基因芯片技術(shù)在動物疫病檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展

黃瀟航，施遠(yuǎn)妮，符云芳，江和基，黃志堅，殷光文*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建福州350002； 2. 福建省動物藥物工程實(shí)驗室，福建福州350002)

基因芯片技術(shù)是1種結(jié)合DNA探針，基于分子雜交技術(shù)原理，具有高靈敏性、高特異性、高通量等特點(diǎn)的新型快速檢驗檢測技術(shù)。目前在動物疫病診斷上的應(yīng)用已較為成熟，特別是針對重要人獸共患病及對生產(chǎn)具有重大威脅的動物疫病的檢測顯示出明顯的優(yōu)勢。

1 檢測技術(shù)原理及特點(diǎn)

基因芯片技術(shù)的原理為大量合成的DNA探針有序地固定在芯片載體表面成為基因芯片，待檢樣品經(jīng)過擴(kuò)增和標(biāo)記后，與基因芯片雜交反應(yīng)，掃描并分析雜交反應(yīng)的信號，即可得到待檢樣品的基因信息[1]。基因芯片技術(shù)相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)具有靈敏度高、高通量的特點(diǎn)。此外，基因芯片技術(shù)減少了傳統(tǒng)檢測技術(shù)中為同時檢測多種病原而增加多種引物帶來的非特異性反應(yīng)的發(fā)生概率，對于多種病原混合感染的診斷顯示出較大的優(yōu)勢。在重大動物疫病檢測中投入使用能夠?qū)σ卟≡缙诒O(jiān)控提供重要的技術(shù)保障，同時也在出入境疾病檢驗檢疫中發(fā)揮較好的監(jiān)測作用。

2 在重要動物疫病檢測中的應(yīng)用

2.1 豬病檢測隨著外來豬種的大量引入，我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中疫病流行情況日益復(fù)雜化，以PCR、血清學(xué)檢測為主導(dǎo)的傳統(tǒng)檢測技術(shù)開始暴露出諸如假陽性，或因靈敏度較低而無法對某些病原潛伏期及早期感染做出快速診斷等弊端，而基因芯片技術(shù)可克服這方面的缺陷。在豬病毒病的診斷方面，吳鳳筍等[2]建立了豬細(xì)小病毒的基因芯片檢測技術(shù)，檢測靈敏度可達(dá)34.5 ng/μL，采用濃度為5 μmol/L的探針與PCR產(chǎn)物于47 ℃雜交1 h即可得到清晰的熒光信號。在對病毒的混合感染鑒別診斷方面，馬銳等[3]運(yùn)用基因芯片檢測技術(shù)在特異性驗證中能夠較好地與臨床上誘發(fā)豬腹瀉癥狀的幾類病毒進(jìn)行有效區(qū)分。在多類型病原混合感染的檢測上，肖國生等[4]針對豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌建立的基因芯片檢測技術(shù)能夠有效鑒別診斷混合感染病例，與PCR檢測及病原檢測陽性率結(jié)果重復(fù)率達(dá)95%以上。該項技術(shù)在豬群疾病中的檢測應(yīng)用在一定程度上填補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的空白，能夠滿足我國豬病流行日趨復(fù)雜形勢下的多樣本、高精度、低濃度的檢測需求。

2.2 禽病檢測禽類病毒性疾病的檢測對于保障禽類養(yǎng)殖的正常生產(chǎn)具有重要意義，特別是在禽白血病、馬立克氏病、傳染性法氏囊病等對生產(chǎn)危害較大的禽病檢測中，高特異性、高靈敏度、高精確度的低成本、快速早期診斷技術(shù)在家禽和水禽生產(chǎn)群體病原凈化方面的源頭把控發(fā)揮著重要作用?；蛐酒夹g(shù)目前主要應(yīng)用在馬立克氏病病毒、禽白血病病毒、傳染性法氏囊病病毒等病原的快速檢測，在實(shí)驗室檢測和基層實(shí)踐驗證中具有較好的效果。朱瑞豪[5]通過建立檢測多種雞免疫抑制性病毒的基因芯片技術(shù)，能夠?qū)Τ涂截悢?shù)(copies)病原進(jìn)行有效檢測。廖秀云等[6]針對禽流感病毒、新城疫病毒和雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒等病原建立的基因芯片檢測方法對病原核酸濃度的最低檢出限為 4.83 pg/μL，靈敏度較高，與病毒分離鑒定結(jié)果高度吻合。對于近年來新發(fā)和關(guān)注的坦布蘇病毒等水禽病毒，國內(nèi)已陸續(xù)建立了相應(yīng)的液相芯片技術(shù)應(yīng)用于禽類病毒株的混合感染檢測，效果較為理想。王櫻歷等[7]建立的2種水禽病毒液相芯片檢測技術(shù)，變異系數(shù)分別為1.44%、3.94%，可重復(fù)性更強(qiáng)。

