粗皮桉芽器官離體快繁研究

唐再生，李麗芳，黃加宜，覃衛(wèi)星，馬忠才，李霞，熊濤

粗皮桉芽器官離體快繁研究

唐再生，李麗芳，黃加宜，覃衛(wèi)星，馬忠才，李霞，熊濤*

(廣西國(guó)有東門林場(chǎng)，廣西 扶綏 532108)

為提高粗皮桉組培成活率，用粗皮桉優(yōu)樹伐樁萌芽的莖段作外植體，改良MS作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以芽器官直接離體培養(yǎng)成苗的方式建立無(wú)菌培養(yǎng)材料，經(jīng)繼代增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根，瓶苗移栽等環(huán)節(jié)，建立粗皮桉組培快繁體系。結(jié)果表明：繼代苗增殖系數(shù)3.5 ~ 4.2，瓶苗生根率95%，移栽成活率92.5%，能夠大規(guī)模商業(yè)化育苗。

粗皮桉；芽器官；組培快繁；育苗

粗皮桉()原產(chǎn)澳洲，1983年引種到廣西東門林場(chǎng)種植后，表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)適應(yīng)性[1]。在實(shí)木利用方面，它具有尾巨桉(×)等短周期紙漿材無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。木質(zhì)堅(jiān)實(shí)，木材紅色，被譽(yù)為天然“澳洲紅木”，木材價(jià)值高，經(jīng)濟(jì)效益好[2]。生長(zhǎng)周期相較尾巨桉長(zhǎng)，從而減少人們經(jīng)營(yíng)活動(dòng)對(duì)森林生態(tài)的干擾，屬于環(huán)境友好型人工林。

利用優(yōu)樹萌芽組培繁育的無(wú)性系苗木造林，具有很好的發(fā)展前景。沙月娥等[3]采用愈傷組織途徑成苗方式，建立粗皮桉的再生體系；廖煥琴等[4]采用尾葉桉優(yōu)良新無(wú)性系的無(wú)菌組培苗為材料,進(jìn)行叢芽增殖和不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)，篩選出無(wú)性系ZQUB58生根率100%的生根培養(yǎng)基；歐陽(yáng)樂(lè)軍等[5]用粗皮桉無(wú)菌苗下胚軸為外植體，研究不同激素處理對(duì)粗皮桉體胚發(fā)生的影響，初步建立了愈傷組織誘導(dǎo)及體胚發(fā)生最適合的激素濃度與種類。通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的方式，獲得的再生植株其變異率高，難以保持原有良種的優(yōu)良特性，在木本植物組培快繁中不宜提倡[6]。劉均利等[7]用檸檬桉()帶芽徑段為外植體進(jìn)行組培快繁，發(fā)現(xiàn)檸檬桉褐化較嚴(yán)重；黃華艷等[8]、曾東武[9]利用巨尾桉(×)和柳窿桉(×)芽器官進(jìn)行過(guò)組培快繁研究，篩選出生根率為100%的培養(yǎng)基。當(dāng)前鮮見粗皮桉芽器官離體快繁的研究，石前等[10]嘗試用粗皮桉芽器官離體成苗，生根率僅50%，不能滿足規(guī)模推廣造林的用苗需求。

本研究以粗皮桉優(yōu)樹伐樁萌芽作外植體，以離體芽器官直接產(chǎn)生叢生芽的方式，建立組培快繁體系，以期能在短期內(nèi)培育大量性狀穩(wěn)定，整齊一致的無(wú)性系苗木供造林使用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從引種試驗(yàn)林中選出優(yōu)良家系的優(yōu)良單株，伐倒促萌，以健壯萌芽條作繁殖材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體選擇和處理

選取健壯無(wú)病蟲害萌芽條，剪去葉片，洗衣粉漂洗后，自來(lái)水流水沖洗10 min，軟毛刷刷洗干凈后，按照萌芽條上的節(jié)位切段，分“3 ~ 4”(幼嫩莖段)，“5 ~ 7”(半木質(zhì)化莖段)，“7以下”(木質(zhì)化莖段)3種莖段。然后在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下，75%酒精處理10 ~ 15 s，無(wú)菌水洗滌3次；再用0.1%HgCL2溶液消毒5 ~ 8 min，無(wú)菌水洗滌5次。用無(wú)菌濾紙吸干水分，切去莖段兩端以及葉柄，切成長(zhǎng)1.5 cm左右含1 ~ 2個(gè)節(jié)的莖段；接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，全暗培養(yǎng)9 ~ 18 d。

