辛硫磷降解菌D39 的分離鑒定及評(píng)價(jià)

趙曉燕，周方園，吳曉青，史亞微，周紅姿，張廣志，范素素，謝雪迎，潘美霖，張新建*

（1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；2. 北京航天威科環(huán)?？萍加邢薰?，北京 豐臺(tái) 100071）

0 引言

【研究意義】隨著高毒農(nóng)藥的禁用，低毒農(nóng)藥逐漸占領(lǐng)市場(chǎng)。2015～2016 在工信部農(nóng)藥審批新發(fā)證的辛硫磷藥企有455 家，辛硫磷目前已是世界上生產(chǎn)和銷售量最大的有機(jī)磷農(nóng)藥之一[1]。辛硫磷是一種低毒有機(jī)磷殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和畜牧業(yè)中均有使用[2]，長(zhǎng)期過量使用導(dǎo)致辛硫磷殘留超標(biāo)。據(jù)報(bào)道辛硫磷能使成年雄鼠的生殖系統(tǒng)發(fā)生異常，長(zhǎng)期接觸辛硫磷會(huì)危害人們的心臟、肝臟等器官及生殖系統(tǒng)[3?5]。辛硫磷等有機(jī)磷殺蟲劑在糧倉(cāng)、蘑菇拌料、土壤及根莖類作物比在果蔬上殘留時(shí)間長(zhǎng)[6?7]。在糧食加工中，辛硫磷等有機(jī)磷殺蟲劑殘留主要在農(nóng)作物的外表皮部分，因此用作飼料的麥麩、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品均存在辛硫磷嚴(yán)重超標(biāo)的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)辛硫磷降解菌的報(bào)道主要有戴爾福特菌屬（Delftiasp.）[8]、淡紫擬青霉（Paecilamyces lilaciuns）[9]和鄰單胞菌屬（Plesiomonassp.）[10]、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）[11]等，主要探討降解菌對(duì)辛硫磷的降解和降解特性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人研究大多集中在降解菌對(duì)辛硫磷的降解率和降解特性的研究方面，而未見對(duì)辛硫磷降解活性的追蹤及應(yīng)用方面的研究。本課題組篩選到1 株兼具防病作用的辛硫磷降解菌D39，該菌株為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）的新菌株。本研究對(duì)D39 降解活性進(jìn)行定位，并提取胞內(nèi)粗酶液在含辛硫磷的麩皮上進(jìn)行降解活性檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】辛硫磷降解菌D39 及其降解酶系能高效降解辛硫磷殘留，是安全降解糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中辛硫磷殘留的有效途徑，該研究的高效降解菌及其胞內(nèi)降解酶為糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中辛硫磷污染的降解提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白 菜 黑 腐 病 菌Xanthomonas campestrispv.campestris、玉米彎孢葉斑病菌Curvularia Lunata、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea和小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis均為山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存菌種。

1.2 供試培養(yǎng)基

基 礎(chǔ) 無(wú) 機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基（SMM g·L?1）：NaCl 0.5、NH4NO31.00、 K2HPO41.50、 KH2PO40.50、MgSO4·7H2O 0.20，pH 7.0，以辛硫磷作為碳源（固體加瓊脂15 g）。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL（固體加瓊脂15 g）。

1.3 儀器與試劑

儀器設(shè)備: DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏）；HZQ-Q 全溫振蕩器（哈東聯(lián)）；Q10 超純水儀（Millipore）Universal Hood；核 酸 凝 膠 成 像 儀（Bio-Rad）flexlid；PCR 儀（Eppendorf）；Centrifuge5418臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf）；CR22G 低溫高速離心機(jī)（HITACHI）XMTD-8222 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）；Sub-Cell GT 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）；Mini Vortex 渦旋震蕩儀（北京東林昌盛）；HPLC 高效液相色譜儀UltiMate 3000（美國(guó)賽默飛公司）。

