長(zhǎng)期施用沼液對(duì)檳榔芋根際土壤真菌群落多樣性的影響

劉蘭英，黃 薇，呂 新，何肖云，陳麗華，李玥仁

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽廢棄物的產(chǎn)量越來(lái)越大，沼氣工程為處理畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)廢棄物提供了有效手段[1]。沼液是厭氧發(fā)酵后的副產(chǎn)物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，多以速效性及水溶性狀態(tài)存在，易被作物吸收利用，是一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料[2]。沼液施肥后可以增強(qiáng)土壤肥力，在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)和防病抗逆等方面發(fā)揮重要作用[3]。通過(guò)沼液還田利用可以有效解決沼液的消納問(wèn)題，已成為當(dāng)前畜禽養(yǎng)殖廢棄物資源化利用的重要途徑[4]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2018 年重點(diǎn)推廣的十大類(lèi)型生態(tài)農(nóng)業(yè)模式中，就有4 類(lèi)模式涉及沼液還田利用。沼液進(jìn)入農(nóng)田后會(huì)引起土壤環(huán)境發(fā)生系列改變，包括土壤的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、土壤中重金屬的形態(tài)和含量、土壤酸堿環(huán)境等，而土壤微生物能夠敏感地反映出土壤環(huán)境的變化，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[5]。因此，研究沼液施肥對(duì)農(nóng)田土壤微生物群落及微生態(tài)環(huán)境的影響，對(duì)于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量演變、制定科學(xué)沼液還田方案具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于沼液還田影響土壤微生物的研究主要集中在土壤微生物群落代謝功能多樣性、土壤微生物數(shù)量、土壤細(xì)菌群落特征等方面。鄭學(xué)博等[6]對(duì)旱地紅壤的研究表明，沼液還田顯著影響旱地紅壤微生物群落的代謝活性和多樣性。馮丹妮等[7]對(duì)水旱輪作耕層土壤的研究表明，長(zhǎng)期沼液還田有利于土壤微生物數(shù)量和酶活性的提高，但對(duì)土壤微生態(tài)平衡及土壤質(zhì)量存在潛在威脅。朱金山等[8]對(duì)稻田土壤的研究表明，不同沼液還田年限下稻田耕層土壤細(xì)菌群落組成及多樣性均發(fā)生了明顯變化?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在眾多研究中，有關(guān)沼液還田對(duì)土壤真菌群落特征影響的研究卻較少報(bào)道。土壤真菌作為土壤微生物中主要的類(lèi)群之一，是土壤中有機(jī)物的重要分解者，在陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的變化是評(píng)價(jià)其所在生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定的關(guān)鍵性指標(biāo)之一[9?10]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為此，本文基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)采自連續(xù)施用沼液6 年和未施用沼液的檳榔芋種植地塊土壤真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，探討沼液施用對(duì)土壤真菌群落特征的影響，以及土壤真菌對(duì)由沼液施用引起的土壤理化性質(zhì)變化的響應(yīng)，為促進(jìn)沼液資源化利用，維持畜禽養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)基本情況

采樣點(diǎn)位于建甌市某養(yǎng)豬場(chǎng)糞污處理沼氣工程周邊的農(nóng)田（27°13.30′N(xiāo)；118°12.80′E），該區(qū)域?qū)儆谥衼啛釒ШＱ笮约撅L(fēng)氣候，四季分明，雨量充足，春夏多雨，秋冬干燥，常年平均氣溫約18.80 ℃，降雨量約1 700 mm 左右，無(wú)霜期約286 d。施肥用沼液來(lái)自該養(yǎng)豬場(chǎng)基地沼氣工程充分發(fā)酵后經(jīng)氧化塘處理的液體（沼液與氧化塘的水配比為1∶2），布管道至田里，按需實(shí)施漫灌施肥。供試沼液基本理化性質(zhì)為：pH 7.99，化學(xué)需氧量（COD）285 mg·L?1，五日生化需氧量（BOD5）263 mg·L?1，氨氮475 mg·L?1，總氮978 mg·L?1，總磷22.50 mg·L?1。采樣點(diǎn)土壤質(zhì)地為砂壤土，主要種植作物為檳榔芋，每年只種1 季，3 月中下旬種植，11 月初收獲，冬季閑田。沼液灌溉的田塊按照基肥和追肥方式灌入，在檳榔芋種植前，每667 m2灌入沼液量約15 t 與田土混勻作基肥，隨后每隔15 d 進(jìn)行1 次追肥，每次追肥灌入沼液量約6 t，大概8 月下旬進(jìn)行最后1 次追肥，整個(gè)生長(zhǎng)期都不施用其他肥料，其他農(nóng)藝管理措施均按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)習(xí)慣統(tǒng)一實(shí)施。

