葡萄皮爾斯病的研究進(jìn)展

楊桂蘭，昝林生，趙艷俠，亓桂梅*

（1. 山東省葡萄研究院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100；2. 德州學(xué)院，德州 253001）

皮爾斯?。≒ierce's disease，PD）是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，由細(xì)菌學(xué)家Pierce于1892年首次在葡萄上發(fā)現(xiàn)，因此加州食品農(nóng)業(yè)部將其命名為皮爾斯病。該病主要發(fā)生在美國的加州和東南部地區(qū)，在墨西哥、中南美洲的一些國家，以及法國、新西蘭也有發(fā)生。2002年，我國臺(tái)灣有發(fā)現(xiàn)皮爾斯病的報(bào)道[1]。

1978年，Davis等[2]從葡萄中分離出致病菌。1987年，Wells等[3]對(duì)其進(jìn)行分類，命名為木質(zhì)部難養(yǎng)菌(Xylella fastidiosa)。木質(zhì)部難養(yǎng)菌是嚴(yán)格的需氧菌，屬于變形菌門（Proteobacteria）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、木桿菌屬（Xylella），是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，生長緩慢，桿狀，大小為0.25～0.35μm×0.9～3.5μm，無鞭毛，通過Ⅳ型菌毛運(yùn)動(dòng)。木質(zhì)部難養(yǎng)菌包括許多亞種：X. fastidiosasubsp.fastidiosa（Xff）；X. fastidiosasubsp.Sandyi（Xfs）；X. fastidiosasubsp.pauca（Xfp）；X. fastidiosasubsp.multiplex（Xfm）；X. fastidiosasubsp.Tashke和X.fastidiosasubsp.morus，其中，Xff是葡萄皮爾斯病的致病菌。除此之外，可能還有別的亞種存在，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)。

許多吸食植物汁液的昆蟲，比如葉蟬、沫蟬等都是木質(zhì)部難養(yǎng)菌的載體。當(dāng)它們從感染了皮爾斯病的植株中攝食時(shí)，木質(zhì)部難養(yǎng)菌就會(huì)粘附在其口器上，然后在其前腸中生存和繁殖[4-6]，并隨著昆蟲的取食而傳播到其他植株上。感病植株表現(xiàn)葉緣干枯、變黃，葉片最終脫落，通常會(huì)在1～5年內(nèi)死亡，給葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。自從皮爾斯病被發(fā)現(xiàn)以來，僅在加州就有28個(gè)縣有該病發(fā)生。據(jù)報(bào)道，1994—2000年，該病摧毀了加州北部超過400 hm2的葡萄園，加州南部地區(qū)每年損失約3790萬美元。

韓陽陽等[7]基于Maxent模型對(duì)葡萄皮爾斯病在中國的適生性分析認(rèn)為，我國的黃淮海地區(qū)和長江中下游地區(qū)是皮爾斯病的潛在分布區(qū)，因此，對(duì)該病的研究和防范不能掉以輕心。目前，包括我國在內(nèi)的世界許多國家，已經(jīng)將皮爾斯病列為檢疫性病害，并且制定相應(yīng)的檢疫法規(guī)和檢疫措施。為了更好地掌握皮爾斯病的發(fā)病情況，進(jìn)行有效預(yù)防，本文對(duì)皮爾斯病的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為葡萄皮爾斯病的檢測(cè)、防治和后續(xù)研究提供參考。

1 葡萄皮爾斯病的癥狀和發(fā)病機(jī)理

1.1 癥狀

葡萄皮爾斯病的癥狀隨著感病葡萄品種的特點(diǎn)以及感病時(shí)間和季節(jié)因素而變化。與當(dāng)季感病植株相比，上一季感病植株通常會(huì)表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀。

