微波輔助萃取法提取玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的工藝研究

傅 亞，范 佳，陳 芳，楊榮萍，張景勍，姚 波*

1 重慶科技學(xué)院，重慶 401331;2 重慶中藥研究院，重慶 400065;3 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016

中藥玄參(Figwort Root，Radix Scrophulariae)為玄參科植物玄參(Scrophularia ningpoensis Hemsl)的干燥根，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)的功效［1］。天然藥物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，玄參主要含有環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷、糖類、肉桂酸、皂苷等［2，3］。近年對其主要化學(xué)成分環(huán)烯醚萜類研究較多，哈巴苷與哈巴俄苷是環(huán)烯醚萜苷類中兩個主要的成分［4，5］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這兩種成分具有抗慢性炎癥、降壓、鎮(zhèn)痛以及免疫促進(jìn)的作用，因此將哈巴苷與哈巴俄苷作為玄參的特征性成分［6，7］。

微波輔助萃取技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的中藥有效成分提取技術(shù)，與傳統(tǒng)的中藥活性成分提取技術(shù)相比，具有簡便、快速高效、選擇性強、能耗少和環(huán)境污染小等優(yōu)點［8］，已廣泛應(yīng)用于黃酮、多糖和生物堿等有效成分的提?。?］。

本研究設(shè)計單因素實驗和正交實驗，利用微波輔助萃取法提取玄參中的哈巴苷與哈巴俄苷，采用HPLC 測定哈巴苷和哈巴俄苷的含量，通過對乙醇濃度、料液比、微波溫度、微波時間和微波功率因素的考察，篩選出微波提取玄參中哈巴苷與哈巴俄苷的最佳工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

玄參(采自重慶南川玄參GAP 基地);哈巴苷(四川，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-13121902，純度≥98%)及哈巴俄苷(四川，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-11071801，純度≥98%);乙腈、甲醇(HPLC Grade，Honeywell Burdick ＆ Jackson);乙醇、磷酸(AR，Honeywell Burdick ＆Jackson)。

1.2 儀器

島津LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司);X101 型微波催化合成/萃取儀(北京詳鵠科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6020 真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);BosChrom ODS 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);KH-250 型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);DZF-6020 真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);SHZ-95B 循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);FA2104B 電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 原料預(yù)處理

玄參根塊50 ℃干燥后，粉碎，過70 目篩，備用。

2.2 哈巴苷和哈巴俄苷的測定

哈巴苷和哈巴俄苷的HPLC 測定方法參照中國藥典2010 版［10］，色譜柱:BosChrom ODS(250mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈(A)-0.03%磷酸(B)，梯度洗脫:0～10 min，3%～10%(A);10～20 min，10%～33%(A);20～25 min，33%～50%(A);25～30 min，50%～80%(A);30～35 min，80%(A);35～37 min，80%～3%(A)，流速:1.0 mL/min，檢測波長:210 nm，進(jìn)樣量:20 μL，柱溫為常溫。

2.3 玄參哈巴苷和哈巴俄苷的微波提取工藝

將玄參藥材清洗除雜，晾干，粉碎，取已粉碎玄參藥材5.0 g，加入一定量的溶劑作為萃取劑，在控制設(shè)置條件下，微波萃取，抽濾，恒溫干燥，溫度控制在60 ℃左右，取干燥樣品約0.5 g，精密加入50%甲醇50 mL 密封，備用。

2.4 單因素實驗

2.4.1 乙醇濃度對玄參哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影響

稱取玄參粉末約5 g，微波輔助提取玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率為600 W、提取時間為35 min、料液比為1∶20、微波溫度為50 ℃的條件下，分別選擇不同濃度的乙醇0、20%、40%、60%、80%進(jìn)行單因素試驗，得到哈巴苷、哈巴俄苷和總苷的提取率。

2.4.2 料液比對玄參哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影響

稱取玄參粉末約5 g，微波輔助提取玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率為600 W、提取時間為35 min、乙醇濃度為40%、微波溫度為50 ℃的條件下，分別選擇不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 進(jìn)行單因素試驗，得到哈巴苷、哈巴俄苷和總苷的提取率。

2.4.3 微波溫度對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

稱取玄參粉末約5 g，微波輔助提取玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波功率為600 W、料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、提取時間35 min 的條件下，分別選擇不同的微波溫度為30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行單因素試驗，得到哈巴苷、哈巴俄苷和總苷的提取率。

