葡萄酒冷穩(wěn)定測試方法及研究進(jìn)展

李秀秀，夏廣麗*

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（葡萄酒學(xué)院），山東煙臺 264003）

葡萄酒中天然存在酒石酸鹽，主要成分包括酒石酸氫鉀（KHT）和酒石酸鈣（CaT）。葡萄汁經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)變成酒后，其中的酒石酸鹽處于飽和狀態(tài)，易隨溫度等條件的變化而析出，形成晶體沉淀[1]。葡萄酒中的沉淀對于消費者來說是不可接受的質(zhì)量缺陷，所以生產(chǎn)上通過特殊工藝處理來保證酒的冷穩(wěn)定性（Cold Stability）。CaT的溶解度受酒精度的影響顯著，溫度變化對其影響有限；而KHT的溶解度同時受溫度和酒精度的影響[2-3]，且含量占酒石酸鹽的絕大部分，是影響葡萄酒冷穩(wěn)定的主要因素。

葡萄酒KHT穩(wěn)定性處理工藝有兩大類型：（1）基于誘導(dǎo)的二次成核動力學(xué)的靜態(tài)和動態(tài)的“減法”過程，（2）通過增加葡萄酒天然酒石酸鹽保持能力的“加法”過程[4]。“減法”過程中的冷凍處理工藝是將葡萄酒的溫度降至接近冰點，即零下-4～5 ℃，保持幾天或1～2周的時間，然后保溫過濾去除析出的KHT晶體，使葡萄酒達(dá)到冷穩(wěn)定狀態(tài)。因為冷凍法耗能、耗時[5]，近年離子交換法以及電滲析法也被開發(fā)出來，逐步投入生產(chǎn)中[6]。人們對于“加法”過程持續(xù)進(jìn)行了研究：包括偏酒石酸（MTA）、甘露糖蛋白（MP）、羧甲基纖維素鈉（CMC）[7-9]、以及天冬氨酸（KPA）等[10]?！凹臃ā边^程并非去除葡萄酒的KHT，而是利用添加劑對葡萄酒酒石酸鹽的保持能力，抑制KHT沉淀。不同添加劑效果各有特點：偏酒石酸適合貨架期短的產(chǎn)品，在通常儲存條件下（10～18 ℃）的貨架期為12～18個月[5]；甘露糖蛋白來自于酵母，系葡萄酒中天然存在的成分[11]；羧甲基纖維素鈉在保證紅葡萄酒色素穩(wěn)定方面差強人意；聚天冬氨酸處理的葡萄酒電導(dǎo)率變化小，濁度顯著降低，色度有改善，是一個發(fā)展方向[12-13]?！凹臃ā边^程可以避免傳統(tǒng)冷凍法電能的消耗以及生產(chǎn)周期的延長，減輕對葡萄酒感官質(zhì)量的不利影響，降低生產(chǎn)成本。但上述添加劑在國內(nèi)還沒有獲得使用許可，需要科研及法規(guī)方面的工作來推動其在中國的應(yīng)用。

葡萄酒生產(chǎn)者通過冷穩(wěn)定測試來判斷葡萄酒是否穩(wěn)定，以指導(dǎo)生產(chǎn)。鑒于冷穩(wěn)定是一個相對的概念，目前有幾種常見的測試方法，但不同方法的置信度不同。孫建平等[14]比較了電導(dǎo)率法、飽和溫度法，以及冷藏法，發(fā)現(xiàn)不同的測試方法判定標(biāo)準(zhǔn)不能統(tǒng)一。劉振來等[15]對電導(dǎo)率法和飽和溫度法進(jìn)行了驗證分析。但全面闡述冷穩(wěn)定測試方法還未見報道。本文比較5種冷穩(wěn)定測試方法的原理、方法和適用范圍，并介紹相關(guān)研究進(jìn)展，以期為實際生產(chǎn)的工藝控制提供有益借鑒。