起初，感病植株葉緣突然干枯、變黃（紅色品種中會(huì)出現(xiàn)一條紅色帶）[8-9]。隨后，焦枯的葉片掉落，通常從葉柄的遠(yuǎn)端開始脫落，留下葉柄附著在枝條上[10]。感病嚴(yán)重的植株在夏末葉片就全部脫落。在感病第一年，癥狀局限在一個(gè)或幾個(gè)枝條，但隨著時(shí)間的推移，范圍逐漸擴(kuò)大。感病組織中的細(xì)菌濃度隨著季節(jié)的變化而變化，春末夏初達(dá)到最大值。通常在感病的前4周，在新芽中檢測(cè)不到木質(zhì)部難養(yǎng)菌，但能在成熟組織中檢測(cè)到[9]。感病枝條呈現(xiàn)綠色和褐色相間[10]，枝條的頂端最終枯死，新長出的枝條短、矮化。此外，葡萄產(chǎn)量逐步減少，大多數(shù)果穗干枯。感病植株通常在1～5年內(nèi)死亡[11]。

1.2 感病植株的生理變化

研究發(fā)現(xiàn)，皮爾斯病感病植株比正常植株生長勢(shì)減弱，新梢數(shù)量減少。清晨，正常葉片和感病葉片的氣孔張力沒有顯著區(qū)別，隨后感病葉片的氣孔張力迅速上升，而正常葉片的氣孔張力相對(duì)不變。感病葉片的蒸騰作用和光合作用受到抑制，脫落酸、葡萄糖、果糖、鈣離子和鎂離子濃度升高，鉀離子濃度降低。感病葉片失綠組織中的葡萄糖和淀粉的濃度低于綠色組織或者正常葉片。感病葉片中葉綠素含量降低與電解質(zhì)滲出率、脂類過氧化和氧自由基的增加有關(guān)[12-13]。

1.3 感病植株木質(zhì)部的形態(tài)學(xué)變化

木質(zhì)部難養(yǎng)菌侵入宿主植物的木質(zhì)部中，IV型菌毛使其沿著木質(zhì)部上下移動(dòng)。它們?cè)谀举|(zhì)部中大量繁殖，形成聚合物。感病植株的木質(zhì)部中形成果膠凝膠（Pectin Gels）和侵填體（Tylose），從而阻止了病菌傳播，使某些葡萄品種具有對(duì)皮爾斯病的耐受性，但是也阻止感染部位的水分運(yùn)輸[14]。

1.4 感病機(jī)理

起初科學(xué)家們認(rèn)為，皮爾斯病癥狀是由于病菌形成的聚合物以及病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的果膠凝膠和侵填體阻塞導(dǎo)管，導(dǎo)致水分虧缺引起的[15-16]。這就意味著癥狀的嚴(yán)重程度與病菌濃度成正相關(guān)。但事實(shí)上，它們之間的關(guān)系非常復(fù)雜。首先，Thorne等[11]發(fā)現(xiàn)，皮爾斯病的癥狀與水分虧缺的癥狀并不相同；其次，許多研究表明，被Xff和果膠凝膠阻塞的導(dǎo)管只占很小的比例[8,17]；另外，Gambetta等[18]發(fā)現(xiàn)，皮爾斯病癥狀的嚴(yán)重程度與Xff濃度的關(guān)系非常小。Xff無規(guī)律地分布在整個(gè)葉片中，有明顯木質(zhì)部阻塞的葉片中Xff濃度可能會(huì)很低。皮爾斯病機(jī)理的另外一種假說是，感病葉片產(chǎn)生大量的乙醇，誘導(dǎo)木質(zhì)部產(chǎn)生果膠凝膠和侵填體，皮爾斯病癥狀是植株對(duì)于果膠凝膠和侵填體的出現(xiàn)而產(chǎn)生的系統(tǒng)反應(yīng)的結(jié)果。植物毒素和細(xì)胞程序性死亡也被認(rèn)為參與皮爾斯病癥狀的誘導(dǎo)。

