滇牡丹種子實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選與驗(yàn)證

潘沫晗 陸添權(quán) 田波

（1. 中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京101408）

滇牡丹（Paeonia delavayi）屬芍藥科芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.MoutanDC.）植物，是中國(guó)西南地區(qū)特有的野生資源植物，是芍藥屬分布最南的一個(gè)牡丹類群［1］。作為一種民族藥材，其根皮入藥稱為丹皮，用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、退熱、止血、降糖，具有很好的藥用價(jià)值［2］。同時(shí)滇牡丹是油用牡丹新品種培育的重要種質(zhì)資源，也是開(kāi)發(fā)食用油的潛在木本油料植物資源之一。牡丹籽油作為一種多功能食用油，含有至少14種脂肪酸成分，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸等，其中亞麻酸的含量極高［3］，油脂品質(zhì)優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)豐富。目前，關(guān)于滇牡丹的研究主要集中在栽培學(xué)［4］、孢粉學(xué)［5］、病害防治［6］及遺傳多樣性［7-8］方面，關(guān)于滇牡丹的分子生物學(xué)研究的報(bào)道較少。目前將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于植物基因功能的研究較為普遍，而研究植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵基因的功能是開(kāi)發(fā)利用這些基因的前提。功能基因表達(dá)量及表達(dá)模式是確定基因功能的重要指標(biāo)，內(nèi)參基因是檢測(cè)基因表達(dá)量的必要參照，在檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)水平變化中起到校正作用，篩選合適的內(nèi)參基因是研究基因表達(dá)的關(guān)鍵，能夠減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高結(jié)果可靠性［9］。因此，篩選相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參是研究基因表達(dá)分析的前提［10］。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠且成本低廉的特點(diǎn)。目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）自從被發(fā)現(xiàn)后［11］，就迅速成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)，并被進(jìn)一步應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。目前在植物學(xué)研究中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，常見(jiàn)于植物抗逆機(jī)理研究、病原菌的檢測(cè)、植物與微生物互作機(jī)理研究、植物抗病性檢測(cè)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對(duì)植物基因表達(dá)的影響等方面［12］，解決了許多植物病理學(xué)和植物育種中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問(wèn)題。大量文獻(xiàn)表明熒光定量PCR技術(shù)已應(yīng)用于主要作物如缺素條件的水稻［13］，轉(zhuǎn)基因的玉米［14］、大豆［15］等，近年來(lái)在林木如杉木［16］和黃梁木［17］甚至中藥中如川續(xù)斷［18］、黃精［19］和穿心蓮［20］也都采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)展開(kāi)相關(guān)研究。

在植物的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，常用的內(nèi)參基因主要包括肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1α）及β微管蛋白基因（TUB）等，這些常用的內(nèi)參基因或參與細(xì)胞的基本代謝，或是作為細(xì)胞的組成成分，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和材料的特點(diǎn)選擇相應(yīng)合適的內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是得到準(zhǔn)確熒光定量分析結(jié)果的關(guān)鍵［21］?；诘崮档しN子發(fā)育過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，本研究選擇了8個(gè)看家基因（Housekeeping genes，HKGs）即GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1作 為 候 選內(nèi)參基因，選擇Ge Norm等3個(gè)程序評(píng)估了8個(gè)候選內(nèi)參基因在滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期的種子中熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，為檢測(cè)滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期種子中功能基因的表達(dá)分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集于云南省玉溪市澄江縣梁王山（東經(jīng)102°52'45"，北緯24°43'57"）野生分布的滇牡丹種子，牡丹開(kāi)花后每隔15 d取一次樣，分別取開(kāi)花后25、40、55、70和85 d的種子。將所取的滇牡丹種子樣品置于冷凍管中，放于液氮中速凍，凍存后備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 不同發(fā)育時(shí)期的滇牡丹種子樣品RNA提取采用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441），按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。獲得樣品總RNA。

