宏基因組學(xué)在病毒研究上的應(yīng)用概述

曾茂芹，劉妍罕，張 飄，楊 霞，程振濤，文 明

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州貴陽550025)

病毒是引起動物傳染病的主要病原體之一，具有廣泛的宿主及復(fù)雜的遺傳多樣性。病毒在微生物生態(tài)系統(tǒng)中處于重要的地位，然而在某些環(huán)境中病毒微生物群落的全球多樣性研究還處于初級階段[1]。據(jù)估計，目前人們對病毒世界的探知還不及1%[2]。在2018年4月出版的《自然》雜志上報道了1個國際研究團隊已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過200種以前不為人知的病毒，能夠?qū)е掳鞲泻统鲅獰岬仍趦?nèi)的疾?。辉诩棺祫游镏邪l(fā)現(xiàn)了214種之前從未被描述過的RNA病毒[3]。病毒形態(tài)小、基因組變異情況復(fù)雜、基因組功能靈活，導(dǎo)致研究難度較大。很多病毒缺乏可分離培養(yǎng)的細胞系，使得60%以上的病毒無法分離獲得[4，5]。近年來，新發(fā)生的傳染病引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，主要為新出現(xiàn)的病原體或者經(jīng)過變異而具有新的生物學(xué)特征的已知病原體所引起的傳染性疾病，其中大多數(shù)是病毒性傳染病。傳統(tǒng)的病毒發(fā)現(xiàn)方法有病毒培養(yǎng)、電鏡觀察、血清學(xué)檢測和PCR檢測等，在前期研究中發(fā)揮了重要作用，但是這些方法自身的缺陷也限制了對新病毒的發(fā)現(xiàn)。如：病毒培養(yǎng)只能對少數(shù)病毒，而某些病毒缺乏特異的細胞系或者生長過程中觀察不到細胞變性(CPE)；電鏡觀察靈敏度相對較低；血清學(xué)檢測中高效特異性抗體很難獲得，有的會出現(xiàn)交叉反應(yīng)而影響結(jié)果；PCR檢測則必須在已知基因序列的基礎(chǔ)上進行下一步操作，對于未知的病毒則無能為力[6]。此外，病毒本身也在不斷進化以適應(yīng)宿主環(huán)境，增加其核酸多樣性，產(chǎn)生新的病毒物種或新的病毒亞型，擴大其宿主范圍。開發(fā)研究新的病毒檢測和發(fā)現(xiàn)技術(shù)是研究病毒首要解決的問題。

病毒宏基因組學(xué)(Viral metagenomics，VM)是1種突破傳統(tǒng)方法限制，無需知道病毒核酸序列，而是直接以生物環(huán)境中的病毒為研究對象，快速地鑒定出環(huán)境中已知和未知的病毒的新興病毒組學(xué)研究技術(shù)。通過這種技術(shù)可發(fā)現(xiàn)很多新病毒，為病毒性疾病的預(yù)防和治療打開新的領(lǐng)域。其克服了傳統(tǒng)病毒檢測方法所存在的局限性，在監(jiān)測病毒變異、觀察病毒群落、發(fā)現(xiàn)新病毒、檢測病毒流行情況等方面展現(xiàn)出強大的優(yōu)勢并擁有十分廣闊的應(yīng)用前景，為人類預(yù)防和診斷新發(fā)、突發(fā)病毒性傳染病提供了有力的檢測技術(shù)和方法。

1 宏基因組學(xué)的原理和方法

宏基因組學(xué)最早可以追溯到1991年，Schmidt T M等[7]首次提出環(huán)境基因組學(xué)(Environmental Genomics)的概念。傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)分析主要針對細菌和真菌，2002年Breitbart M等[8]第1次將宏基因組學(xué)應(yīng)用于病毒群落研究，應(yīng)用“鳥槍法”測序研究了海水中的病毒組(Virome)，發(fā)現(xiàn)海水中主要病毒組為噬菌體。直到2005年，Edwards R A等[9]首次提出病毒宏基因組學(xué)這一概念，描述了噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)?？偟膩碚f，病毒宏基因組學(xué)就是通過一些手段把某些環(huán)境中全部病毒同其他微生物區(qū)分開來，然后把所獲得的病毒組的核酸文庫帶入現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫進行一致性比對，以達到獲得環(huán)境中病毒組構(gòu)成的結(jié)果。在此過程中無需知道病毒的核酸序列，而是直接以環(huán)境中的病毒組為研究對象，快速、簡便地檢測出已知和未知的病毒。目前，病毒宏基因組學(xué)已經(jīng)在很多環(huán)境樣本的研究中得到了廣泛應(yīng)用，包括淡水、土壤、動物的腸道等[10]。病毒宏基因組學(xué)通常有2種研究方法。第1種為泛病毒芯片(Pan-Viral Microarrays)，就是將所有已知病毒的代表性序列制成微陣列芯片。雖然泛病毒芯片這種方式可以用來檢測幾乎所有的已知病毒，但是該技術(shù)在篩選宏基因組文庫時不能鑒定未知序列的新病毒，且對于環(huán)境中豐度低和變異大的病毒檢測效果也不理想。第2種為高通量測序(High Throughput Sequencing)，開展病毒宏基因組學(xué)研究樣品的選擇與處理十分重要，而不同樣品中的病毒含量差異很大，因此在兼顧環(huán)境類型的同時，需選擇病毒含量豐富且易處理的樣品。從初期感染的組織器官中得到的病毒核酸含量更低，因此需要對病毒進行富集，一般將病毒濃縮到每微升106個粒子以上最為理想。此外，處理時還需要再添加核酸酶降解游離核酸以避免宿主基因組和其他游離基因的干擾。提取的核酸往往采用隨機引物法(Sequence Independent Single Primer Amplification，SISPA)進行擴增，擴增后的產(chǎn)物便可高通量測序。研究方法大致有如下幾個步驟：樣品處理、遺傳物質(zhì)的分離與富集、文庫構(gòu)建、宏基因組學(xué)序列的分析和篩選等[11]。