2 葡萄皮爾斯病檢測(cè)和鑒定方法

2.1 顯微鑒定

在感染的早期階段，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出病原菌，對(duì)于阻止病原菌進(jìn)一步傳播非常重要。但是木質(zhì)部難養(yǎng)菌的檢測(cè)和鑒定并不容易。因?yàn)樵摬【L緩慢，通常需要2—3周的時(shí)間才能在瓊脂培養(yǎng)基上得到菌落；其次，許多常用培養(yǎng)基不適合該病菌的生長，需要采用選擇性培養(yǎng)基（PD2、PW、CS20) 進(jìn)行培養(yǎng)[19]。木質(zhì)部難養(yǎng)菌細(xì)胞很小，只能使用暗視野、相差顯微鏡[3]進(jìn)行直接鑒定。

2.2 免疫方法檢測(cè)

免疫方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫熒光技術(shù)也可以用來檢測(cè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌。Buzkan等[20]采用免疫熒光技術(shù)分別從接種3周的抗性葡萄品種‘F8909-08’和易感葡萄品種‘霞多麗’中檢測(cè)到木質(zhì)部難養(yǎng)菌。但是要想在感染早期準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出病原菌，經(jīng)典的免疫方法就不夠靈敏了。而且，大多數(shù)免疫方法僅在物種水平有效。

2.3 分子檢測(cè)技術(shù)

2.3.1 特異引物PCR

感病植株中的木質(zhì)部難養(yǎng)菌可以用特異引物PCR來檢測(cè)。1994年，F(xiàn)irrao等[21-22]通過PCR擴(kuò)增16S rDNA和細(xì)菌DNA上未知功能的片段檢測(cè)該病菌。隨后，越來越多的特異引物被設(shè)計(jì)出來，其中16S rDNA和16S-23S的間隔子是使用最頻繁的目的基因[23-24]。由于細(xì)菌基因組的一些變異，尤其是引物識(shí)別位點(diǎn)的突變，使PCR檢測(cè)容易出現(xiàn)假陰性。Livingston等[25]采用gyrB和一套看家基因的引物進(jìn)行檢測(cè)，彌補(bǔ)了用單個(gè)基因引物容易出現(xiàn)假陰性的缺陷。

通過設(shè)計(jì)特異PCR引物，能夠檢測(cè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌的不同種、亞種甚至同一亞種的不同菌株。2006年Hernandez等[26]用3個(gè)目的基因的多對(duì)引物組合來區(qū)分感染葡萄、巴旦木和夾竹桃的木質(zhì)部難養(yǎng)菌。通過這種方法，不同亞種的木質(zhì)部難養(yǎng)菌能被區(qū)分開來，甚至multiplex亞種的ALSI和ALSII兩個(gè)菌株也能被區(qū)分開來。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）

RT-PCR同特異引物PCR一樣，具有很高的靈敏度和特異性，但是擴(kuò)增產(chǎn)物要短一些，而且需要用熒光染料（SYBR green 或TaqMan）標(biāo)記探針。RT-PCR能夠研究木質(zhì)部難養(yǎng)菌在感病植株中的時(shí)空分布。通過RT-PCR可以檢測(cè)出不同時(shí)間、不同植物組織中的病菌量，將其與癥狀相結(jié)合，就能找出不同抗性植株之間的差別。2002年，Schaad等[27]直接用葡萄枝條次生木質(zhì)部的汁液，不用提取DNA就能進(jìn)行RT-PCR，并且能夠從無癥狀的植株中檢測(cè)到木質(zhì)部難養(yǎng)菌，其檢出率為26%。

