徹底酶切所需時間只有5-15 min，不到fermentasBsmBI和NEBBsaI的1/4［40-41］，因此在用量減半（0.5 μL）的情況下，仍然可以實現(xiàn)高效酶切，達(dá)到保持較高酶切連接效率的同時降低實驗成本的目的。

當(dāng)限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶都在有效工作時，GB反應(yīng)中元件供體載體和受體載體之間的配伍成為影響酶切連接效率的一個重要因素［26］。此時底物基本被消化用于連接，目標(biāo)重組載體產(chǎn)生速率r1和完整受體載體的產(chǎn)生速率r2可用公式表示：

二者的比值R代表了連接反應(yīng)中目標(biāo)重組載體的選擇性，在充分酶切條件下，C元件濃度等于元件供體載體濃度，CLacZ濃度等于受體載體濃度，此時R可表示為：

圖5 元件組裝示意圖

反應(yīng)中目標(biāo)重組載體的選擇性與底物的摩爾比有關(guān)，元件供體載體和受體載體摩爾比越大，目標(biāo)重組載體的選擇性就越高，獲得的有效克隆比例也就越高，對應(yīng)酶切連接效率也就越高。原方案中各種底物質(zhì)粒的加入量都為75 ng，由于不同元件之間在DNA長度上存在較大差異，對應(yīng)分子量不同，因此在各個組裝實驗中元件供體載體和受體載體的摩爾比各不相同，這可能成為組裝效率不穩(wěn)定的一個重要影響因素［26，42］。因此建議在GB反應(yīng)中使用摩爾比來計算底物配伍。優(yōu)化后反應(yīng)體系最終酶切連接效率已經(jīng)接近100%，相比于初始反應(yīng)體系酶切連接效率提高了10倍以上。通過本研究既提高了GB反應(yīng)酶切連接效率，又節(jié)約了實驗成本，為實現(xiàn)基因突變體元件的篩選建庫提供了一種高效的工具。

4 結(jié)論

本研究確定了更為高效的GB反應(yīng)體系：FastDigest限制性內(nèi)切酶0.5 μL，F(xiàn)astDigest Buffer 1 μL，ATP 1 mmol/L，元件供體載體和受體載體摩爾比設(shè)定為3∶1，PCR儀器的熱循環(huán)程序設(shè)定為37℃4 min，16℃ 5 min，25個循環(huán)。在此體系下最終酶切連接效率高達(dá)99.86%，接近100%，比優(yōu)化前提高了10倍以上。為降低實驗成本，在進(jìn)行一些相對簡單的合成生物學(xué)通路的構(gòu)建時可以進(jìn)一步縮減限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)時間或者使用量。