1.2.2 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基為改良MS固體培養(yǎng)基，附加不同配比的細(xì)胞分裂素6 ~ BA和生長(zhǎng)素NAA，蔗糖30 g·L-1，瓊脂粉3.9 ~ 4.2 g·L-1，誘導(dǎo)生根用1/2改良MS培養(yǎng)基，附加蔗糖15 g·L-1以及不同濃度的生長(zhǎng)素。pH值調(diào)至5.8 ~ 6.2。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室光照強(qiáng)度1 500 ~ 3 000 lx，以自然散射光為主，不足時(shí)用人工光源補(bǔ)足。每天光照時(shí)間10 ~ 12 h；培養(yǎng)室溫度26±2℃，生根苗后期在大棚煉苗時(shí)，溫度為18 ~ 35℃。

1.2.4 生根苗移栽

先打開瓶蓋灌注少量冷開水，煉苗2 ~ 3 d，再洗去根部瓊脂后移栽。移栽基質(zhì)為：①椰糠+泥炭土(5：3)輕型基質(zhì)，②黃心土+蛭石(5：1)，③輕型基質(zhì)+黃心土(3：1)，移苗前用高錳酸鉀溶液消毒基質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌芽誘導(dǎo)

消毒滅菌后，幼嫩莖段污染少而枯死多；木質(zhì)化莖段枯死少而污染率高(表1)。5 ~ 7節(jié)位的半木質(zhì)化莖段污染較少，枯死也少。黑化枯死可能是外植體受到滅菌劑毒害而死亡，因此幼嫩莖段消毒時(shí)間宜短以減少死亡，而木質(zhì)莖段消毒時(shí)間可稍微長(zhǎng)一些，以充分殺滅雜菌，降低污染率。當(dāng)材料較充足時(shí)，只選取半木質(zhì)化莖段作外植體。

由表2可知，半木質(zhì)化莖段萌芽率也最高且萌芽質(zhì)量好，愈傷和玻璃化芽占比少。與培養(yǎng)基接觸處的褐化程度較輕。幼嫩莖段褐化少而易產(chǎn)生愈傷組織和玻璃化苗；木質(zhì)化莖段易褐化而且無(wú)菌芽生長(zhǎng)也較弱。

分析認(rèn)為：半木質(zhì)莖段的側(cè)芽，潛伏在莖節(jié)(葉腋)處，尚未萌發(fā)，在消毒時(shí)受外植體表皮保護(hù)未遭到傷害，接種后潛伏芽生長(zhǎng)，萌發(fā)成無(wú)菌芽，萌芽快，質(zhì)量好；分生活躍的幼嫩莖段，因表皮纖維不發(fā)達(dá)，維管結(jié)構(gòu)也不健全，消毒時(shí)易枯死，存活者在培養(yǎng)基高濃度激素影響下，易形成愈傷組織，萌芽易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。木質(zhì)化莖段的腋芽，受頂端優(yōu)勢(shì)作用的影響，已經(jīng)脫落，接種后萌發(fā)的是第二潛伏芽，所需時(shí)間長(zhǎng)，萌發(fā)慢。又因?yàn)槟举|(zhì)化莖段已成熟，含酚、醌類物質(zhì)較多，滲透到培養(yǎng)基后出現(xiàn)褐化，而培養(yǎng)基褐化反過(guò)來(lái)影響外植體的生長(zhǎng)，使芽生長(zhǎng)比較弱。

優(yōu)樹生長(zhǎng)在野外，樹齡較大，伐樁萌芽受病蟲為害頻繁，萌條所攜帶的雜菌較多。外植體消毒滅菌成功與否，成為組培育苗成敗的關(guān)鍵。選用半木質(zhì)莖段作外植體，既能減少污染，又能提高萌芽率質(zhì)量，因此成為外植體誘導(dǎo)無(wú)菌芽過(guò)程中最重要的一環(huán)。

此外，粗皮桉有一個(gè)特別的特征，即外植體萌芽后，上端幼嫩莖段從節(jié)處產(chǎn)生離層，并逐漸斷開脫落，用幼嫩莖段難以誘導(dǎo)成功。而且莖段與培養(yǎng)基接觸處的褐化較嚴(yán)重，這與尾巨桉有明顯區(qū)別。

表1 不同外植體消毒滅菌后成活情況統(tǒng)計(jì)表

2.1.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素對(duì)粗皮桉萌芽的影響

由表3可知，粗皮桉內(nèi)源激素比較豐富，在不添加激素的情況下，外植體能萌生小芽；添加單一生長(zhǎng)素或細(xì)胞分裂素，均能萌芽，對(duì)人為添加的外源激素比較敏感，在添加BA1.0NAA 0.2 ~ 0.4時(shí)，萌芽快，長(zhǎng)勢(shì)好，形成大小芽錯(cuò)落有致的叢芽。