2.3 草食動物疫病檢測在草食動物疫病檢測領(lǐng)域，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用在牛、羊、馬等草食家畜的烈性傳染病防控中，其中圍繞人獸共患病病原，如口蹄疫、布氏桿菌、結(jié)核桿菌等存在公共衛(wèi)生潛在風(fēng)險的病原，基因芯片技術(shù)發(fā)揮著疫病跟蹤監(jiān)測的重要作用。李鐵鋒等[8]通過對布氏桿菌特定菌株的抗原構(gòu)建了適用于布氏桿菌的膜基因芯片技術(shù)，特異性較強(qiáng)，適合于基層檢測。在病毒檢測方面，陳圣軍等[9]成功建立了同時檢測牛傳染性鼻氣管炎和赤羽病2種牛群傳染病的基因芯片檢測方法，體現(xiàn)出較好的特異性，且反應(yīng)靈敏度高。在馬疫病診斷方面，基因芯片技術(shù)的使用為馬流行性疫病的早期防控提供了更好的監(jiān)測途徑。汪琳等[10]建立了同步檢測包括非洲馬瘟、西尼羅熱病毒等在內(nèi)的多種病毒的基因芯片檢測方法，將檢驗檢疫時間由7～14 d 短到7 h內(nèi)完成。目前國內(nèi)現(xiàn)有針對草食動物病毒的基因芯片檢測技術(shù)可以同時檢測分別來自不同草食家畜的5種病毒。徐超等[11]建立的多種草食動物毛皮攜帶的部分病毒樣品最小檢測濃度可以低到20 拷貝，且與用于試驗對比研究的4種豬禽、病毒無交叉反應(yīng)。對于一些遺傳性疾病的監(jiān)測，基因芯片技術(shù)也具備進(jìn)一步開發(fā)的潛力。在牛的白細(xì)胞黏附缺陷病遺傳檢測中，使用基因芯片技術(shù)能夠篩選出攜帶有BLAD基因缺陷的牛，變異系數(shù)在5%以內(nèi)[12]。

2.4 水產(chǎn)動物疫病檢測水產(chǎn)動物疫病防控是困擾漁業(yè)發(fā)展的重要難題，目前基因芯片技術(shù)也被國內(nèi)研究人員嘗試應(yīng)用在魚類等水產(chǎn)動物疾病的檢測中。弧菌病是危害魚類養(yǎng)殖的一大類重要傳染性疾病，某些弧菌感染嚴(yán)重影響魚類的正常生長發(fā)育，造成魚類群體發(fā)病和死亡。朱鵬飛等[13]針對副溶血弧菌等4類弧菌病建立了同步檢測的基因芯片技術(shù)，在檢測性能上相較于普通PCR方法更為靈敏。王勝強(qiáng)等[14]建立了對7種海水養(yǎng)殖魚類病毒的檢測技術(shù)，與普通PCR檢測結(jié)果基本相符，且具備較好的重復(fù)性和特異性。在蝦蟹等甲殼動物病毒性疾病的檢測中，除了基因芯片技術(shù)外，其他芯片檢測技術(shù)也發(fā)揮著出色的作用。王政等[15]研發(fā)的芯片檢測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對蝦桃拉病毒、黃頭病毒、白斑病毒3種病毒的高效檢測。在漁業(yè)疫病監(jiān)測方面，基因芯片技術(shù)相比于普通PCR檢測技術(shù)更適合于多種類型病原和混合感染情況的病原鑒別診斷。