1 冷穩(wěn)定測試方法

1.1 冷凍-融化法（Freeze-thawing Test）

原理：冷凍-融化法是根據(jù)KHT溶解度受溫度影響的特性，直接采取降溫促使酒石結(jié)晶析出的破壞性試驗，并直接用視覺檢查晶體是否形成的方法。該方法并非模擬成品酒的實際儲存狀態(tài)，結(jié)果只是對葡萄酒當(dāng)前穩(wěn)定性的定性預(yù)測。

方法：葡萄酒經(jīng)過冷穩(wěn)定處理后，在過濾之前，取樣測試。樣品無菌過濾后，注入玻璃管或試劑瓶中開始冷凍。需要注意的是取樣后立即在低溫下進(jìn)行過濾，以避免酒樣升溫導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性[16-17]。樣品所需的冷凍時間取決于葡萄酒中的酒精含量。通常將葡萄酒放在冰箱中4～16 h不等，具體時長取決于產(chǎn)品酒精度含量及生產(chǎn)者對冷穩(wěn)定程度的經(jīng)驗和要求[18]。

將樣品從冰箱中取出，在室溫下解凍。樣品液化的同時，在強光下檢查是否有晶體形成的跡象。如果出現(xiàn)晶體，則在達(dá)到室溫后對樣品進(jìn)行重新檢查，以確認(rèn)晶體是否溶解。解凍后或室溫下沒有晶體，則表明葡萄酒冷穩(wěn)定[16]。為方便觀察，通常同時保留一個對照酒樣用于比較。

酒樣的無菌過濾采用的過濾膜孔徑應(yīng)與實際生產(chǎn)中使用的相一致，通常白葡萄酒采用的孔徑尺寸為0.45 μm，紅葡萄酒采用的為0.65 μm。

該方法的結(jié)論是定性的“通過”或“不通過”?！巴ㄟ^”是指無菌過濾的葡萄酒樣品或經(jīng)無菌過濾的成品葡萄酒在任何一次檢查中都沒有出現(xiàn)晶體；或者在第一次檢查（融化）時發(fā)現(xiàn)晶體，但是在室溫下晶體溶解（取決于釀酒師）。反之則為“不通過”。

可能出錯的情況：冷凍時間不足；樣品溫度偏高；過濾不正確；沒有在正確的時間觀察樣品；人工加熱的樣品；冰晶被誤認(rèn)為是酒石酸鹽晶體。

適用范圍：該法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，降溫設(shè)施用普通冰箱即可。因為操作簡單，目前依然有很多酒廠采用。

在起泡葡萄酒和強化葡萄酒的生產(chǎn)中，因為酒精度變化幅度明顯，影響到最終產(chǎn)品中酒石酸鹽的溶解度，實驗時需進(jìn)行調(diào)整。起泡酒做冷凍-融化法測試時，需強化1%～1.5%的酒精，以模擬二次發(fā)酵后實際的酒精度含量[4]。

該方法適用于傳統(tǒng)冷凍的“減法”過程，不適用于加法“過程”，比如以CMC處理的葡萄酒。

1.2 冷藏法（Refrigeration Test）

原理：冷藏法同樣是基于KHT溶解度隨溫度變化的特性，降低樣品溫度至冰點附近進(jìn)行測試。與冷凍-融化法的區(qū)別是，樣品測試通常在不結(jié)冰的狀態(tài)下進(jìn)行，保持幾天甚至幾周的時間，以視覺觀察是否有KHT晶體析出。葡萄酒的冰點計算公式如下：

冰點T ℃＝-（酒精度－1）/2

方法：具體取樣與過濾操作同冷凍-融化法，但不使樣品凍結(jié)。不同的酒廠采用的測試溫度與保留時間參數(shù)有所不同：在0 ℃，保持1周；在-2 ℃，保持72 h；或者在-4 ℃，保持24 h等[18]。其中，將過濾后的葡萄酒樣品置于冰浴鍋內(nèi)的冷凍（鹽水）測試，-4 ℃保持3 d，然后檢查晶體沉淀情況，也被稱為“鹽水”測試。有研究發(fā)現(xiàn)，這種“鹽水”測試方法得出的結(jié)論與在酒窖條件下儲存一年的葡萄酒的穩(wěn)定性最接近，可以提供可靠的結(jié)果[19]。