表3 激素對(duì)粗皮桉外植體萌芽的影響

2.2 繼代增殖培養(yǎng)

2.2.1 無(wú)菌芽的選優(yōu)

經(jīng)過(guò)選擇的外植體萌生叢芽后，芽的質(zhì)量仍良莠不齊。在繼代增殖培養(yǎng)之前以及繼代培養(yǎng)過(guò)程中，需進(jìn)一步優(yōu)化。剔除愈傷芽，玻璃化芽，生長(zhǎng)勢(shì)弱的芽，選生長(zhǎng)健壯長(zhǎng)勢(shì)旺盛的芽擴(kuò)繁，從源頭上提高無(wú)菌芽的質(zhì)量。

2.2.2 不同激素組合培養(yǎng)基對(duì)叢芽繼代培養(yǎng)的影響

將叢芽切成小叢，長(zhǎng)芽切成小段接種到不同激素濃度的繼代培養(yǎng)基，18 ~ 20 d后觀察。

由表4可知，沿用誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，所用激素濃度高，增殖系數(shù)大，但芽的質(zhì)量不理想，一是出現(xiàn)水腫芽，二是連續(xù)三代后，芽節(jié)間很短，成為不能進(jìn)行生根培養(yǎng)的無(wú)效芽。少數(shù)苗出現(xiàn)葉片愈傷，極少數(shù)苗出現(xiàn)畸形，芽肥厚，扁平狀。降低激素濃度，用1/2誘導(dǎo)培養(yǎng)基的量，芽仍然生長(zhǎng)旺盛且芽苗生長(zhǎng)正常。

組培快繁育苗過(guò)程中，繼代培養(yǎng)的目標(biāo)是能持續(xù)進(jìn)行以芽繁芽，提供正常芽苗誘導(dǎo)生根。因此，可以采取激素濃度高低交替的方法[5]。但在商業(yè)化育苗中，操作不方便。本研究利用外源激素在芽苗體內(nèi)的累積作用，先降低繼代培養(yǎng)基的激素濃度，然后多代培養(yǎng)并觀察，根據(jù)苗的生長(zhǎng)情況“微調(diào)”激素濃度，直到芽苗生長(zhǎng)穩(wěn)定為止。實(shí)踐表明，粗皮桉繼代培養(yǎng)中，以BA 0.35 mg·L-1+NAA0.15 mg·L-1，可促進(jìn)芽苗增殖，又能促芽苗伸長(zhǎng)。增殖系數(shù)達(dá)到3.5。芽苗生長(zhǎng)健壯，有效芽多。不同無(wú)性系之間有一定差異，需調(diào)試后建立獨(dú)立配方。

2.3 誘導(dǎo)生根

選健壯芽苗，從莖節(jié)下切成1.5 cm左右小苗，垂直接種到生根培養(yǎng)基中，18 d后檢查。由表5可知，4種激素濃度的生根率均較好。用IBA和IBA+NAA組合，莖切口處產(chǎn)生小愈傷，非愈傷出根，只是愈傷團(tuán)擠壓改變了根向下伸展的方向。當(dāng)洗苗和移栽時(shí)，愈傷如果脫落，根也易脫離。單用ABT1，根細(xì)長(zhǎng)，和IBA結(jié)合使用，根系粗壯，苗生長(zhǎng)好。以ABT11.0+IBA0.2最好。

表4 不同激素濃度的培養(yǎng)基對(duì)繼代苗生長(zhǎng)的影響

表5 不同生長(zhǎng)激素濃度組合對(duì)粗皮桉生根的影響

2.4 瓶苗移栽

生根苗接種后20 ~ 25 d，苗莖充分木質(zhì)化，根系完整發(fā)達(dá)，可以移栽。洗苗后，根系過(guò)長(zhǎng)者需截去部分再移植。在多菌靈溶液中浸泡30 min，用鑷子夾取移入育苗基質(zhì)中。移栽后用70%遮陽(yáng)網(wǎng)搭拱棚覆蓋，冬季加蓋薄膜保溫。

由表6可知，不同基質(zhì)類型對(duì)小苗成活率的影響差異小，成活率均超過(guò)90%。輕型基質(zhì)中，苗木生長(zhǎng)更綠一些。空氣切根后，苗的須根特別多。黃心土基質(zhì)中，苗木根比較粗，須根較少。如用育苗袋育苗，有穿根現(xiàn)象，需要挪動(dòng)育苗袋并剪去過(guò)長(zhǎng)的根。