2.4.4 微波時間對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

稱取玄參粉末約5 g，微波輔助提取玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波溫度為50 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、微波功率為600 W 的條件下，分別選擇不同的微波時間20、25、30、35、40 min進(jìn)行單因素試驗，得到哈巴苷、哈巴俄苷和總苷的提取率。

2.4.5 微波功率對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

稱取玄參粉末約5 g，微波輔助提取玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷，在微波溫度為50 ℃、料液比為1∶20、乙醇濃度為40%、提取時間35 min 的條件下，分別選擇不同的微波功率為500、600、700、800、900 W 進(jìn)行單因素試驗，得到哈巴苷、哈巴俄苷和總苷的提取率。

2.5 正交實驗

在上述單因素實驗基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實驗進(jìn)一步分析乙醇濃度、微波溫度、微波功率、微波時間對玄參哈巴苷和哈巴俄苷總提取率的影響，優(yōu)化哈巴苷和哈巴俄苷的微波提取工藝。表1 為優(yōu)化實驗因素及因素所取水平。

2.6 玄參提取率的計算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按下式分別求出哈巴苷與哈巴俄苷濃度、提取率及總提取率:

表1 優(yōu)化實驗因素及因素所取水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

式中:C1-哈巴苷的濃度，μg/mL;C2-哈巴俄苷的濃度，μg/mL;A1-哈巴苷的峰面積，mv;A2-哈巴俄苷的峰面積，mv;P1-哈巴苷的提取率，%;P2-哈巴俄苷的提取率，%;P3-哈巴苷和哈巴俄苷的總提取率，%;m-玄參提取液的干燥物質(zhì)量，g;m1-用于測定的干燥物質(zhì)量，g;M-玄參藥材的質(zhì)量，g。

3 實驗結(jié)果

3.1 樣品中哈巴苷和哈巴俄苷的HPLC 測定

取不同濃度的哈巴苷與哈巴俄苷對照品進(jìn)樣，記錄高效液相色譜圖中哈巴苷與哈巴俄苷的峰面積(見圖1A)，建立哈巴苷和哈巴俄苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程:哈巴苷線性回歸方程:Y=5899.6X+6618.1，R2=0.9998;哈巴俄苷線性回歸方程:Y=28559X+11410，R2=0.9997。哈巴苷與哈巴俄苷分別在15～240 μg/mL 和5～80 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

取哈巴苷與哈巴俄苷對照品，分別連續(xù)進(jìn)樣5 次進(jìn)行精密度測定，分別計算平均峰面積，算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果哈巴苷的RSD 為1.07%，哈巴俄苷的RSD為0.94%，都低于2%，表明該儀器的精密度良好。

取5 份已知樣品濃度的提取液0.5 mL，將已知濃度的哈巴苷與哈巴俄苷混合對照品分別按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 分別加入到5 份樣品中，定溶在10 mL 的容量瓶中進(jìn)行回收率實驗，得到峰面積，換算濃度，計算回收率，得到哈巴苷的平均回收率為99.10%，RSD 為1.80%;哈巴俄苷的平均回收率為98.20%，RSD 為1.70%。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)、玄參樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A)and Radix Scrophulariae sample(B)

3.2 單因素實驗

3.2.1 乙醇濃度對玄參哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影響

實驗結(jié)果顯示(見圖2A):當(dāng)溶劑為純水時玄參哈巴苷的提取率最高，哈巴俄苷的提取率最低，在其他實驗條件不變的情況下，隨著乙醇濃度的增大，哈巴苷的提取率降低，哈巴俄苷的提取率升高。因為，一方面乙醇濃度的變化會使溶劑的極性發(fā)生改變，使得哈巴苷和哈巴俄苷及玄參中其他成分的溶出率隨之改變，之所以哈巴俄苷提取率仍然在升高，可能是哈巴俄苷的極性較小;另一方面可以直接觀察到玄參提取液呈黑色，可能因為該色素在乙醇中的溶出很大，抑制了哈巴苷的溶出，但是哈巴俄苷未受影響。由于總苷的提取率是在溶劑為純水時最高，所以選擇純水做溶劑較宜。

3.2.2 料液比對玄參哈巴苷和哈巴俄苷提取率的影響

實驗結(jié)果表明(見圖2B):在其他實驗條件不變的情況下，隨著料液比的增加，測得玄參哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，且均在料液比1∶20 后隨料液比升高提取率無明顯變化。這是因為剛開始料液比小時，隨著料液比增大，兩相濃度差增大，傳質(zhì)速度加快的較為明顯，即玄參提取率增加幅度大。繼續(xù)增大料液比，但傳質(zhì)動力增加不大，所以提取率增加不明顯，考慮節(jié)約成本，所以選擇相對較小的料液比1∶20 更合理。