2.3.3 限制片段長度多態(tài)性（RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）

19世紀(jì)80年代末90年代初，人們開始采用RFLP和RAPD技術(shù)研究木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株間的差異和致病性。1992年，Chen等[28]用RFLP技術(shù)從8種不同的宿主中鑒定出24個(gè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株。2006年，Picchi等[29]用RFLP技術(shù)從柑橘、葡萄等6種宿主中鑒定出43個(gè)不同的木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株。RAPD技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速，不需要復(fù)雜的設(shè)備和測(cè)序，在常規(guī)分析中使用廣泛，但不易區(qū)分關(guān)系比較近的菌株。例如，Chen等[30]比較來自柑橘、葡萄和桑樹的3個(gè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株群體的RAPD和16S rDNA序列，并分別繪制系統(tǒng)樹。采用RAPD技術(shù)得到的系統(tǒng)樹中，來自佛羅里達(dá)州、內(nèi)布拉斯加州和巴西的一共21個(gè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株被分為3個(gè)不同的群體，分別導(dǎo)致皮爾斯病、柑橘雜色褪綠病和桑樹葉焦病。而通過16S rDNA技術(shù)得到的系統(tǒng)樹只能區(qū)分出導(dǎo)致皮爾斯病和柑橘雜色褪綠病的兩個(gè)群體，導(dǎo)致桑樹葉焦病的群體被包含在導(dǎo)致皮爾斯病的群體中。

2.3.4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）

SSR是用來研究不同菌株遺傳變異性的技術(shù)。SSR由于串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量的多變性，使其在不同細(xì)菌菌株中具有很高的多態(tài)性，是分子研究的一個(gè)有效工具。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，花費(fèi)較少；DNA需要量相對(duì)較少，是共顯性標(biāo)記，可重復(fù)性好。2013年，Lin等[31]采用SSR技術(shù)對(duì)來自加利福尼亞州和得克薩斯州14個(gè)郡的Xff種群進(jìn)行結(jié)構(gòu)和多樣性的遺傳變異分析。結(jié)果顯示，從兩個(gè)州不同葡萄栽培地點(diǎn)分離到的Xff種群都具有高度的遺傳多樣性，得克薩斯州Xff種群的遺傳多樣性（0.835）高于加利福尼亞州（0.662）。

2.3.5 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

木質(zhì)部難養(yǎng)菌是首次完成全基因組測(cè)序的植物病原菌[32]。隨著越來越多的木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株的基因組序列的測(cè)序，SNP技術(shù)逐漸成為一種從分子水平研究該病原菌的有效方法。2006年，Doddapaneni等[33]采用SNP標(biāo)記分析分別來自葡萄、柑橘、夾竹桃和巴旦杏的4個(gè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株的基因組序列的變異。2015年，Montes等[34]采用SNP標(biāo)記技術(shù)評(píng)估來自柑橘和咖啡的木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株的遺傳多樣性。

2.3.6 多位點(diǎn)序列分型（MLST）

MLST技術(shù)是20世紀(jì)末研發(fā)出的一種新的鑒定病原菌的技術(shù)。通過分析一小部分（通常7個(gè)）看家基因核苷酸序列的差異來研究不同菌株的特征。MLST技術(shù)具有很高的分辨率，既適于分子流行病學(xué)研究，也可用于分子進(jìn)化學(xué)研究。它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、可重復(fù)性好。2005年，Schuenzel等[35]采用MLST方法對(duì)來自葡萄、夾竹桃、橡樹、桃樹、李樹和柑橘中的26個(gè)木質(zhì)部難養(yǎng)菌樣本的進(jìn)化關(guān)系、地理差異和分歧時(shí)間進(jìn)行分析。2010年，Yuan等[36]采用改良的MLST技術(shù)，對(duì)Xff和Xfs兩個(gè)亞種進(jìn)行遺傳多樣性分析。盡管SSR和MLST技術(shù)的研究結(jié)果相似，但是SSR適合在種群水平研究木質(zhì)部難養(yǎng)菌，而MLST更適合對(duì)亞種和菌株進(jìn)行研究。