表6 不同基質(zhì)類型對(duì)粗皮桉小苗移栽后生長(zhǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，粗皮桉無(wú)菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基選用改良MS+BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 ~ 0.4 mg·L-1，萌芽率達(dá)到86%，關(guān)鍵是要選擇半木質(zhì)化基段作外植體，既減少污染率，減少黑化枯死率，萌芽質(zhì)量也更好。因?yàn)樵谙緶缇鷷r(shí)，外植體被殺傷引起黑化枯死，與外植體褐化培養(yǎng)基是兩種不同的情況。粗皮桉的褐化情況比尾巨桉要嚴(yán)重。

繼代增殖培養(yǎng)中，對(duì)無(wú)菌芽進(jìn)行選優(yōu)，有利于提高繼代苗質(zhì)量。通過(guò)多代培養(yǎng)，依據(jù)苗情，微調(diào)培養(yǎng)基激素濃度，再使用固定配方，有利于商業(yè)化育苗，便于操作，實(shí)用性強(qiáng)。以IBA 0.35 mg·L-1+NAA 0.15mg·L-1用量，增殖系數(shù)可達(dá)3.5，1年繼代18次，一株芽理論上可產(chǎn)生芽苗數(shù)3.518條，約62億條，產(chǎn)苗量十分可觀。

小苗移栽時(shí)，選用輕型基質(zhì)，苗木質(zhì)量最好，須根多，根系發(fā)達(dá)；種植后無(wú)緩苗期且質(zhì)量輕，方便運(yùn)輸，但成本較高，需要用機(jī)器生產(chǎn)制造，專用育苗架擺苗，適合大型苗圃選用。黃心土基質(zhì)可以就地取材，成本低，如果用育苗袋裝基質(zhì)，可直接擺苗在畦床上育苗，適合林地周邊的小型苗圃選用。

[1] 歐陽(yáng)林男,陳少雄,劉學(xué)鋒,等.粗皮桉在我國(guó)的潛在適生區(qū)與主導(dǎo)生態(tài)因子研究[J].桉樹科技,2018,35(2):14-20.

[2] 王喆,孫柏玲,柴宇博,等.真空熱處理粗皮桉木材化學(xué)性質(zhì)的變化[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,45(6):61-64.

[3] 沙月娥,吳志華,歐陽(yáng)樂(lè)軍,等.粗皮桉的組織培養(yǎng)與植株再生研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,44(9):1511-1516.

[4] 廖煥琴,黃曉玲,潘文,等.尾葉桉優(yōu)良無(wú)性系組培快繁研究[J].林業(yè)與環(huán)境科學(xué),2017,33(2):36-41.

[5] 歐陽(yáng)樂(lè)軍,李莉梅,何秀容,等.粗皮桉胚性愈傷組織及體胚誘導(dǎo)[J].分子植物育種,2016,14(11):3159-3165.

[6] 沈海龍.植物組織培養(yǎng)[M]北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2005.

[7] 劉均利,郭洪英,楊曉蓉,等.檸檬桉的組培快繁技術(shù)研究[J].桉樹科技,2013,30(4):19-24.

[8] 曾煉武.巨尾雜交桉芽器官離體培養(yǎng)快速繁殖的研究[J]. 廣西林業(yè),1990(S1):16-23.

[9] 黃華艷,吳耀軍.柳窿桉芽器官離體培養(yǎng)研究[J].廣西林業(yè)科學(xué),2003,32(1):27-28.

[10]石前,李飛宇,李俏,等.粗皮桉的組培快繁方法[J].中國(guó)園藝文摘,2016(6):167-169.

Study on Rapid in Vitro Propagation ofBuds

TANG Zaisheng, LI Lifang, HUANG Jiayi, QIN Weixing, MA Zhongcai, LI xia, XIONG Tao1

(,)

In order to improve the survival rate of tissue cultured, stem segments collected from coppice sprouts ofwere used as explants for culturing with a basic MS culture medium. Aseptic culture material was established by direct in vitro culture of bud organs. Subsequent subculture to proliferate available shoots followed by inducement of rooting and then transplanting of rooted plantlets enabled rapid propagation of. The results showed that the multiplication coefficient of secondary (sub-cultured) seedlings was 3.5 ~ 4.2, the rooting rate of the in vitro explants was 95%, and then survival rate after transplanting was 92.5%. Thus, the methods employed can be used for large-scale commercial propagation.

; bud organ; tissue culture; breeding

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2020.04.06

廣西林業(yè)科技項(xiàng)目(桂林科字〔2016〕第12號(hào))

唐再生(1972— )，男，高級(jí)工程師，主要從事桉樹遺傳改良及無(wú)性系開發(fā)研究

熊濤(1989— )，男，碩士，工程師，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail：704423155@qq.com