1.2.2 總RNA的檢測(cè) 獲得總RNA后，用1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量。測(cè)定總RNA的濃度和純度，A260/280≈2.0-2.1，A260/230≈2.0，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示總RNA完整性較好，條帶清晰，無(wú)DNA和其他雜質(zhì)污染，28S與18S條帶比值約為2∶1，適合用作進(jìn)一步反應(yīng)。然后將提取的RNA樣品置于-80℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA 樣品反轉(zhuǎn)錄采用TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）試劑盒按說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體 系 如 下：總 反 應(yīng) 體 系20 μL，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，總RNA 1 μg，加RNA-free純水補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?2℃、15 min：95℃、3 min。反應(yīng)的第一步為去除基因組并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，第二步進(jìn)行了酶滅活，完成cDNA第一鏈的合成。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即cDNA置于-20℃下保存，以備進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。

1.2.4 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì) 根據(jù)滇牡丹種子全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（未發(fā)表）選擇了GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1共8個(gè)候選基因作為滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)如下：引物Tm 55±5℃，堿基長(zhǎng)度18-22 bp，GC含量介于40%-60%之間。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在200-300 bp之間。由擎科生物科技有限公司（昆明）負(fù)責(zé)合成，引物信息見(jiàn)表1、2。對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳驗(yàn)證其特異性。

表1 候選基因的名稱

表2 八個(gè)候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.5 熒光定量PCR 本實(shí)驗(yàn)采用QIAGEN 公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒，在384孔板的LightCycler 384 System上進(jìn)行點(diǎn)樣，在羅氏LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：總體系10 μL。包含上下游引物各1 μL，1 μL cDNA模板，5 μL 2× SYBR Green PCR Master Mix，1 μL QN ROX Reference Dye，1 μL RNase-free water。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、2 min；變性95℃、5 s；退火60℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)。延伸階段收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后獲得溶解曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 一般認(rèn)為擴(kuò)增效率E應(yīng)介于90%-110%之間。采用GeNorm等3個(gè)軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。首先計(jì)算ΔCt，根據(jù)公式E=2-ΔCt，將數(shù)據(jù)輸入Excel表格，導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行分析，獲得候選內(nèi)參基因的表達(dá)值，判定出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

選擇開(kāi)花后25、40、55、70、85 d的種子，利用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441）方法提取上述樣本的總RNA，并對(duì)獲得的RNA 的濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，獲得的RNA條帶（圖1），質(zhì)量完好可用做下一步反應(yīng)。

圖1 滇牡丹總 RNA 樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 內(nèi)參基因引物特異性驗(yàn)證

為了保證熒光定量分析的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序?qū)?個(gè)候選內(nèi)參基因的引物特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物段大小符合預(yù)計(jì)（圖2），無(wú)引物二聚體和非特異擴(kuò)增片段。

圖2 滇牡丹8個(gè)候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果

基因的表達(dá)豐度用Ct表示，對(duì)各基因的表達(dá)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（圖3），在滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期，8個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)水平存在一定變化，其中TUB基因的表達(dá)豐度相對(duì)較高，而CYC和EF2α內(nèi)參基因的表達(dá)豐度較低。

圖3 八個(gè)內(nèi)參基因在滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期的Ct值變化

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

為了篩選在種子不同發(fā)育時(shí)期均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本實(shí)驗(yàn)利用 GeNorm 和 Normfinder和BestKeeper軟件分別對(duì)開(kāi)花后 25、40、55、70和85 d 的種子中的 8 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。

2.3.1 GeNorm 分析結(jié)果 GeNorm軟件用M 值評(píng)估各表達(dá)穩(wěn)定性，分析結(jié)果顯示，8個(gè)候選內(nèi)參基因在種子不同發(fā)育時(shí)期中M值有所差異，根據(jù)表達(dá)穩(wěn)定性大小排序（M 值越小越穩(wěn)定），由高到低依次為CYC/EF2（0.824）＞RPL1（1.087）＞PEPC（1.296）＞GAPC（1.545）＞TUB（1.625）＞ACP（1.801）＞ACT（1.958）（圖4）。