2 宏基因組學(xué)在動物病毒研究上的應(yīng)用

2.1 在水產(chǎn)動物病毒鑒定中的應(yīng)用近年來，全世界都遇到1個阻礙水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴重問題，即水產(chǎn)養(yǎng)殖中病毒性疾病的發(fā)生越來越嚴重，而且大多數(shù)魚類是人的主要食物來源，魚類所攜帶的病毒很有可能傳染給人。針對這一問題，世界各國病毒學(xué)家都對水產(chǎn)動物病毒的研究給予了高度重視，并獲得了大量的研究成果[12]。目前已從養(yǎng)殖和野生水生動物中鑒定出虹彩病毒、呼腸孤病毒、彈狀病毒、皰疹病毒和雙RNA病毒等不同的病毒[13，14]。隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，給水產(chǎn)動物病毒的鑒定與發(fā)現(xiàn)帶來了很多便利。病毒宏基因組學(xué)方法直接利用魚類樣本中的病毒基因序列作為研究對象，能夠快速、有效地發(fā)現(xiàn)各種未知魚類病毒，而且能直觀地顯示各種魚類樣本中病毒的種類與豐度。這樣就可以方便地了解病毒的分布情況，對某些病原和潛在致病病毒的變化進行實時監(jiān)測。同時有望診斷由新的或未知病原體引起的魚類疾病，有利于促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時也能更好地保障人類健康[15]。

2.2 在陸生動物病毒鑒定中的應(yīng)用病毒性傳染病不僅嚴重威脅人類的生命安全而且影響經(jīng)濟的發(fā)展。近年來流行的病毒性傳染病的最大特點就是病原多為動物源性病毒。如：源自于黑猩猩的艾滋病病毒[16]，來自于蝙蝠的埃博拉病毒[17]，來源于中華菊頭蝠的“非典”冠狀病毒[18]，由綠猴傳播的馬爾堡病毒[19]，以及現(xiàn)在尚不確定，但初步認為是源自蝙蝠的“新型肺炎冠狀病毒”等。呼吸系統(tǒng)疾病(BRD)是對養(yǎng)殖業(yè)影響最大的疾病，其影響因素包括環(huán)境、遺傳和傳染等，確定致病病毒比較困難[20]。Cassidy L.Klima等[21]通過病毒宏基因組學(xué)方法對BRD病例的呼吸道分泌物中的病毒直接進行表征，再結(jié)合病例對照可以提供與復(fù)雜傳染病相關(guān)的候選病原體，將研究的范圍有效地縮小，為進一步研究提供參考。病毒性傳染病的傳播速度快、影響力大、防治難度大。防控病毒性傳染病不僅要關(guān)注人類本身，還要監(jiān)測病毒在動物和環(huán)境中的動態(tài)分布，掌握病毒在中間宿主的攜帶情況。對此，病毒宏基因組技術(shù)將為我們提供更簡便的方法、更優(yōu)質(zhì)的手段，可以突破傳統(tǒng)檢測鑒定技術(shù)的限制，特別是對未知病毒的及時檢測和發(fā)現(xiàn)具有重要作用和意義。