適用范圍：同冷凍-融化法一樣，操作簡單，不需要復(fù)雜設(shè)備，這是優(yōu)點。但僅能得出定性的結(jié)果，如果結(jié)論是不通過，不能給出具體不穩(wěn)定程度的參數(shù)。同樣對最終酒精度有變化的樣品，例如起泡葡萄酒，需采用強化酒精，以模擬最終產(chǎn)品酒精度。結(jié)果僅能說明葡萄酒的當(dāng)前穩(wěn)定性，而非長期穩(wěn)定性[20]。

但該法比冷凍-融化法適用的范圍要廣，因為測試過程樣品未達(dá)到冷凍狀態(tài)，所以一部分“加法”過程的處理工藝也可以用。缺點是生產(chǎn)工藝處理需對測試結(jié)果等待時間較長。

1.3 電導(dǎo)率/微接觸法（Conductivity Test/ Mini Contact Test）

原理：葡萄酒中的游離K+會因酒石的沉淀析出而損失，從而導(dǎo)致葡萄酒電導(dǎo)率發(fā)生變化。在一定的溫度下，添加酒石“晶種”，使酒石酸氫鉀過飽和而沉淀析出，再通過測定電導(dǎo)率變化，可預(yù)測葡萄酒的冷穩(wěn)定性。微接觸法最早被提出是利用稱重法，通過確定增加酒石重量的多少來判定穩(wěn)定性。因為操作復(fù)雜，逐步被改良。目前是通過檢測電導(dǎo)率的變化來判定結(jié)果，與電導(dǎo)率法類似。但電導(dǎo)率法通常用電導(dǎo)率變化值的百分比來評價結(jié)果，而所謂的微接觸法通常用具體的電導(dǎo)率變化數(shù)值來評價。

方法：測試需要的儀器包括電導(dǎo)率儀（量程100～1000 μS；）、0 ℃（±1.0 ℃）的恒溫冰浴裝置，及過濾裝置等。

檢測時，先開啟攪拌，校準(zhǔn)電導(dǎo)率儀（大約10 min）。將冷藏的葡萄酒樣，立即進(jìn)行無菌過濾并脫氣，然后置于0 ℃（±1.0 ℃）的冷浴中。測試過程中持續(xù)攪拌，保持樣品溫度恒定。將電導(dǎo)率探頭插入樣品中，并在達(dá)到測試溫度時讀取電導(dǎo)率（C1）。將KHT粉末加入到冷卻的樣品中，并攪拌幾分鐘。當(dāng)葡萄酒的電導(dǎo)率值穩(wěn)定時，記錄電導(dǎo)率讀數(shù)（C2）。初始讀數(shù)（C1）和添加后讀數(shù)（C2）的電導(dǎo)率變化比率將指示所測樣品的穩(wěn)定性水平。

注意事項：在測試溫度下，電導(dǎo)率值不穩(wěn)定且持續(xù)降低，說明所測樣品不穩(wěn)定；電導(dǎo)率達(dá)到并保持穩(wěn)定值的樣品是穩(wěn)定的。測試結(jié)論僅適用于測試溫度或以上，如果葡萄酒儲存溫度低于測試溫度，則仍有可能不穩(wěn)定，故測試應(yīng)該在盡可能低的溫度下進(jìn)行。有測試方法選擇白葡萄酒在0 ℃下進(jìn)行測試，紅葡萄酒在5 ℃下進(jìn)行測試，KHT的粒度應(yīng)在40～70 μm[18]。

可能出錯的情況：樣品溫度不準(zhǔn)確、儀表或探頭故障、無法攪拌樣品、計時和儀表讀數(shù)不正確、沒添加KHT、過濾操作不當(dāng)、樣品過濾溫度不適合。