1.2 樣品的采集與制備

沼液施肥試驗(yàn)開(kāi)始于2013 年3 月，于2018 年10 月（沼液施肥第6 年），在檳榔芋種植地塊上進(jìn)行根際土壤樣品的采集。采樣時(shí)除去表層枯枝落葉等雜物，用取土器沿著植株的根部采集0～20 cm 土層的土壤樣品，標(biāo)記為BS，同時(shí)采集周邊一處地勢(shì)較高未施用沼液的檳榔芋土壤作為對(duì)照樣品，標(biāo)記為CK，這2 塊檳榔芋田同屬于一個(gè)農(nóng)戶，種植方式和田間管理方式相同。每塊樣地設(shè)置3 份重復(fù)，每份重復(fù)樣品均由5 點(diǎn)取樣法獲得5 個(gè)小樣組成，現(xiàn)場(chǎng)混合均勻后裝入無(wú)菌塑封袋中，放入帶有冰塊的保溫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將取回的土樣分成2 份，1 份用于土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定，另一份存放于-80 ℃冰箱內(nèi)用于DNA 提取。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH 值采用酸度計(jì)法（土∶水=1∶2.5）測(cè)定；有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定；堿解氮采用擴(kuò)散法測(cè)定；速效磷采用鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀采用火焰光度計(jì)法測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)都進(jìn)行全程同步試劑空白控制，每個(gè)樣均設(shè)平行雙樣。

1.4 土壤基因組DNA 提取

采 用 PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories, Carlsbad，CA，USA）試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)，對(duì)土壤微生物總DNA 進(jìn)行提取。將提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用Nanodrop 2000 檢驗(yàn)其質(zhì)量和濃度。

1.5 PCR 擴(kuò)增與高通量測(cè)序

選用引物ITS1-F（CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA）和 ITS2-R（TGCGTTCTTCATCGATGC）， 對(duì)真菌ITS 基因的ITS1 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，30 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系總體積為20 μL，各反應(yīng)組分為：4 μL 5×FastPfu Buffer 緩 沖 液，1 μL 引 物（5 μM），2 μL dNTPs（2.5 mM），2 μL 模板DNA，不足部分由無(wú)菌超純水補(bǔ)足。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN, Germany）凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的擴(kuò)增片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)合格后，使用Illumina 公司的Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（由北京奧維森基因科技有限公司協(xié)助完成）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用QIIME 1.8 軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩查，去除barcode 和primer 并拼接后得到原始序列，經(jīng)進(jìn)一步去除嵌合體及短序列后得到高質(zhì)量序列。使用UPARSE 10.0.240 軟件，對(duì)有效數(shù)據(jù)按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU（operational taxonomic unit）劃分，統(tǒng)計(jì)樣品中每個(gè)OTU 的豐度信息?；贠TU 的結(jié)果，計(jì)算Chao1 指數(shù)、Observed species指數(shù)、PD whole tree 指數(shù)和Shannon 指數(shù)來(lái)進(jìn)行生物多樣性分析。采用RDP Classifier（http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）方法對(duì)照Silva 128（http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 代表性序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋，比對(duì)閾值設(shè)置為70%，并在不同分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成。

樣品在不同分類(lèi)水平上的群落組成比較柱形圖是通過(guò)OrginPro 2015 軟件得到的。利用R 語(yǔ)言的Venn Diagram 程序包和gplot 程序包分別繪制韋恩圖和熱圖，采用Canoco for Windows 4.5 軟件對(duì)真菌群落和理化因子進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期施用沼液對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