3 宏基因組學(xué)在人類醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

3.1 在臨床醫(yī)學(xué)檢測中的應(yīng)用目前在臨床醫(yī)學(xué)上仍有很多不明原因的疾病，僅靠常規(guī)的實驗室檢測技術(shù)難以做出診斷，這類疾病往往具有很高的發(fā)病率和死亡率。例如，據(jù)報道我國每年有高達40%，總數(shù)約180萬的嬰兒發(fā)生腹瀉，但具體病因不明[22]。Svraka S等[22]對不明病因的臨床標本進行細胞培養(yǎng)，利用病毒宏基因組技術(shù)對1 834份細胞培養(yǎng)上清液進行病原篩查，發(fā)現(xiàn)BK多瘤病毒、單純皰疹病毒及新型Saffold病毒，為臨床診斷提供了重要參考。Law J等[23]利用病毒宏基因組學(xué)對慢性乙肝、丙肝、自身免疫性肝炎、非酒精脂肪肝等病人的血漿進行研究，結(jié)果表明該方法不但快速、可靠，而且檢測范圍還能擴大到病人的尿液、膽汁、唾液及其他體液。2017年，Yan F等[24]報道了1例因嚴重的社區(qū)獲得性肺炎入院治療的60歲女性患者病例，大量的微生物檢測結(jié)果均為陰性；對患者的支氣管肺泡灌洗液和咽喉拭子標本進行宏基因組測序，結(jié)果顯示人類鼻病毒B91是含量最豐富的微生物，占全部序列的58.8%，提示感染病原為人類鼻病毒B91，后經(jīng)病毒稀釋血清中和試驗得到驗證。另有1名有腎移植病史的14歲患者因發(fā)熱、畏寒、身體疼痛等癥狀就診，此后36 h癥狀加重，甚至出現(xiàn)精神錯亂和語言障礙等表現(xiàn)，傳統(tǒng)的檢測方法均無法確定病因；研究者從該患者的腦脊液中提取RNA進行宏基因組深度測序，成功鑒定出西尼羅病毒，確定為西尼羅病毒感染[25]。此外，許多臨床上的腸胃炎、腹瀉、呼吸組織感染及腫瘤等疾病的確診及新病毒的發(fā)現(xiàn)都得益于病毒宏基因組學(xué)[26，27]。病毒宏基因組學(xué)技術(shù)突破了傳統(tǒng)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)病毒檢測方面的局限，為病毒核酸檢測提供了更加方便快捷的方法，從而促進人類醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展。

3.2 在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)不同于傳統(tǒng)的檢測方法，無需知道病毒核酸序列即可快速地檢測出病毒，因此可以作為快速監(jiān)測病毒性傳染病的有效手段。例如：2009年H1N1型流感病毒暴發(fā)，Greninger A L等[28]使用宏基因組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)現(xiàn)并獲取了該型流感病毒的全基因組序列。在另一項研究中，Towner J S等[29]利用宏基因組測序，確認了烏干達出血熱暴發(fā)是由1株新型埃博拉病毒引起。2015年在南美洲、中美洲和加勒比地區(qū)暴發(fā)的寨卡病毒疫情引起了廣泛關(guān)注，研究者使用高通量測序從2名孕婦患者的羊水標本中檢測出寨卡病毒，最終確定了感染病原。眾所周知，在控制傳染病方面預(yù)防的效率要比治療高得多，因此對于未知病原的快速檢測和預(yù)防是1項大工程。如何及時、快速、高效地檢測病毒一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的關(guān)注重點。病毒宏基因組學(xué)在未知病毒的檢測和鑒定上的成功運用，將會成為檢測和預(yù)防病毒性傳染病的有效手段，從而促進人類公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。

4 小結(jié)與展望

宏基因組學(xué)通過在新病毒發(fā)現(xiàn)和醫(yī)學(xué)上的成功運用，有效地證明了其作為1項新興檢測病毒技術(shù)的強大作用。它突破了傳統(tǒng)檢測方法的局限，能快速有效地檢測出病毒性疾病和發(fā)現(xiàn)新病毒，這一特點將為我們預(yù)防和診斷新發(fā)、突發(fā)病毒性傳染病提供有力的檢測技術(shù)。目前，宏基因組學(xué)技術(shù)已被發(fā)達國家廣泛應(yīng)用于臨床標本檢測和新病毒的發(fā)現(xiàn)；在我國主要應(yīng)用于感染性疾病的診治、腸道微生物的研究、動物病毒性疾病的檢測等方面[30～32]。宏基因組學(xué)也存在一些局限，主要因為在高通量測序技術(shù)中，樣品的處理需要過濾掉雜質(zhì)，而每次過濾都會損失一些病毒粒子，從而為后續(xù)的分析增加了難度；而且得到的數(shù)據(jù)是龐大的，這也為后續(xù)的生物信息學(xué)分析加大了難度。雖然此項技術(shù)目前還面臨著很多的難點和需要完善的地方，但隨著生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和提高，宏基因組學(xué)技術(shù)將會被廣泛應(yīng)用于病毒方面的研究，從而推動我國生物學(xué)和醫(yī)學(xué)事業(yè)邁上新的臺階。