3 葡萄皮爾斯病的防治措施

3.1 加強(qiáng)檢疫

對(duì)于引進(jìn)的葡萄種苗以及其他木質(zhì)部難養(yǎng)菌的宿主植物加強(qiáng)檢疫，防止皮爾斯病在新地區(qū)的引入和傳播。

3.2 加強(qiáng)栽培管理

在感病的初期，及時(shí)檢測(cè)和識(shí)別，將感病的枝條去除，或者整株移除，對(duì)皮爾斯病的控制非常重要。清除葡萄園里的雜草和附近木質(zhì)部難養(yǎng)菌的其他宿主植物，也是一種主要的預(yù)防策略，可以減少皮爾斯病的發(fā)生。其他栽培管理措施，如定期耕地和除草，可以抑制昆蟲載體幼蟲的生長[37]。Krugner等[38]提出，玻璃翅葉蟬是一種傳播皮爾斯病的主要害蟲，它傾向于花費(fèi)較少的時(shí)間去吸取木質(zhì)部汁液，所以通常會(huì)略過缺水植物。因此缺水灌溉可以有效減少皮爾斯病的發(fā)生。

3.3 用殺蟲劑殺死昆蟲載體

主要是采用一些傳統(tǒng)的殺蟲劑，比如吡蟲啉。據(jù)報(bào)道，殺蟲劑的使用對(duì)于加州皮爾斯病的控制非常關(guān)鍵，加州特美谷（Temecula）整個(gè)區(qū)域噴灑殺蟲劑能夠使葡萄產(chǎn)量在一定程度上恢復(fù)。Daugherty等[39]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄園里使用殺蟲劑能夠減少皮爾斯病，但是要在幾個(gè)生長季后才能看出效果。然而，長期使用殺蟲劑，不但對(duì)環(huán)境造成很大的污染，給其他的生物帶來負(fù)面影響，還會(huì)使昆蟲產(chǎn)生抗藥性。

3.4 熱湯處理（Hot Water Treatment，HWT )

將休眠的葡萄枝條用50 ℃的水浸泡45 min，可以清除Xff的感染[40]。

3.5 選育抗性品種

在美國東南部和墨西哥北部發(fā)現(xiàn)具有不同程度皮爾斯病抗性的野生葡萄種群。將野生葡萄品種中的皮爾斯病抗性基因引入到一些重要葡萄品種中的工作已經(jīng)開展，并卓有成效。2005年，Krivanek等[41]證實(shí)沙地葡萄（Vitis rupestris）和峽谷葡萄（Vitis arizonica）的雜交種具有皮爾斯病抗性，并且抗性可以遺傳。

加州大學(xué)戴維斯分校（UCD）的葡萄栽培學(xué)教授兼育種專家Walker等在加州食品農(nóng)業(yè)部的PD/GWSS董事會(huì)基金的支持下，已經(jīng)培育出5個(gè)抗皮爾斯病的新品種。這5個(gè)品種在溫室和田間試驗(yàn)中都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性，并且具有很高的品質(zhì)。2019年11月5日，Walker對(duì)這5個(gè)品種向美國專利及商標(biāo)局提出專利申請(qǐng)。這些品種有望在皮爾斯病流行的地區(qū)進(jìn)行種植。

3.6 應(yīng)用抗性砧木

運(yùn)用抗性砧木可以增強(qiáng)葡萄栽培品種對(duì)皮爾斯病的抗性，但是機(jī)理還不明確。據(jù)推測(cè)，砧木產(chǎn)生的某些物質(zhì)能夠通過木質(zhì)部汁液轉(zhuǎn)移到接穗，可能會(huì)影響木質(zhì)部難養(yǎng)菌的生長；砧木也可能通過影響接穗的活力和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收來提高其對(duì)病原菌的抵抗能力[42-43]；另外，抗性砧木還能降低木質(zhì)部難養(yǎng)菌從最初的感染位點(diǎn)向延長枝轉(zhuǎn)移的能力，從而限制了感病接穗中皮爾斯病的進(jìn)一步發(fā)展。