試劑: DNA MarkerTaq聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；2XTaqPCR Green Mix，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（EasyPure Genomic DNA Kit），北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。辛硫磷原藥購(gòu)自濟(jì)南嘉禾化工有限公司。

1.4 辛硫磷降解菌的分離

采用富集培養(yǎng)法[10]分離辛硫磷降解菌。2016 年2 月從菏澤巨野后屯村不同的麥地和棉花地取樣10 個(gè)樣品。（通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)辛硫磷高用藥量的地塊為10 塊地，每塊地五點(diǎn)取樣法混合在一起為一個(gè)樣品）在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取樣品土壤10 g，置于100 mL 的SMM 培養(yǎng)基中，加入100 mg·L?1的辛硫磷，30 ℃，150 r·min?1培養(yǎng)1 周，以10%的接種量接入新鮮的SMM 培養(yǎng)基中，并逐步提高（100、200、300、400、500）至辛硫磷的質(zhì)量濃度達(dá)500 mg·L?1。搖瓶五周結(jié)束后，取0.1 mL 的富集液涂布于含300 mg·L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板中，放置恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3 d 后挑取透明圈最大的3 株降解菌，分離純化后挑取單菌落轉(zhuǎn)接于含5 mL 液體LB 的滅菌試管中搖床30 ℃、150 r·min?1培養(yǎng)6 h 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期做為種子培養(yǎng)液，備用。取上述各種子培養(yǎng)液1 mL 轉(zhuǎn)接于含300 mg·L?1辛硫磷原液的液體SMM 培養(yǎng)基中，搖床30 ℃、150 r·min?1液體搖培5 d 后選取降解效果最好的菌株，以只接300 mg·L?1辛硫磷原液的液體SMM 培養(yǎng)基為CK，每處理3 個(gè)重復(fù)。取降解效果最好的菌株再次在含300 mg·L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板上分離純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌株的鑒定

菌株D39 形態(tài)及生理生化特征鑒定: 以劃線分離法在LB 平板上劃出菌株D39 單菌落，在顯微鏡下觀察D39 采用結(jié)晶紫染色后的菌體細(xì)胞形態(tài)特征，生化活性測(cè)定參照常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[12]進(jìn)行。

菌株16S rDNA 基因的克隆及序列比對(duì)：提取D39 的基因組DNA 作為模板，進(jìn)行16S rDNA 基因的擴(kuò)增。一對(duì)引物分別為，正向引物：5′-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-TACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′；25 μL 體系為：模板1 μL，引物（1 mmol·L?1）各1 μL，Mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) 條 件:94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；52.3 ℃，45 s；72 ℃，1.5 min；循 環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min。采用PCR 回收試劑盒回收16S rDNA的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。?.5 kb 左右）后，將其TA 克隆后進(jìn)行測(cè)序（由上海生工測(cè)序公司完成）。測(cè)序結(jié)果通過在線分析（http//:www.ncbi.nlm.nih.gov），與GenBank 中的16S rDNA 基因序列進(jìn)行相似性比較。

1.6 D39 降解活性的定位

D39 接入LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后5 000 r·min?1離心10 min，分別收集離心得到的菌體和上清。用無(wú)菌牙簽分別蘸取菌體和上清于含有300 mg·L?1辛硫磷的SMM 平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，每天觀察平板有無(wú)透明圈出現(xiàn)。

將培養(yǎng)好的菌株用低溫冷凍離心機(jī)在15 ℃、8 000 r·min?1離心10 min，收集離心得到的菌體。將菌體用20 mL、pH 為9.0 的0.05 mol·L?1磷 酸 鹽 緩 沖 液（Na2HPO4-NaH2PO4）洗滌，然后再以8 000 r·min?1離心10 min 收集菌體，按菌體∶緩沖液=3∶1 的量加入少量緩沖液置于冰浴中用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理10 次，每次1 min，以8 000 r·min?1離心10 min，除去細(xì)胞碎片，得胞內(nèi)粗酶液。