圖4 GeNorm 軟件分析滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值排序

GeNorm 軟件生成內(nèi)參基因的配對(duì)變異數(shù)（Vn/n+1）柱形圖，可以根據(jù)柱形圖選擇的最適合內(nèi)參基因數(shù)目。GeNorm軟件可以通過(guò)分析計(jì)算所得的配對(duì)差異值Vn/n+1來(lái)確定該實(shí)驗(yàn)條件下所需內(nèi)參基因的最適個(gè)數(shù)，以減少使用單一內(nèi)參基因所引起的偏差和波動(dòng)。選擇閾值為0.15，當(dāng)Vn/n+1＞0.15，表明最適合的內(nèi)參基因個(gè)數(shù)是n+1個(gè)；Vn/n+1＜0.15，表明最適合的內(nèi)參基因有n 個(gè)。GeNorm柱形圖分析結(jié)果顯示當(dāng)選擇 V2/3值（0.383）大于程序所推薦值 0.15（圖 5），最合適的內(nèi)參組合基因數(shù)目是 3個(gè)。滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是RPL1，EF2和CYC，最不穩(wěn)定的基因是ACT。

圖5 GeNorm軟件分析確定滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期的最適內(nèi)參基因的數(shù)目

2.3.2 NormFinder 分析結(jié)果 Normfinder 是基于方差分析對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性直接進(jìn)行評(píng)價(jià)，通CYC和EF2α作為內(nèi)參基因， 選擇滇牡丹種子中油脂合成途經(jīng)相關(guān)基因(表5)，設(shè)計(jì)引物（表6），對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果表明，以不同基因作為內(nèi)參，5個(gè)油脂合成途徑相關(guān)基因在RTqPCR分析中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，相對(duì)表達(dá)量結(jié)果相近（圖6）。

表5 關(guān)鍵基因的名稱

3 討論

目前，應(yīng)用最為廣泛的基因表達(dá)分析手段是熒光定量PCR技術(shù)，但是 RNA 不完整、污染以及反轉(zhuǎn)錄效率低等因素常影響其準(zhǔn)確性。因此，選用合適的內(nèi)參基因是保證熒光定量PCR分析結(jié)果可靠性過(guò)程序計(jì)算獲得穩(wěn)定值（Stability，S），穩(wěn)定值越低代表基因的表達(dá)穩(wěn)定性越高，但該軟件只能選擇一個(gè)合適的內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)。分析結(jié)果顯示，TUB內(nèi)參基因最穩(wěn)定，而ACT基因最不穩(wěn)定（表 3）。該軟件的結(jié)果與 GeNorm得出的結(jié)果相比稍有不同，這可能與2種軟件的計(jì)算方法的差異有關(guān)。但關(guān)于ACT基因在8個(gè)基因中表達(dá)最不穩(wěn)定的結(jié)果。兩個(gè)軟件的結(jié)果是一致的。

表3 NormFinder 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期種子內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.3.3 BestKeeper分析結(jié)果 BestKeeper軟件主要通過(guò)該程序計(jì)算可以獲得標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)（SD）和變異相關(guān)系數(shù)（CV）以及每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r），以這3個(gè)參數(shù)來(lái)判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。判定原則為相關(guān)系數(shù)越大、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；其中 SD 值的默認(rèn)閾值為 1.0，低于該值即認(rèn)為表達(dá)穩(wěn)定；當(dāng) SD＞1 時(shí)，則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。BestKeeper分析結(jié)果（表4）顯示只有CYC、EF2α基因的SD值小于1，根據(jù)r值排序，EF2α＞CYC，綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)EF2α和CYC基因表達(dá)最穩(wěn)定，而ACT基因在8個(gè)內(nèi)參基因中表達(dá)穩(wěn)定性最差。2.4 候選目標(biāo)基因RT-qPCR分析

以通過(guò)穩(wěn)定性綜合評(píng)價(jià)得到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的的重要前提［22］。為挖掘適用于滇牡丹種子不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，本研究以滇牡丹不同發(fā)育階段的種子為材料，選擇8個(gè)候選內(nèi)參基因，利用 Genorm、Normfinder和BestKeeper 軟件分析了它們?cè)诘崮档こ煞N子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性。根據(jù)各軟件評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［23-25］，綜合3個(gè)軟件分析的結(jié)果，成功篩選出了符合要求的內(nèi)參基因。3個(gè)軟件分析的結(jié)果表明，在種子的不同發(fā)育時(shí)期中能夠穩(wěn)定表達(dá)的基因是CYC基因和EF2α基因，3個(gè)軟件分析結(jié)果都顯示ACT基因的穩(wěn)定性較差，說(shuō)明該基因不適合作為滇牡丹種子的內(nèi)參基因。