3.6.1 應(yīng)用野生型抗性砧木

木質(zhì)部難養(yǎng)菌起源于墨西哥北部和美國東南部。在這些地方，野生葡萄品種具有皮爾斯病抗性，即使被木質(zhì)部難養(yǎng)菌感染，也不會(huì)表現(xiàn)出癥狀。然而，這些野生葡萄品種的果實(shí)品質(zhì)不盡人意，比如口感差、漿果大小以及生長習(xí)性等具有缺陷。

2013年，Wallis等[44]研究發(fā)現(xiàn)，‘赤霞珠’分別嫁接到‘101-14MG’‘1103P’‘420A’或者‘Schwarzmann’砧木的皮爾斯病癥狀比分別嫁接到‘110R’ ‘5BB’或‘SO4’砧木的要輕?！级帑悺謩e嫁接到‘鹽河’（Salt Creek）或‘自由’（Freedom）砧木的皮爾斯病癥狀要比分別嫁接‘RS3’或 ‘Schwarzmann’砧木的輕。使用特定的砧木，即使只能使栽培種的皮爾斯病抗性略有提高，也可以顯著降低皮爾斯病造成的長期損失。

3.6.2 應(yīng)用皮爾斯病抗性轉(zhuǎn)基因砧木

隨著遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的出現(xiàn)，采用生物技術(shù)提高易感品種對(duì)皮爾斯病抗性的研究越來越多。Lindow等[45]發(fā)現(xiàn)，一個(gè)表達(dá)木質(zhì)部難養(yǎng)菌DSF合成酶的轉(zhuǎn)基因砧木能夠使接穗表現(xiàn)出較少的皮爾斯病癥狀，而且能夠減少病菌在植物體內(nèi)的移動(dòng)。另外，在溫室中CAP（Chimeric Antimicrobial Protein）或PGIP（Plant Polygalacturonase Inhibitory Protein）轉(zhuǎn)基因砧木能使接穗中病菌濃度降低，表現(xiàn)出很少的皮爾斯病癥狀[46]。一種表達(dá)溶菌抗菌肽（Cercoprin B）和木質(zhì)部難養(yǎng)菌外膜蛋白（MopB）的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因砧木，也使接穗表現(xiàn)出較少的皮爾斯病癥狀[47]。

近年來，對(duì)于皮爾斯病防治措施的研究越來越多。由于殺蟲劑的使用容易使昆蟲產(chǎn)生抗藥性，因此許多替代辦法應(yīng)運(yùn)而生，比如Surroundr WP、超敏蛋白（Harpin）和物理屏障（Screen Barrier）[48-50]。另外，還可以通過一些載體共生菌分泌的物質(zhì)抑制Xff的傳播[51]；用抗生素和抗菌肽殺死病菌[52]；利用植物內(nèi)生菌PsJN減輕皮爾斯病癥狀[53]；利用病毒和真菌抑制載體種群的擴(kuò)大等[54-55]。

4 展望

由于木質(zhì)部難養(yǎng)菌菌株間重組和廣泛的宿主范圍，使其對(duì)許多易感農(nóng)作物構(gòu)成很大的威脅。但是，目前還沒有針對(duì)細(xì)菌本身的有效控制措施，這一領(lǐng)域還有待科學(xué)家的研究。

目前，許多皮爾斯病的防治辦法還僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，還需要繼續(xù)完善并且探索如何應(yīng)用到田間。葡萄皮爾斯病的防治措施是否能夠應(yīng)用在其他的木質(zhì)部難養(yǎng)菌的宿主中也有待進(jìn)一步探究。此外，木質(zhì)部難養(yǎng)菌和宿主免疫系統(tǒng)之間的互作機(jī)理研究較少，也是一個(gè)值得探索的領(lǐng)域。