結(jié)果判定：

（1）電導(dǎo)率法判定標(biāo)準(zhǔn)，采用的計算公式如下：

電導(dǎo)率的變化△λ小于3%～5%，則表示葡萄酒穩(wěn)定[16, 21]。

（2）微接觸法判定標(biāo)準(zhǔn)，采用的計算公式為：

不同的研究者設(shè)定的略有差別。例如GUISE采用的微接觸測試判定標(biāo)準(zhǔn)為：如果電導(dǎo)率的變化值△λ＜30μs/cm，則非常穩(wěn)定；△λ變化值介于30～50μs/cm為穩(wěn)定；△λ變化值介于50～70μs/cm為警告；△λ＞70μs/cm則為不穩(wěn)定[22]。

適用范圍：該法檢測用時短，屬定量分析?？捎糜谥苯永鋬?、電滲析、以及外源添加KPA、CMC等的冷穩(wěn)定測試，適用范圍廣泛。

1.4 飽和溫度法（Saturation Temperature，Ts）

原理：葡萄酒的飽和溫度（Ts）是指可以溶解KHT的最低溫度，亦即溶質(zhì)（KHT）在溶液（葡萄酒）里達(dá)到飽和狀態(tài)時的溫度[1]。在一定的范圍內(nèi)，超過或低于這個溫度將會使溶液由飽和狀態(tài)變?yōu)椴伙柡蜖顟B(tài)或者由不飽和狀態(tài)變?yōu)轱柡蜖顟B(tài)，使溶液中的溶質(zhì)晶體溶解或析出。Ts值越低，葡萄酒就越穩(wěn)定；Ts值越高，KHT沉淀就越容易發(fā)生。VALLEE提出了飽和溫度法來判斷葡萄酒的酒石穩(wěn)定性[23]。

飽和溫度法即通過測定葡萄酒的飽和溫度Ts，與既定的“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”比對來判定穩(wěn)定性的檢測方法。“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”理論上為葡萄酒在正常儲存條件下不出現(xiàn)酒石酸鹽沉淀的飽和溫度上限值。

方法：測試需要的儀器包括電導(dǎo)率儀（量程為100～1000μs）、控溫及樣品攪拌裝置?？販貑卧脕碚{(diào)節(jié)樣品溫度，保證檢測過程中實現(xiàn)先是對樣品降溫，隨后將酒樣以穩(wěn)定的速度升溫的過程。

白葡萄酒：在電導(dǎo)率儀中把葡萄酒溫度降到5 ℃，然后逐漸升溫到25 ℃，在升溫過程中，按既定的溫差記錄溫度和電導(dǎo)率。同樣條件需要做兩個樣品，一個對照樣品，一個加4 g/L KHT的酒樣，將兩個酒樣的結(jié)果在同一坐標(biāo)系中，繪制成溫度-電導(dǎo)率曲線圖，得到飽和溫度曲線，兩條曲線明顯分開時的交點就是樣品的飽和溫度Ts[23-25]；升溫速度應(yīng)該穩(wěn)定，DOS SANTOS選擇的升溫速度為0.5 ℃/min[24]。曲線繪制參照圖1。

紅葡萄酒：初始溫度降到10 ℃，升溫至30 ℃，其它操作同白葡萄酒。

對白葡萄酒的Ts判定是10 ℃，即Ts＜10 ℃時為穩(wěn)定， Ts＞10 ℃時不穩(wěn)定；對紅葡萄酒的Ts判定是16 ℃，即Ts＜16 ℃時穩(wěn)定，Ts＞16 ℃時不穩(wěn)定。

適用范圍：適用于包括電滲析處理[26]的大多數(shù)冷穩(wěn)定處理的測試，但對于利口酒（雪利酒）應(yīng)用受限[22]。研究結(jié)果表明，結(jié)晶抑制劑不會影響鹽的溶解，Ts值不會因陳釀過程中發(fā)生的變化而改變[4]，因此飽和溫度法Ts預(yù)測的是葡萄酒長期穩(wěn)定性。

