正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的提取工藝

劉園園 崔柏寧 王艷

摘 要：優(yōu)選玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的提取工藝，采用單因素試驗(yàn)和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)考察料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的提取工藝的影響，玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的最優(yōu)提取工藝為料液比為1∶12，提取3次，每次1.5h。優(yōu)選提取工藝穩(wěn)定可靠，可為玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的提取提供參考。

關(guān)鍵詞：玄參;哈巴苷;哈巴俄苷;L9（34）正交試驗(yàn);提取工藝

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030019

玄參來(lái)源于玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，為常用中藥。玄參中的環(huán)烯醚萜苷類成分哈巴苷和哈巴俄苷具有多種藥理活性。哈巴苷能通過抑制氧化應(yīng)激抑制心肌細(xì)胞凋亡[1]，還具有保護(hù)急性腦缺血的作用[2];哈巴俄苷具有增加免疫力、降壓、鎮(zhèn)痛、解痙等[3]功效。哈巴苷和哈巴俄苷被認(rèn)為是玄參的特征性有效成分，為含有玄參的中成藥的指標(biāo)檢測(cè)成分[4-7]。因玄參中的哈巴苷和哈巴俄苷的藥理活性顯著，優(yōu)化其提取工藝十分必要。

1 儀器與材料

1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）;JA3003電子天平（上海菁海儀器有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）;DHG-9240A烤箱;KDM型調(diào)溫電熱套（天津市靜?？h工興電器廠）;哈巴苷對(duì)照品（南京普儀生物科技有限公司）;哈巴俄苷對(duì)照品（南京普儀生物科技有限公司）;娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）;乙腈（Fisher公司，色譜級(jí)）;磷酸（TED公司，色譜純）;其他試劑為分析純。

2方法

2.1 哈巴苷和哈巴俄苷含量測(cè)定方法建立[8-9]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Orca C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）;

流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）;

梯度洗脫：0～10min，3%～10%A;10～20min，10%～33%A;20～25min，33%～50%A;25～30min，50%～80%A;30～35min，80%A;35～37min，80%～93%;

檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm;

流速：1mL·min-1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取哈巴苷、哈巴俄苷適量，分別精密稱定，加30%甲醇制成含哈巴苷0.146mg·mL-1、哈巴俄苷0.071mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取玄參藥材粉碎過3號(hào)篩，取粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定重量，浸泡1h，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）45min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液4、6、8、12、16、20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件記錄峰面積。以峰面積積分值（Y）對(duì)哈巴苷質(zhì)量（X）作回歸曲線，得回歸方程：Y=163461X+14023.1（R2=0.9993），說明哈巴苷在0.584～2.92μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;以峰面積積分值（Y）對(duì)哈巴俄苷質(zhì)量（X）作回歸曲線，得回歸方程：Y=969097X+25231.3（R2=0.9995），說明哈巴俄苷在0.284～1.42μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定哈巴苷和哈巴俄苷的色譜峰峰面積RSD值分別為2.13%和2.25%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別在供試品制備后的0、2、4、6、8h，精密吸取上述供試品溶液10μL注入液相色譜儀，分別記錄與哈巴苷和哈巴俄苷對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰峰面積RSD值分別為2.47%和2.59%。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下的方法平行制備，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得哈巴苷和哈巴俄苷的含量的RSD值分別為1.92%和1.75%。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品0.25g，精密稱定，共6份，每份分別精密加入哈巴苷1818.8μg和哈巴俄苷279.5μg，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定與對(duì)應(yīng)的哈巴苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰峰面積，計(jì)算加樣回收率為96.12%，RSD值為2.84%。同法測(cè)定哈巴俄苷的加樣回收率為98.04%，RSD值為2.62%。

2.2 單因素試驗(yàn)

綜合評(píng)分=出膏率×0.3+哈巴苷和哈巴俄苷總含量×0.7。

2.2.1 料液比

取玄參藥材10g，加入蒸餾水回流提取1次，每次2h，考察料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14對(duì)提取效果的影響。

2.2.2 提取時(shí)間

取玄參藥材10g，按料液比1∶10加入蒸餾水回流提取1次，考察提取時(shí)間1h、1.5h、2h、2.5h對(duì)提取效果的影響。

2.2.3 提取次數(shù)

取玄參藥材10g，按料液比1∶10加入蒸餾水回流提取2h，考察提取次數(shù)1、2、3、4次對(duì)提取效果的影響。

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）為三因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，正交因素表見表4。

稱取玄參10g，連續(xù)稱取9份，按照L9（34）正交表的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)，以哈巴苷和哈巴俄苷的量為指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化選擇，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表5。

各因素對(duì)玄參中哈巴苷和哈巴俄苷提取工藝影響程度：C>A>B，優(yōu)化的提取工藝為A3B2C3，即料液比為1∶12，提取3次，每次1.5h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述優(yōu)選出來(lái)的提取工藝A3B2C3，進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表7。試驗(yàn)表明優(yōu)選的提取工藝條件符合預(yù)期結(jié)果，提取工藝穩(wěn)定可行，正交試驗(yàn)優(yōu)選方案合理。

3 結(jié)語(yǔ)

玄參中的環(huán)烯醚萜苷類有效成分哈巴苷和哈巴俄苷等為九碳骨架結(jié)構(gòu)，成分分離和提純相對(duì)容易。這類環(huán)烯醚萜苷類具有抗炎、抗微生物、保肝、降血糖等藥理作用[10]。本文優(yōu)化提取玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的工藝，為玄參的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周康）