對(duì)檳榔芋種植地塊土壤pH 分析結(jié)果表明：連續(xù)施用沼液6 年后，土壤中pH 有降低的趨勢(shì)，但整體變化不顯著（P＞0.05），所測(cè)土樣均呈微酸性。進(jìn)一步對(duì)檳榔芋地塊土壤樣本的主要化學(xué)參數(shù)分析表明：連續(xù)施用沼液6 年后，土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量均有一定程度提高，增幅分別為4.18%、10.92%和48.95%（表1），與未施用沼液土壤相比差異均達(dá)到顯著性水平（P＜0.05）。

表 1 不同施肥方式土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical characteristics of soil under varied fertilizations

2.2 長(zhǎng)期施用沼液對(duì)土壤真菌多樣性的影響

2.2.1 土壤真菌OTU 水平分析 從未施用沼液（CK）和施用沼液（BS）兩組土壤中，分別獲得真菌總有效序列108 605 條和82 479 條，測(cè)序覆蓋率在99%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠比較真實(shí)的反映所測(cè)土壤樣品中真菌群落組成情況。在97%相似性水平下，對(duì)樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)，共劃分出2 202 個(gè)真菌OTUs。未施用沼液土壤（CK）樣品中含有真菌種類(lèi)1 839 個(gè)，施用沼液土壤（BS）樣品中含有1 844 個(gè)，其中CK 和BS 有相同種類(lèi)1 481 個(gè)，特有種類(lèi)分別為358 個(gè)和363 個(gè)（圖1），表明不同施肥方式下土壤真菌OTUs 組成有一定的差異。

圖 1 不同施肥方式土壤真菌OTU 分布韋恩圖Fig. 1 Venn graph on fungi OTU distribution in soil under varied fertilizations

2.2.2 土壤真菌多樣性分析 基于OTU 的結(jié)果，通過(guò)Chao1、Observed species、PD whole tree 和Shannon等4 種不同的計(jì)算指標(biāo)來(lái)進(jìn)行樣品多樣性分析，結(jié)果如表2 所示。Chao1 指數(shù)表征微生物物種的豐富度，用以估計(jì)群落中的OTU 數(shù)目；Observed species指數(shù)用以估計(jì)樣品中實(shí)際觀測(cè)到的OTU 數(shù)目；PD whole tree 指數(shù)表征系統(tǒng)發(fā)育的多樣性指數(shù)；Shannon指數(shù)表征樣品中微生物群落的多樣性程度。由表2可知，與未施用沼液土壤比較，長(zhǎng)期施用沼液土壤Chao1 和Observed species 指數(shù)顯著上升（P＜0.05），增幅分別為30.38%和26.36%，即真菌群落的物種豐富度增加；PD whole tree 和Shannon 指數(shù)也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中PD whole tree 指數(shù)與未施用沼液土壤相比差異達(dá)顯著性水平（P＜0.05），即長(zhǎng)期施用沼液后，土壤真菌群落的多樣性增加。

表 2 不同施肥方式土壤真菌多樣性分析Table 2 Fungal diversity in soil under varied fertilizations

2.2.3 土壤真菌群落組成分析 將2 組土壤樣品中得到的OTU，分別在門(mén)、綱、目、科、屬5 個(gè)水平上進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計(jì)不同組土壤樣品中的真菌群落組成情況，圖2-圖4 分別展示了門(mén)、綱、屬3 個(gè)不同水平的群落結(jié)構(gòu)比較結(jié)果。

圖 2 不同施肥方式土壤真菌群落在門(mén)水平的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of fungal community at phylum level in soil under varied fertilizations

從門(mén)的分類(lèi)水平上看（圖2），2 組土壤真菌主要由子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、未被分類(lèi)的真菌門(mén)（Fungi_unidentified）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）等組成，其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)和未被分類(lèi)的真菌門(mén)，它們占整體真菌群落總豐度的92%以上。對(duì)不同施肥方式土壤中真菌類(lèi)群比較發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施用沼液土壤中被孢霉門(mén)的相對(duì)豐度明顯高于未施用沼液土壤，增幅為88.98%；而擔(dān)子菌門(mén)和未被分類(lèi)的真菌門(mén)的相對(duì)豐度卻低于未施用沼液土壤，分別減少了13.35%和27.14%，可見(jiàn)施用沼液改變了土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度。此外，長(zhǎng)期施用沼液后，土壤中的一些非優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度也發(fā)生了明顯變化，如球囊菌門(mén)和羅茲菌門(mén)所占比例呈減少趨勢(shì)，較未施用沼液土壤分別減少了88.70%和46.62%。