3.2.3 微波溫度對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

實驗結(jié)果可知(見圖2C):在其他實驗條件不變的情況下，隨著溫度的增大，測得玄參哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，當(dāng)溫度為50 ℃達(dá)到最高，繼續(xù)增大溫度總提取率反而降低。這是由于溫度有助于傳質(zhì)過程，使分子擴散運動更激烈，加快溶質(zhì)的擴散和溶劑的滲透，但隨著溫度升高，雜質(zhì)溶解速度也顯著加快，與哈巴苷和哈巴俄苷形成競爭，干擾其浸出速率，導(dǎo)致哈巴苷和哈巴俄苷的提取率降低。因此微波溫度選擇50 ℃為宜。

3.2.4 微波時間對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

實驗結(jié)果表明(見圖2D):在其他實驗條件不變的情況下，隨著微波提取時間延長，測得玄參哈巴苷和哈巴俄苷的提取率升高，哈巴苷的提取率在30 min 時達(dá)到最高，哈巴俄苷的提取率在25 min 時達(dá)到最高，繼續(xù)延長提取時間總提取率反而降低。這是由于微波時間越長，對細(xì)胞膜的破壞作用越大，溶出的哈巴苷和哈巴俄苷越多，但是過于延長微波提取時間，一方面，細(xì)胞膜的破壞程度過大，其他雜質(zhì)的溶出也會增加，抑制哈巴苷及哈巴俄苷的溶出;另一方面，輻射時間過長可能導(dǎo)致有效成分被破壞，因而提取率降低。又由于總苷的提取率在30 min 時最高，因此微波時間選擇30 min 為宜。

3.2.5 微波功率對玄參哈巴苷與哈巴俄苷提取率的影響

實驗結(jié)果顯示(見圖2E):在其他實驗條件不變的情況下，隨著功率的增大，玄參哈巴苷及哈巴俄苷的提取率均升高，當(dāng)在600 W 的時候達(dá)到最高，繼續(xù)增大功率總提取率反而降低。分析原因，因為微波功率越大時，物料吸收的微波能越多，細(xì)胞破壞程度越大，哈巴苷及哈巴俄苷溶出越多。但微波功率過大，一方面更多的易于被溶劑吸附的物質(zhì)溶出，降低了哈巴苷及哈巴俄溶出率;另一方面，功率過高易使溶劑暴沸，促使溶劑揮發(fā)，降低哈巴苷和哈巴俄苷的提取率。因此微波功率選擇600 W 為宜。

圖2 乙醇濃度(A)、料液比(B)、溫度(C)、時間(D)、功率(E)對提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration(A)，solid-liquid ratio(B)，temperature(C)，microwave time(D)and microwave power(E)on extraction yield

3.3 玄參哈巴苷和哈巴俄苷提取優(yōu)化實驗研究

通過設(shè)計L9(34)正交實驗發(fā)現(xiàn)，影響玄參哈巴苷和哈巴俄苷總提取率因素的主次順序為微波溫度＞微波功率＞乙醇濃度＞微波時間，最佳水平為A1B2C2D2，即最優(yōu)提取工藝參數(shù)為微波溫度50℃，微波功率為600 W，乙醇濃度0%，微波時間30 min，料液比1∶20。在此最佳工藝條件下玄參哈巴苷和哈巴俄苷的總提取率為1.1172%。

表2 正交方案設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and result

3.4 微波輔助提取法與直接加熱水提法的比較

以微波輔助提取最佳條件與直接加熱水提法進(jìn)行比較，結(jié)果如表3。

表3 微波輔助提取法與傳統(tǒng)水提法結(jié)果對比Table 3 Comparison of microwave-assisted extraction method with traditional water extraction method

由上述結(jié)果可見，微波輔助提取法與直接水提法相比，具有縮短提取時間，提高哈巴苷和哈巴俄苷總提取效率的明顯優(yōu)勢。

4 結(jié)論

由單因素及正交實驗考察可知，微波提取玄參哈巴苷和哈巴俄苷的最佳提取工藝條件為:純水提取、微波溫度50 ℃，微波功率為600 W，微波時間30 min，料液比1∶20。此工藝條件下玄參哈巴苷和哈巴俄苷的總提取率為1.1172%。微波輔助提取法比直接水提法更加省時，提取率更高。

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