將胞內(nèi)粗酶液和上清中的胞外粗酶液分別接入含有300 mg· L?1辛硫磷的SMM 平板上，放于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)，每天觀察平板有無(wú)透明圈出現(xiàn)。

1.7 HPLC 檢測(cè)D39 胞內(nèi)酶對(duì)麩皮上辛硫磷的降解作用

（1）樣品制備

室內(nèi)先將辛硫磷均勻拌入麩皮，使辛硫磷在麩皮中的含量為300 mg·kg?1，等麩皮陰干后再將胞內(nèi)粗酶液噴霧加入含辛硫磷的麩皮，麩皮中酶液濃度為0.1 mg·kg?1，在溫度為25 ℃的條件下，反應(yīng)11 h。在胞內(nèi)粗酶液噴霧加入麩皮后的2、4、6、8、10、11 h 分別取樣用HPLC 法測(cè)辛硫磷的降解率。以不噴酶液的含藥麩皮為對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。辛硫磷原藥用乙腈稀釋成0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg·mL?1五個(gè)質(zhì)量濃度，進(jìn)樣量10 μL，用于制作辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品提取和凈化

取上述制備好的麥麩樣品2 g 于50 mL 離心管中經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，加入乙腈20 mL，于200 r·min?1下?lián)u床高速振蕩1 h，再于6 000 r·min?1下離心5 min，移取上層乙腈相10 mL，經(jīng)氮吹至近干，待凈化。待凈化樣品中加入5 mL 二氯甲烷，劇烈振蕩后靜置分層，棄去上層乙腈相，下層二氯甲烷經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，取1 mL 于微量離心管中，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL 甲醇溶解（色譜純），用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后，待測(cè)。

（3）色譜分析條件

高效液相色譜法[13?14]測(cè)定條件如下，流動(dòng)相為甲醇∶水 = 80∶20，流速為1 mL·min?1，進(jìn)樣量為 10 μL，色譜柱：TC-C18 色譜柱，5 μm，250 mm × 4.6 mm，可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)為230 nm，采用外標(biāo)法定量，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

1.8 菌株D39 對(duì)供試菌株的拮抗性能測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法[15]分別測(cè)定降解菌D39 發(fā)酵液對(duì)白菜黑腐病菌Xanthomonas campestrispv. campestris、玉米彎孢葉斑病菌Curvularia lunata、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp. cucumerinum、蘋果輪紋病菌Botryosphaeria dothidea和小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis的抑制作用。D39 發(fā)酵液為L(zhǎng)B 液體搖培至活菌數(shù)為108CFU·mL?1，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

含300 mg.L?1辛硫磷原液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基SMM 平板30 ℃培養(yǎng)3 d 后，從圖1 可以看出透明圈較大的3 株降解菌為25、26 和39。上述3 株菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生 長(zhǎng) 期 后 轉(zhuǎn) 接 于 含300 mg·L?1辛 硫 磷 原 液 的 液 體SMM 培養(yǎng)基中，搖床30 ℃、150 r·min?1液體搖培5 d后的效果見圖2。從圖2 中明顯能看出來含39、25和26 三株菌的三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液和對(duì)照CK 相比乳白色明顯變淺，其中含39 的培養(yǎng)液已經(jīng)完全澄清透明，說明菌株39 的降解效果最好。

圖 1 各菌株在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈Fig. 1 Hydrolytic halos generated by bacteria on mineral salt medium with phoxim as sole carbon source

圖 2 3 株菌（39、25、26）對(duì)液體SMM 中辛硫磷的降解Fig. 2 Degradation of phoxim in liquid SMM by bacterialstrains 39, 25 and 26