圖 3 不同施肥方式土壤真菌群落在綱水平的相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of fungal community at class level in soil under varied fertilizations

圖 4 不同施肥方式土壤真菌群落在屬水平聚類(lèi)熱圖Fig. 4 Cluster heatmap of fungal community at genus level in soil under varied fertilizations

從綱的分類(lèi)水平上看（圖3），2 組土壤真菌主要由糞殼菌綱（Sordariomycetes）、未被分類(lèi)的真菌綱（Fungi unidentified）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、 傘 菌 綱（Agaricomycetes）、 座 囊 菌 綱（Dothidemycetes）等組成，其中優(yōu)勢(shì)菌綱為糞殼菌綱、未被分類(lèi)的真菌綱、被孢霉綱和傘菌綱，這些類(lèi)群占整體真菌群落總豐度的67%以上。與未施用沼液土壤比較，長(zhǎng)期施用沼液土壤中豐度顯著增加的類(lèi)群為被孢霉綱，增幅為90.12%，而一些非優(yōu)勢(shì)菌群如散囊菌綱（Eurotiomycetes）、球囊菌綱（Glomeromycetes）、古根菌綱（Archaeorhizomycetes）和微球黑粉菌綱（Microbotryomycetes）所占比例顯著減少，較未施用沼液土壤分別減少了47.84%、90.14%、99.29%和97.68%。

為了更形象直觀的呈現(xiàn)長(zhǎng)期施用沼液后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步選取相對(duì)豐度較高（＞1%）的真菌屬進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖4）。

從圖4 中可以看出，2 組土壤真菌群落組成既有一定相似性，又表現(xiàn)出了一定差異性。未被分類(lèi)的真菌屬Fungi unidentified和隸屬子囊菌門(mén)的Pseudeurotium屬聚為一類(lèi)，在2 組土壤樣品中的相對(duì)豐度無(wú)明顯變化。隸屬子囊菌門(mén)的Penicillium屬、Acremonium屬和Sordaria屬、隸屬擔(dān)子菌門(mén)的Psilocybe屬、隸屬球囊菌門(mén)的Pacispora屬聚為一類(lèi)，這些類(lèi)群在兩組土壤中的相對(duì)豐度大小為未施用沼液＞施用沼液，為未施用沼液土壤的優(yōu)勢(shì)菌屬；而隸屬子囊菌門(mén)的Rhodoveronaea屬、Trichoderma屬、Westerdykella屬和Chaetomium屬等、隸屬擔(dān)子菌門(mén)的Saitozyma屬和Ramaria屬、隸屬被孢霉門(mén)的Mortierella屬聚為一類(lèi)，這些類(lèi)群在長(zhǎng)期施用沼液后比例明顯增加，成為施用沼液土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.3 土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

為了分析土壤理化因子對(duì)真菌群落的影響，在門(mén)水平上選取相對(duì)豐度大于0.1%的真菌類(lèi)群與土壤的pH、有機(jī)質(zhì)（OM）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）和速效鉀（AK）等5 個(gè)理化因子進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析。首先對(duì)土壤真菌群落做降趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（Detrended correspondence analysis, DCA）。結(jié)果顯示，4 個(gè)排序軸中梯度最大長(zhǎng)度為0.457，小于3，因此本研究選擇基于線性模型的冗余分析（Reundancy analysis, RDA）進(jìn)行排序（圖5）。

圖 5 不同施肥方式土壤真菌冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis on fungi in soil under varied fertilizations