表4 BestKeeper 軟件分析滇牡丹不同發(fā)育時(shí)期種子內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

表6 五個(gè)關(guān)鍵基因的引物序列

圖6 滇牡丹種子中油脂合成相關(guān)基因的熒光定量PCR分析結(jié)果（分別以CYC和EF2α為參照）

肌動(dòng)蛋白ACT基因是植物中被廣泛應(yīng)用的內(nèi)參基因。在“金魁”獼猴桃（Actinidia deliciosa）中表達(dá)最為穩(wěn)定［26］，在不同發(fā)育時(shí)期的銀杏（Ginkgo biloba）雌株葉片中也是表達(dá)最穩(wěn)定［27］，該結(jié)論同樣也在4種木本油料種子油茶（Camellia oleifera）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、文冠果（Xanthoceras sorbifolia）和油用牡丹（Paeonia suffruticosa）中得到了驗(yàn)證［28］，而在本實(shí)驗(yàn)中ACT基因的表達(dá)極不穩(wěn)定，這進(jìn)一步驗(yàn)證了同一內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)材料中表達(dá)穩(wěn)定性不一定相同的結(jié)論。

CYC基因（親環(huán)素），又稱環(huán)孢素A結(jié)合蛋白，也寫作CYP等，具有多種生物學(xué)活性，存在于細(xì)胞質(zhì)和各個(gè)細(xì)胞器內(nèi)。CYC基因在甜櫻桃的營(yíng)養(yǎng)器官中是最適宜的內(nèi)參基因［28］，在大豆種子發(fā)育過(guò)程中也是表達(dá)最穩(wěn)定的［15］，這都與本研究的結(jié)果一致。而EF2α基因（Translation elongation factor 2），即翻譯延伸因子2，也寫作EF2，是編碼蛋白質(zhì)合成過(guò)程中一類蛋白質(zhì)因子的基因。因?yàn)楸磉_(dá)量恒定，所以是熒光定量PCR中常用的內(nèi)參基因之一。之前有關(guān)于蘿卜的研究發(fā)現(xiàn)，在不同品種、組織類型、光周期和春化處理及不同發(fā)育階段驗(yàn)證8個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性時(shí)，EF2在不同的實(shí)驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)［29］。本實(shí)驗(yàn)中，EF2同樣在滇牡丹種子的不同發(fā)育時(shí)期穩(wěn)定表達(dá)。

已有研究報(bào)道了牡丹組中不同物種基因表達(dá)分析的最適內(nèi)參基因，王彥杰等［30］以牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的不同組織（根、莖、葉和花瓣）為材料，利用熒光定量 PCR技術(shù)探討了5種常用看家基因的表達(dá)情況，認(rèn)為各實(shí)驗(yàn)條件下使用UBQ和GAPDH兩個(gè)表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合。評(píng)估牡丹的10個(gè)內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)GAPDH和UBC被認(rèn)為是在“鳳丹”（Paeonia ostii）和“西施”（Paeonia ostii）品種中最穩(wěn)定的兩個(gè)參考基因［31］。張莞晨等［27］研究油用牡丹（Paeonia suffruticosa）種子的7個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)表達(dá)最穩(wěn)定的基因是ACT。這些與本實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果有很大的差異，有可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用的材料不同，說(shuō)明滇牡丹與油用牡丹雖然同屬于芍藥屬植物，但二者之間存在一定的差異性。本研究以篩選到的表現(xiàn)最穩(wěn)定的CYC和EF2α基因作為內(nèi)參，對(duì)滇牡丹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選到的油脂合成途徑中的部分相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)5個(gè)油脂合成相關(guān)的基因的熒光定量PCR結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，表達(dá)量相近，表明本研究篩選出的內(nèi)參基因可用作滇牡丹之間油脂合成相關(guān)基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，也為牡丹組其他植物油脂合成相關(guān)基因表達(dá)量分析時(shí)內(nèi)參基因的篩選提供了參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3個(gè)軟件評(píng)估了8個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因在滇牡丹種子中表達(dá)的穩(wěn)定性，獲得了兩個(gè)最適合滇牡丹種子的內(nèi)參基因CYC和EF2。