最終選取39 號(hào)菌為高效降解菌進(jìn)行后述試驗(yàn)，將其命名為D39。將D39 在含辛硫磷的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基SMM 平板上分離純化（圖3）后4 ℃和?80 ℃分別保存?zhèn)溆谩?/p>

圖 3 菌株D39 在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈Fig. 3 Hydrolytic halos generated by D39 on mineral salt medium with phoxim as sole carbon source

D39 結(jié)晶紫染色后，顯微鏡檢表明該細(xì)菌菌株為革蘭氏陰性，菌落呈圓形，乳白色，有凸起，邊緣平整，形態(tài)飽滿，光滑濕潤(rùn)，細(xì)胞呈短桿狀（圖4），無(wú)芽胞。

圖 4 D39 的顯微形態(tài)Fig. 4 Microscopic morphology of D39

2.2 菌株的鑒定

菌株D39 的生理生化特性為: 接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性，V～P 反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性，革蘭氏染色顯陰性。

以菌株D39 的基因組DNA 為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示有1 條特異性目的片段，大小1 500 bp 左右（圖5）?；厥赵撈嗡蜕虾Ｉy(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明菌株D39 的16S rDNA 核苷酸序列全長(zhǎng)為1 439 bp，將該序列提交GenBank，序列號(hào)為MT912949。測(cè)序結(jié)果通過在線分析（http : www.ncbi.nlm.nih.gov），與GenBank中的16S rDNA 基因序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)菌株D39 的 序 列 與Delftiasp.的16S rDNA 序 列 同 源 性 為99%。結(jié)合生理生化特征鑒定該菌株D39為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）。

圖 5 16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 16S rDNA PCR product of D39

2.3 D39 降解活性的定位

D39 液體搖培離心后的上清和菌體分別進(jìn)行降解活性檢測(cè)，從圖6-A 中可以看出菌株D39 的降解活性部位在菌體部分。點(diǎn)接菌體部位原本白色的培養(yǎng)基，因培養(yǎng)基中的辛硫磷已經(jīng)被菌體降解掉而變?yōu)橥该?。而接種上清液的部位，培養(yǎng)基依然為白色，即上清液對(duì)辛硫磷沒有降解作用，說明起降解作用的是菌體的胞內(nèi)酶，而不是上清液中的胞外酶。進(jìn)一步提取D39 的胞內(nèi)粗酶液，將胞內(nèi)粗酶液和上清中的胞外酶再次接入含藥平板內(nèi)檢測(cè)降解活性（圖6-B）。從圖6-B 中可以看出有降解活性的是胞內(nèi)酶，而胞外酶沒有降解活性。

2.4 D39 胞內(nèi)酶對(duì)麩皮上辛硫磷的降解作用

辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。從圖7 中可以看出以辛硫磷的濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收峰面積為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。辛硫磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)分別為y=911.05x?3.0448，R2=1，呈極顯著相關(guān)。

注：A 為D39 降解活性定位，B 為酶活部位檢測(cè)Note: A: activities of bacteria and supernatant; B: activities of endoenzymes and extracellular enzyme

圖 7 辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 7 Standard curve of phoxim

胞內(nèi)粗酶液噴霧加入麩皮后在2 、4 、6 、8 、10 、11 h 分別取樣測(cè)辛硫磷的降解率。從圖8 中可以看出隨著時(shí)間的增加，辛硫磷的降解率越來越高，11 h 后胞內(nèi)酶液對(duì)麩皮上辛硫磷的降解率最高，為100%。為了進(jìn)一步確認(rèn)11 h 后胞內(nèi)酶液對(duì)麩皮上辛硫磷的降解率，進(jìn)行了HPLC 檢測(cè)（HPLC 圖譜見圖9），從圖9 中的對(duì)照CK 圖譜中能看出辛硫磷的出峰時(shí)間為4.361 min，而胞內(nèi)酶降解辛硫磷11 h 后的HPLC 圖譜在4.361 min 沒有任何物質(zhì)峰出現(xiàn)，辛硫磷已經(jīng)被完全降解掉，降解率100%。