1.5 離子濃度積法（Concentration product，CP）

原理：基于根據(jù)溶解度可預(yù)測溶質(zhì)沉淀的原理，根據(jù)葡萄酒中KHT的K+和HT-的離子濃度積來預(yù)測冷穩(wěn)定，即離子濃度積法。KHT的離子濃度與酒石酸在葡萄酒中的電離平衡直接相關(guān)，而電離平衡主要受pH、酒精影響。 BERG以模擬酒試驗在不同pH、酒精度的條件，HT-在H2T中的占比，制定了HT-（%）與pH、酒精度的關(guān)系表。在此基礎(chǔ)上，通過檢測樣品K+、總酒石酸H2T的含量，以及酒精度與pH，即可計算出離子濃度積CP數(shù)據(jù)，與表1的推薦數(shù)據(jù)對比即可預(yù)測酒石穩(wěn)定性[27]。

方法：檢測葡萄酒樣中K+、H2T、pH和酒精度，以后3項的數(shù)據(jù)得出HT-數(shù)值，從而計算出葡萄酒中的離子濃度積CP。

CP的計算公式如下：

其中：K+、H2T單位為g/L；HT-(%)值為百分?jǐn)?shù)，系查表得出（表略）。

結(jié)果判定：與表1中數(shù)值比較，如果相應(yīng)樣品CP值高于建議數(shù)值，則說明葡萄酒酒石不穩(wěn)定。

適用范圍：CP法測試需要用到原子吸收或火焰光度儀檢測鉀離子濃度，對一般酒廠來說儀器配置與檢測人員的要求偏高。CP法僅是對酒石酸鹽離子檢測，不能同時評估蛋白、單寧等保護(hù)膠體對冷穩(wěn)定的影響，測試結(jié)果置信度偏低。綜上，CP法目前在實際生產(chǎn)中的使用比較少。

2 討論與進(jìn)展

葡萄酒冷穩(wěn)定雖然主要與KHT有關(guān)，但也受其它大分子膠體成分影響。目前冷穩(wěn)定測試方法各有特點，科研人員針對測試方法的局限性與不足，開展了相關(guān)的研究，部分研究進(jìn)展介紹如下：

Gomez Benitez等[28]依據(jù)雪利酒的酒石酸氫鉀中的飽和度更高的現(xiàn)象，對比了飽和溫度（Ts）法和微接觸法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)微接觸法可作為一種快速、可靠地確定雪利酒酒石酸穩(wěn)定性的方法。

Henriques等[29]開發(fā)了受控的冷凍-融化測試法，以獲得電滲析處理葡萄酒所需的去離子度（Deionization degree，DD）參數(shù)，所得結(jié)果具有重現(xiàn)性，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)。具體方法是將樣品在-20 ℃下冷凍并控制結(jié)晶核，保溫24 h，隨后在0 ℃解凍。去離子度是通過測定葡萄酒在0 ℃時的初始和最終電導(dǎo)率確定。

表1 不同葡萄酒在0 ℃冷穩(wěn)定最高CP限值Table 1 Maximum CP limit of cold stability of different wines

Bosso等[30]研發(fā)了一種改良微接觸測試方法。該方法是在測試酒樣中添加過量KHT（10 g/L），保持0 ℃的恒溫狀態(tài)下，攪拌4 min，測試葡萄酒的電導(dǎo)率（△λ）下降。并定義了明確的測試操作條件，添加的KHT晶體類型和劑量，從而降低了檢測成本，大幅縮短了檢測時間，簡化了測試管理。通過比較微型接觸測試和冷凍測試的結(jié)果，定義了閾值穩(wěn)定性值：白葡萄酒的△λ＜5%，紅葡萄酒和桃紅葡萄酒的△λ＜4%； 對于特別富含多酚類化合物的紅酒，△λ＜3%。

