復方老鸛草膠囊的提取工藝研究*

周怡雯，于清峰

(1 江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2 中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198)

復方老鸛草膠囊制劑是由老鸛草、筋骨草、伸筋草三種中藥材組成，臨床上可用于祛風濕，治療風濕麻痹、風濕性關(guān)節(jié)炎及類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。老鸛草是常用中藥，為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗ErodiumstephanianumWilld.、老鸛草G.wilfordii或野老鸛草GeraniumcarolinianumL.的干燥地上部分[1]，具有祛風濕、通經(jīng)脈、止瀉痢、抗氧化、抗菌抗病毒的作用[2-3]，其所含主要化學成分包括黃酮類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油和有機酸等，多年的臨床醫(yī)療實踐證實了其在風濕性疾病上的良好功效[4]。筋骨草的主要有效成分為環(huán)烯醚萜類，而哈巴苷與乙酰哈巴苷是其中研究較多且有明顯抗病毒、抗腫瘤活性的成分之一，其具有抗氧化、抗瘧、抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖、收縮血管等藥理活性[5-7]。伸筋草是石松科植物石子藤的全草[8]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制乙酰膽堿酯酶活性、有效減少體內(nèi)炎性細胞因子產(chǎn)生等作用，臨床常用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、頸椎病和急慢性軟組織損傷等疾病[9]。

本文是利用正交實驗設計方法對復方老鸛草膠囊的最佳提取工藝進行篩選。實驗中主要研究了乙醇濃度、溶媒用量、提取時間、提取次數(shù)這四個因素對復方老鸛草膠囊提取工藝的影響。正交實驗設計是為尋求最優(yōu)化水平組合的一種高效的多因素多水平實驗設計方法，廣泛應用于中藥復方的提取工藝優(yōu)化篩選等方面[10]。本實驗首先考察了乙醇濃度的單因素考察，然后進行了正交實驗，通過對得到的浸膏產(chǎn)率和乙酰哈巴苷含量的綜合評分，最后找出并驗證了得到的最佳提取工藝。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；島津高效液相色譜儀，日本島津公司；ZK-82B真空干燥箱，上海市實驗儀器總廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責任有限公司；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；AL204電子分析天平，梅特勒-多利多儀器(上海)有限公司；DT-100電子天平，美國雙杰兄弟(集團)有限公司。

老鸛草，伸筋草，筋骨草，本地藥材市場，經(jīng)鑒定老鸛草為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗的干燥地上部分，伸筋草為石松科石松屬植物石松(LycopodiumjaponicumThunb.)的干燥全草，筋骨草經(jīng)鑒定為唇形科植物金瘡小草(AjugadecumbensThunb.)；乙酰哈巴苷對照品(純度>99.9%，批號111925-201801)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純)，藥用乙醇(95%)，南京化學試劑有限公司。

1.2 標準溶液的配制

乙酰哈巴苷標準溶液的制備：精確稱取干燥恒重的乙酰哈巴苷標準品20 mg置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液適量溶解稀釋至刻度線并搖勻，即得乙酰哈巴苷標準溶液(0.2 mg/mL)。

1.3 提取工藝

稱取老鸛草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圓底燒瓶中，加入不同濃度的乙醇回流，過濾，濾液旋蒸除去大量溶媒，將剩余溶液倒入已稱重的蒸發(fā)皿中，水浴除去水分。經(jīng)過真空干燥、冷卻至室溫，稱重，計算浸膏得率。取干浸膏適量，加甲醇超聲處理30 min，使其溶解于甲醇，定容至一定體積，搖勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液經(jīng)HPLC-UV測定乙酰哈巴苷含量。

1.4 液相色譜條件

色譜條件為：Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-水(13:87，V/V)，流速1.0 mL/min，紫外檢測器，檢測波長為207 nm。

1.5 正交優(yōu)化實驗

實驗考察了乙醇濃度、溶媒用量、提取時間、提取次數(shù)四個因素，先后通過單因素實驗以及L9(34)正交設計實驗，以提取液中測得的乙酰哈巴苷含量以及浸膏得率為實驗指標，研究各因素對提取工藝的影響程度及找出提取復方老鸛草膠囊的最佳工藝，實驗因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酰哈巴苷標準曲線的繪制

表2 標準曲線數(shù)據(jù)