2.5 實(shí)驗動物疫病檢測實(shí)驗動物的身體狀況對于實(shí)驗室動物試驗開展和結(jié)果的真實(shí)性具有不可忽視的影響，因此在專業(yè)的權(quán)威實(shí)驗動物生產(chǎn)機(jī)構(gòu)，對實(shí)驗動物特別是SPF動物采用高效的檢測方法進(jìn)行定期的病原檢測對實(shí)驗動物生產(chǎn)和試驗投入意義重大。Wu M等[16]采用芯片技術(shù)建立了能夠同步檢測犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒5種犬類病毒的檢測方法，為犬科實(shí)驗動物的健康生產(chǎn)和環(huán)境監(jiān)測提供了技術(shù)保障。尹雪琴等[17]借助基因芯片中的液相芯片技術(shù)建立了能夠監(jiān)測實(shí)驗小鼠痘病毒、腺體病毒、巨細(xì)胞病毒、多瘤病毒等4種病毒性疾病的監(jiān)測方法，具備靈敏度較高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。Wu M等[18]建立了能夠同時檢測兔輪狀病毒、仙臺病毒、兔出血癥病毒3種兔病毒的芯片檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對于濃度為100 copies/μL病毒樣品的檢測，與PCR陽性檢出率相符合。從實(shí)驗動物疫控和監(jiān)測方面的研究來看，基因芯片及相關(guān)芯片技術(shù)能為實(shí)驗動物的質(zhì)量監(jiān)管和環(huán)境監(jiān)測甚至實(shí)驗動物檢疫起到一定的幫助。

2.6 寵物疫病檢測冠狀病毒是困擾犬、貓健康的重要致病原，目前盡管對于冠狀病毒的早期診斷已經(jīng)有了多種檢測技術(shù)，但是由于技術(shù)方面存在的不足，對冠狀病毒等毒株的復(fù)雜流行情況的檢測依舊存在較大不足。李健等[19]對犬、貓多種冠狀病毒建立了芯片檢測方法，其性能優(yōu)于PCR方法。此外，在犬、貓等寵物與人類共患的諸如狂犬病的快速診斷檢驗檢測技術(shù)上，基因芯片技術(shù)發(fā)揮著重要作用。張偉等[20]通過建立的狂犬病病毒基因芯片檢測技術(shù)與ELISA、RT-PCR進(jìn)行驗證比較，發(fā)現(xiàn)同批樣品的陽性檢出率要遠(yuǎn)高于2項傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，靈敏度較高。此外，在弓形蟲等寄生性原蟲的檢查上，基因芯片對于快速診斷也具有出色的效果。伴隨著社會生活水平的提高，犬、貓等寵物作為伴侶動物成為許多家庭中的重要成員，寵物的疾病與保健逐漸成為關(guān)注焦點(diǎn)。其中犬瘟熱等對寵物犬具有重要致病性的烈性傳染病，國內(nèi)研究人員也嘗試將基因芯片技術(shù)應(yīng)用在其早期檢測上，為寵物病毒性疾病的早期診斷作出了重要貢獻(xiàn)。因此，在寵物疫病監(jiān)測上基因芯片技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景和進(jìn)一步的開發(fā)價值。

3 小結(jié)與展望

基因芯片技術(shù)在處理大批量樣本方面體現(xiàn)出檢測耗時短、特異性強(qiáng)且不容易發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。然而該項技術(shù)還存在諸多不足，需要不斷改進(jìn)和研究。目前該項技術(shù)研發(fā)主要集中在細(xì)菌、病毒性傳染病和遺傳性疾病等檢測領(lǐng)域，特別是在細(xì)菌、病毒檢測上應(yīng)用較多，而在寄生蟲研究領(lǐng)域報道較少，目前僅在弓形蟲等領(lǐng)域有相關(guān)報道。其在未來的寄生蟲領(lǐng)域尤其是腸道原蟲感染的早期檢測方面的進(jìn)一步研發(fā)和推廣應(yīng)用前景值得期待。