從圖5 可以看出，未施用沼液和施用沼液土壤為2 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的群落，表明它們之間的真菌群落差異較大，說(shuō)明了施用沼液對(duì)土壤真菌群落的影響比較明顯。RDA 前2 個(gè)排序軸共解釋了98.0%的真菌群落變化，其中第1 排序軸解釋了84.5%的變異。經(jīng)forward 分析，對(duì)真菌群落影響程度排前3 位的土壤因子依次為堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)，蒙特卡羅檢驗(yàn)顯示這3 個(gè)因子對(duì)土壤真菌群落影響顯著（P＜0.05）。堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)存在明顯的協(xié)同作用，其含量與Mortierellomycota、Entorrhizomycota和Cercozoa 等菌群豐度呈極顯著或顯著正相關(guān)，而與Glomeromycota 豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論

施用沼液能夠提高土壤養(yǎng)分含量，增加土壤中微生物的數(shù)量及多樣性指數(shù)[11]。本研究中，多樣性分析結(jié)果表明，長(zhǎng)期沼液施肥明顯增加了土壤真菌的物種豐富度和群落多樣性。這主要是由于沼液的長(zhǎng)期施用改善了土壤理化性質(zhì)，為土壤真菌提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境及充足的能源，從而刺激了真菌微生物的活性，增加其群落的豐富度和多樣性。與本研究相似，鄭學(xué)博等[6]的研究也表明沼液還田會(huì)提高土壤微生物群落功能的多樣性。左狄等[12]關(guān)于不同深度稻田土壤的研究表明，沼液還田顯著增加了各深度土壤中微生物的數(shù)量。而朱金山等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著沼液施肥年限的增加，稻田土壤微生物的物種豐富度和群落多樣性逐漸降低。馮丹妮等[13]關(guān)于水稻油菜輪作土壤的研究也發(fā)現(xiàn)，沼液連年施用不利于豐富耕層土壤細(xì)菌的群落多樣性。這可能與土壤質(zhì)量狀況、不同的沼液成分或不同的澆灌措施等都有密切關(guān)系，如Jose 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，土壤在受到高濃度重金屬污染后，細(xì)菌群落多樣性會(huì)顯著降低。

從群落組成上來(lái)看，本研究在2 組土壤樣品中，真菌鑒定出子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）等主要菌門(mén)，其中子囊菌門(mén)為兩組土壤中豐富度最高的真菌類(lèi)群。與眾多研究結(jié)果一致[15?17]，子囊菌門(mén)在土壤生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在，這可能是因?yàn)樽幽揖梢援a(chǎn)生大量的無(wú)性孢子，從而快速生長(zhǎng)[18]。另外，本研究所測(cè)土壤均呈微酸性，這也就證實(shí)了子囊菌門(mén)為酸性土壤中的主要優(yōu)勢(shì)菌群[19]。同樣，2 組土壤鑒定出的優(yōu)勢(shì)菌綱有糞殼菌綱（Sordariomycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）和傘菌綱（Agaricomycetes），其中豐富度最高的優(yōu)勢(shì)菌為糞殼菌綱，這與徐雪雪等[20]、季凌飛等[21]的研究結(jié)果相類(lèi)似，即該優(yōu)勢(shì)菌普遍存在于土壤中且豐富度最高。

