ATP 依賴型鉀通道對心肌缺血再灌注損傷介導的細胞凋亡及相關蛋白的影響

聶曉麗，藺雪峰，李陽

(內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭)

0 引言

缺血性心臟病是死亡率極高的疾病[1]，缺血再灌注損傷(MIRI)是引起缺血性心臟病的重要機制，在這個過程中可引起心肌超微結(jié)構不可逆性損傷，造成心肌代謝、功能及電生理等諸多方面的影響。在急性冠脈綜合征治療中，可通過各種治療辦法降低死亡率，但MIRI 仍無法避免，可加重缺血心肌結(jié)構的損傷及功能代謝障礙，是導致缺血心肌無法達到理想治療效果的主要難題[2]。大量基礎實驗與臨床研究結(jié)果顯示，鉀離子通道可能在調(diào)節(jié)新陳代謝方面發(fā)揮了新的作用[3]，并且可以抑制Ca2+超載[4]，為臨床防治MIRI 提供新的理論依據(jù)，并將推動該領域產(chǎn)生巨大的進展。

1 實驗方法

通過細胞培養(yǎng)、建立缺氧/復氧細胞模型、在高倍顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、MTT 法檢測細胞凋亡、Western Blot 檢測caspase-3、bax、bcl-2 表達。

2 結(jié)果

(1)MTT 法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示：在經(jīng)過缺氧處理后的H9C2 心肌細胞相對增殖率發(fā)生顯著變化，并且隨著復氧時間的不斷延長，其相對增值率也在逐漸下降。在缺氧4h 復氧3h 后下降至50%～60%(P＜0.05)，因此可將缺氧4h 復氧3h 作為后繼實驗的觀測點；在鉀離子通道抑制劑處理后，缺氧4h復氧3h 時H9C2 細胞的相對增殖率顯著降低(P＜0.05)。

表1 MTT 法檢測鉀離子通道抑制劑對H9C2 細胞相對增殖率的影響

(2)Western Blot 檢測 caspase-3、bax、bcl-2 的表達

3 討論

心肌細胞凋亡參與了許多心臟疾病如心力衰竭、心肌梗死、心肌病、心律失常等疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并且細胞凋亡在MIRI 進展中也發(fā)揮著重要作用[5-6]。當供應心臟的血管發(fā)生閉塞后會使流向心臟的供血和氧氣減少，進一步導致心肌缺血，在60 s 內(nèi)心肌的收縮力將逐漸開始喪失，其他變化則需更長的時間，可能會發(fā)生再灌注(血流恢復)，但在完全阻塞血流后20-40 分鐘內(nèi)會發(fā)生活力的喪失(不可逆性損傷)。心肌收縮力的喪失和致命性心律失常的出現(xiàn)是造成大多數(shù)猝死事件的主要原因，缺血最終導致心肌細胞壞死并形成梗塞。

本研究發(fā)現(xiàn)鉀離子通道抑制劑降低了Bcl-2 水平，加強Bax 與線粒體聯(lián)系，增加了心肌細胞的凋亡，對MIRI 發(fā)揮促進損傷作。但鉀離子通道如何在細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮作用還不完全清楚。目前KATP 通道的作用備受關注，可能在調(diào)節(jié)新陳代謝方面發(fā)揮了新的作用[7]。在各種類型的KATP 通道中，就其核苷酸敏感性，其生物物理性質(zhì)以及對藥理的敏感性而言，在不同的組織和細胞類型上彼此之間存在顯著差異。使用新鮮分離的成年大鼠心肌細胞建立與體內(nèi)IR 條件相似的A/R 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mitoKATP 開放或關閉可引發(fā)能量代謝相關基因(MT-ND6，Idh2 和Acadl)的改變，說明KATP 通道可干擾能量細胞的能量代謝，在MIRI 期間為心肌細胞保持能量產(chǎn)生與消耗的平衡。mitoKATP 是線粒體內(nèi)膜上的鉀離子通道，在正常情況下處于關閉的狀態(tài)，細胞內(nèi)ATP 濃度升高時可將其顯著抑制，但該通道在細胞缺血缺氧即ATP 濃度降低時可被激活，從而降低了ROS 的產(chǎn)生。由此可以看來，mitoKATP 的深入研究可以為減輕MIRI 提供新的理論依據(jù)。心血管系統(tǒng)中存在多種KATP 通道亞型，每種亞型在心臟的各個區(qū)域有其專門的傳導系統(tǒng)。在大多數(shù)研究中，KATP通道開放劑在心臟缺血期間具有心臟保護作用。KATP 通道是許多細胞和組織功能不可或缺的部分，該通道的開放與抗心肌缺血再灌注損傷及細胞凋亡密切相關。因此，KATP 通道在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理作用。證明了AMPK-Kir6.2/KATP 信號通路介導了白藜蘆醇對心臟的保護作用，而含Kir6.2 的K-ATP 通道在白藜蘆醇保護心臟的過程中發(fā)揮了重要的作用，不但可明顯降低血清LDH 和CK 活性和心肌梗死的面積，而且可抑制缺氧/復氧引發(fā)的細胞凋亡。最近的研究結(jié)果表明丹參多酚酸鹽可以顯著提高H/R 損傷后H9C2 大鼠心肌細胞的活性，減少H/R 損傷帶來的危害，而應用mitoKATP 特異性的阻滯劑5-HD 可拮抗上述的心臟保護作用。研究顯示丹參多酚酸鹽可下調(diào)P53、Bax 的mRNA 表達水平，上調(diào)Bcl-2 的mRNA 表達水平，同時也可增加PI3K、Akt 的mRNA 表達水平，表明丹參多酚酸鹽可能依賴于PI3K/Akt 及mitoKATP 的通路來調(diào)節(jié)細胞凋亡的相關基因表達，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞的程序性死亡，為臨床工作中保護心肌缺血再灌注損傷打下了堅實的理論基礎。

圖1 bax/β-actin

圖2 bcl-2/β-actin

圖3 cas pase-3

圖4 bcl-2/bax

線粒體KATP 通道的主要功能可能允許K +轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)中，這與K + / H +反向轉(zhuǎn)運蛋白的操作協(xié)同作用，可能參與線粒體體積體內(nèi)平衡。研究發(fā)現(xiàn)，通過影響mitoKca和mtioKATP 介導線粒體功能與心肌動作電位形成機制，mitoKca 通道開放可緩解再灌注心律失常癥狀，抑制動作電位發(fā)生，延遲心肌缺血再灌注心律失常的出現(xiàn)，縮短缺血再灌注心律失常的持續(xù)時間。

綜上所述，ATP 依賴型鉀通道在心肌缺血再灌注損傷介導的細胞凋亡過程中發(fā)揮著至關重要的作用，探討其具體病理生理機制并研究ATP 依賴型鉀通道在缺血再灌注所致心律失常監(jiān)測、心衰、治療及預后的評估提供了新的治療干預靶點，為在臨床工作中治療心肌缺血再灌注損傷開拓臨床思維提供了更多新的選擇。