飽和溫度法的“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”沒有一個統(tǒng)一的數(shù)值，這是因為KHT的亞穩(wěn)性和晶體生長抑制劑的存在，Ts值與實際穩(wěn)定溫度不符，且存在一定程度的差異[25]。王樹生等[31]以國產(chǎn)葡萄酒為試驗對象，對“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行了驗證，得出白葡萄酒Ts是10 ℃，紅葡萄酒的Ts是16 ℃，推薦該標(biāo)準(zhǔn)可用于指導(dǎo)生產(chǎn)的結(jié)論。Lambri等[3]研究了模擬酒中蛋白質(zhì)與單寧的含量發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白質(zhì)單寧比的降低，酒石酸鹽的保留能力增加。單寧濃度的增加使飽和溫度Ts值降低，從而使過飽和度范圍變窄，而僅蛋白質(zhì)的存在增加了過飽和度的范圍，使Ts值增加。Berta[32]給出了“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”范圍，白葡萄酒在5～12.5 ℃，紅葡萄酒在10～21.1 ℃，即Ts低于此范圍是穩(wěn)定的。呂振榮等[33]試驗表明，紅葡萄酒Ts低于15 ℃、白葡萄酒Ts低于12 ℃是穩(wěn)定的。葡萄酒生產(chǎn)者需根據(jù)自己葡萄酒的特點來確定“Ts判定標(biāo)準(zhǔn)”。

葡萄酒酒石的穩(wěn)定性受大分子膠體等多種成分與因素的影響，一種測試方法常常不能滿足生產(chǎn)對于準(zhǔn)確性的要求，一些復(fù)合方法被開發(fā)出來：劉振來等[15]經(jīng)試驗確定其選用的電導(dǎo)率法與飽和溫度法復(fù)合指標(biāo)來預(yù)測葡萄酒的冷穩(wěn)定：（1）電導(dǎo)率差△λ＜25μS/cm；（2）飽和溫度Ts：白葡萄酒Ts＜10.5 ℃時穩(wěn)定，Ts＞10.5 ℃時不穩(wěn)定；紅葡萄酒Ts＜20 ℃時穩(wěn)定，Ts＞20 ℃時不穩(wěn)定；（3）飽和溫度曲線走向：飽和溫度的二條曲線在相交之前應(yīng)該結(jié)合緊密或稍有分離，如果分離過大則有沉淀危險。當(dāng)同時符合以上3個條件時，說明葡萄酒酒石穩(wěn)定，如有一條不符，則有酒石沉淀危險。

澳大利亞葡萄酒研究所AWRI建議通過在- 4 ℃下保持3 d的冷藏（鹽水）測試和Ts測試相結(jié)合，可獲得有關(guān)酒石穩(wěn)定性的最可靠信息，因這兩種測試相結(jié)合可得出葡萄酒的當(dāng)前穩(wěn)定性及其潛在的長期穩(wěn)定性[34]。

3 結(jié)論

冷穩(wěn)定測試是對葡萄酒冷穩(wěn)定狀態(tài)的一個預(yù)測，不同測試方法置信度不同。

冷凍-融化法具有操作簡單，用時短（當(dāng)天或兩天即可出結(jié)果）的優(yōu)點，缺點是結(jié)果僅能定性，且對于“加法”工藝處理的酒大部分不適用。

冷藏法與冷凍-融化法不同之處是酒樣不結(jié)冰，能適用部分“加法”工藝的測試。缺點是通常用時長（一周左右出結(jié)果）。

電導(dǎo)率（微接觸）法通過葡萄酒電導(dǎo)率的變化來預(yù)測葡萄酒的穩(wěn)定性，系定量檢測，結(jié)果可靠，測試速度快，適用范圍廣，可推廣使用。

飽和溫度法同樣是基于電導(dǎo)率的測定，系定量檢測，測試速度快，適用范圍比較廣。但判定標(biāo)準(zhǔn)Ts會受到葡萄酒中酒精、單寧、蛋白等成分的影響，對于酒精度高的特種酒應(yīng)用受限。

離子濃度積法是根據(jù)葡萄酒中KHT的離子濃度來判斷冷穩(wěn)定性，優(yōu)點是屬于定量分析，缺點是需要復(fù)雜的檢測硬件設(shè)施，對人員的操作水準(zhǔn)要求高，應(yīng)用受限。

由于葡萄酒的復(fù)雜性，一種測試方法不能滿足生產(chǎn)指導(dǎo)要求，一些改良的測試方法，甚至兩種或兩種以上方法結(jié)合使用的方法被研發(fā)出來。生產(chǎn)者可結(jié)合自己產(chǎn)品與工藝特點選擇適合的方法。