分別精確量取乙酰哈巴苷標準溶液50、100、200、300、400 μL加甲醇至500 μL，搖勻，靜置，以制備0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的乙酰哈巴苷溶液。分別用HPLC-UV檢測，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線(圖1)，得標準曲線方程：A=5146.65C+21.48，R2=0.9991。

圖1 乙酰哈巴苷標準曲線

2.2 供試品溶液的制備及陰性對照

筋骨草所含有效成分為環(huán)烯醚萜類，其中乙酰哈巴苷的含量最高。分別稱取老鸛草、伸筋草、筋骨草各10 g，置于圓底燒瓶中，用200 mL，50%的乙醇回流2 h，提取一次，經(jīng)過濾、旋蒸、水浴揮干、真空干燥、研磨、超聲溶解30 min后，經(jīng)HPLC-UV測定得到相應譜圖2(a)。同樣稱取老鸛草、伸筋草各10 g，經(jīng)相同方法處理后通過HPLC-UV測定得到譜圖2(b)。由圖2(a)可知，乙酰哈巴苷在8.1 min出峰，而圖2(b)在8.1 min處并無乙酰哈巴苷的峰，說明陰性對照溶液對乙酰哈巴苷測定無干擾，方法專屬性較好。

圖2 老鸛草、伸筋草、筋骨草醇提物(a)；老鸛草、伸筋草醇提物(b)液相色譜圖

2.3 醇濃度的單因素條件考察

筋骨草中含有較高含量的乙酰哈巴苷，所以以乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率作為主要評價指標，用于提取工藝條件的優(yōu)選。本實驗中采用溶媒用量為1:10，提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次，考察不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%)對乙酰哈巴苷總含量和浸膏得率的影響，通過用HPLC-UV測定總乙酰哈巴苷的提取量，選用乙酰哈巴苷提取量最多的乙醇濃度為提取溶劑的濃度[11]。

結(jié)果表明(表3)，乙醇濃度在50%的條件下乙酰哈巴苷的含量和浸膏得率都最高，該濃度條件最好，因此正交實驗中以50%為中心，選取40%、50%、60%三個濃度進行最佳提取工藝考察。

表3 醇濃度單因素實驗結(jié)果

2.4 正交實驗設計

2.4.1 正交實驗

取老鸛草、筋骨草、伸筋草各10 g，共九份，按表1的因素水平和L9(34)正交表設計實驗方案進行實驗，測定所得的浸膏率和乙酰哈巴苷含量。

2.4.2 正交結(jié)果分析

考慮到浸膏得率和乙酰哈巴苷含量可能互相影響，因此用浸膏率及乙酰哈巴苷得率的綜合評分尋找最佳工藝，將浸膏率的權(quán)重定為0.5，乙酰哈巴苷得率權(quán)重定為0.5，正交實驗結(jié)果見表4。

表4 正交設計表L9(34)

方差分析見表5。

表5 方差分析表

對實驗結(jié)果進行方差分析，表5表明各因素影響大小順序為提取次數(shù)(D)>溶媒用量(B)>乙醇濃度(A)>提取時間(C)，優(yōu)選的最佳工藝為A1B3C1D2，即采用40%乙醇，12倍溶媒用量，提取2次，每次1 h。

圖3 正交因素對綜合評分的影響

2.5 優(yōu)選條件的驗證實驗

正交實驗中由綜合評分法篩選出最佳工藝A1B3C1D2，即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h。稱取與正交實驗同等量的藥材，按照最佳工藝進行實驗，平行2次，測得浸膏率、乙酰哈巴苷得率，檢驗此工藝是否穩(wěn)定可行。

表6中驗證實驗結(jié)果證實A1B3C1D2醇提條件與正交實驗結(jié)果相符，故將A1B3C1D2即40%乙醇，12倍量，提取2次，每次1 h，確定為最佳提取工藝條件。

表6 驗證結(jié)果

3 結(jié) 論

本實驗經(jīng)單因素實驗、正交設計實驗得出老鸛草醇提的最佳工藝條件為A1B3C1D2即乙醇濃度為40%，溶媒用量為12倍量，提取2次，每次1 h。老鸛草提取結(jié)果影響最大的是提取次數(shù)，其次是溶媒用量，乙醇濃度和提取時間，經(jīng)過工藝驗證證明此工藝的穩(wěn)定可行性。

本實驗為復方老鸛草膠囊的提取研究提供了一定的依據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。