本研究揭示，長(zhǎng)期施用沼液改變了土壤真菌群落的相對(duì)豐度，提高了被孢霉門(mén)的相對(duì)豐度，降低了擔(dān)子菌門(mén)、球囊菌門(mén)、羅茲菌門(mén)等的相對(duì)豐度。同樣，長(zhǎng)期施用沼液提高了被孢霉綱的相對(duì)豐度，降低了球囊菌綱的相對(duì)豐度。大量研究表明，不同施肥模式引起土壤環(huán)境條件的改變，會(huì)間接影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[22?24]。在本研究中，沼液施肥后檳榔芋根際土壤的理化性質(zhì)也發(fā)生了不同程度的變化。RDA 分析結(jié)果顯示，土壤堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)土壤真菌群落影響顯著，之前研究也報(bào)道了這些理化因子對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。如馮翠娥等[25]的研究表明堿解氮含量是影響土壤真菌群落組成最主要的因子之一；武俊男等[26]的研究表明速效鉀含量是決定土壤真菌群落組成的關(guān)鍵因素之一；Liu 等[27]、Luo 等[28]認(rèn)為有機(jī)碳含量是影響土壤真菌多樣性的重要因素。本文中，長(zhǎng)期施用沼液明顯提高了土壤中堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量，這些土壤因子與被孢霉門(mén)豐度呈極顯著或顯著正相關(guān)，與球囊菌門(mén)豐度卻呈極顯著負(fù)相關(guān)，這也就導(dǎo)致了長(zhǎng)期施用沼液后被孢霉門(mén)豐度增加，而球囊菌門(mén)豐度減少。另外，有研究表明，球囊菌門(mén)中分布著大量的叢枝菌根真菌，連續(xù)施用沼液可能會(huì)降低土壤中叢枝菌根真菌含量，進(jìn)而降低了球囊菌門(mén)的相對(duì)豐度[29?30]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與未施用沼液土壤相比，長(zhǎng)期施用沼液后土壤真菌屬水平類(lèi)群的相對(duì)豐度也發(fā)生明顯變化。其中隸屬子囊菌門(mén)的Rhodoveronaea屬、Trichoderma屬、Westerdykella屬和Chaetomium屬等、隸屬擔(dān)子菌門(mén)的Saitozyma屬和Ramaria屬、隸屬被孢霉門(mén)的Mortierella屬豐度明顯增加。這主要是因?yàn)殚L(zhǎng)期的沼液施用為這些菌群的生長(zhǎng)提供了豐富的碳源和氮源，進(jìn)而促進(jìn)了其生長(zhǎng)繁殖。然而，隸屬子囊菌門(mén)的Penicillium屬、Acremonium屬和Sordaria屬、隸屬擔(dān)子菌門(mén)的Psilocybe屬、隸屬球囊菌門(mén)的Pacispora屬，這些類(lèi)群在長(zhǎng)期施用沼液后豐度明顯降低，說(shuō)明這些類(lèi)群對(duì)沼液施肥引發(fā)的環(huán)境變化較為敏感。另外，有研究表明，Trichoderma、Chaetomium、Penicillium、Acremonium等菌屬是目前報(bào)道的纖維素降解菌，對(duì)纖維素分解具有較強(qiáng)的作用[31]。本文施用沼液有效增加了Trichoderma和Chaetomium菌屬的相對(duì)豐度，說(shuō)明土壤施用沼液可能有利于某些纖維素降解菌的生長(zhǎng)，這為后續(xù)從施用沼液土壤中篩選分離能高效分解纖維素的真菌提供了基礎(chǔ)。然而，有關(guān)沼液施肥土壤中哪些菌為有益菌，哪些菌為有害菌，這些菌與檳榔芋生長(zhǎng)發(fā)育之間的關(guān)系還需后期菌群功能分類(lèi)分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本文采用Illumina 平臺(tái)的MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)，從真菌群落多樣性、豐度及組成等方面研究了沼液施肥對(duì)檳榔芋種植地塊土壤真菌的影響。結(jié)果表明，施用沼液明顯提高了土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮和速效鉀含量，土壤理化性質(zhì)的改變影響著土壤真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征。與未施用沼液土壤比較，長(zhǎng)期施用沼液后土壤真菌物種OTUs 數(shù)量、豐富度和群落多樣性有明顯增加，不同分類(lèi)水平上各真菌類(lèi)群所占比例也發(fā)生了改變。真菌門(mén)水平鑒定出子囊菌 門(mén)（Ascomycota）、擔(dān) 子 菌 門(mén)（Basidiomycota）、被 孢 霉 門(mén) （Mortierellomycota）、 球 囊 菌 門(mén)

（Glomeromycota）等類(lèi)群，其中子囊菌門(mén)為土壤中豐富度最高的真菌類(lèi)群。與未施用沼液土壤比較，在長(zhǎng)期施用沼液的土壤中，被孢霉門(mén)中被孢霉綱相對(duì)豐度明顯增加，而球囊菌門(mén)中球囊菌綱豐度明顯減少；長(zhǎng)期施用沼液后土壤真菌屬水平優(yōu)勢(shì)類(lèi)群也發(fā)生明顯改變。RDA 分析結(jié)果表明，施用沼液組土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與未施用沼液組差異較大，土壤堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量是引起土壤真菌群落變化的重要環(huán)境因素。