圖 8 D39 的胞內(nèi)酶對(duì)麩皮上辛硫磷的降解作用Fig. 8 Phoxim degradation on wheat bran by endoenzyme from D39

圖 9 胞內(nèi)酶及對(duì)照11 h 對(duì)麩皮上辛硫磷降解的HPLC 圖譜Fig. 9 HPLC chromatograms of phoxim degradations on wheat bran by endoenzyme from D39 and by CK

2.5 降解菌D39 對(duì)病害的拮抗作用

菌株D39 對(duì)5 種病原菌的抑制作用結(jié)果見表1。從平板對(duì)峙培養(yǎng)5 d 后的結(jié)果中可以看出菌株D39 對(duì)各個(gè)病原菌均有一定的拮抗作用，各處理之間的差異性顯著。其中菌株D39 對(duì)小麥紋枯病菌的抑制效果最好，平均抑菌率為50.00%；對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的平均抑制率最低，為21.05%。

表 1 菌株D39 對(duì)植物病原菌的抑菌作用Table 1 Inhibition activities of D39 on phytopathogens

3 討論與結(jié)論

通過富集培養(yǎng)法從山東菏澤農(nóng)田土壤中分離到一株辛硫磷降解菌，采用傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行D39 的16S rDNA序列分析與屬種間的生理生化測(cè)定，最終確定D39 為戴爾福特菌屬Delftiasp.的1 個(gè)新菌株。2007年沈雨佳[8]也報(bào)道了1 株辛硫磷降解菌XSP-1 為戴爾福特菌屬，該菌株中沒有質(zhì)粒，推測(cè)降解基因可能定位在染色體上。本研究中的D39 菌株全基因組完成圖中表明，D39 存在兩個(gè)質(zhì)粒，其辛硫磷降解基因存在于其中一個(gè)質(zhì)粒上（另文報(bào)道）。迄今為止，戴爾福特菌屬已發(fā)現(xiàn)了2 株辛硫磷降解菌。

采用對(duì)峙培養(yǎng)法分別測(cè)定降解菌D39 發(fā)酵液對(duì)白菜黑腐病菌、玉米彎孢葉斑病菌、黃瓜枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和小麥紋枯病菌的抑制作用，結(jié)果表明降解菌D39 發(fā)酵液對(duì)4 種病原菌均具有一定的抑制作用，其中對(duì)小麥紋枯病抑菌效果最好，對(duì)峙培養(yǎng)5 d 后平均抑菌率為50.00%。單一功能的降解菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不易推廣，兼具防病作用的降解菌不但拓寬了降解菌D39 的應(yīng)用范圍，也更加實(shí)用。

考慮到辛硫磷殘留在糧倉(cāng)、飼料等農(nóng)副產(chǎn)品中無(wú)法直接用菌液的問題，對(duì)降解菌的降解活性進(jìn)行定位，并進(jìn)行胞內(nèi)粗酶液的提取和粗酶液對(duì)麩皮辛硫磷殘留的降解試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，胞內(nèi)粗酶液在作用了11 h 后，經(jīng)HPLC 法檢測(cè)對(duì)麩皮上300 mg·kg?1辛硫磷的降解率為100%。目前我國(guó)食品中農(nóng)藥最大殘留限量（GB2763—2016）的標(biāo)準(zhǔn)中辛硫磷的最大殘留限量：水果、稻類、麥類中均為0.05 mg·kg?1，蔬菜中除大蒜、結(jié)球甘藍(lán)、普通白菜為0.1 mg·kg?1外，其余均為0.05 mg·kg?1。D39 的胞內(nèi)酶能快速降解食品和蔬菜中的各種辛硫磷殘留，未來采用酶降解糧食和農(nóng)副產(chǎn)品中的辛硫磷殘留也更加安全，本研究為降解菌D39 以后進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。