寧夏部分地區(qū)奶牛場(chǎng)犢牛腹瀉病原調(diào)查分析

黎玉瓊，郭亞男，2*,牛曉昊，2，黃 亮

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750021)

犢牛腹瀉是犢牛養(yǎng)殖中極其常見的一種病癥，也是犢牛培育過程中的重要難題，很容易造成犢牛生長(zhǎng)發(fā)育不良[1]。由于其具有較高的發(fā)病率和死亡率，因此每年給肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。引起犢牛腹瀉的病因極其復(fù)雜，包括感染性因素和非感染性因素[2]。非感染性因素主要包括飼喂不當(dāng)、護(hù)理不當(dāng)或飼養(yǎng)環(huán)境惡劣等飼養(yǎng)管理方面的因素[4]；感染性因素主要包括產(chǎn)毒素性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、輪狀病毒、冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、隱孢子蟲以及球蟲等的感染，臨床上常呈現(xiàn)2種以上病原的混合感染[4-5]。犢牛發(fā)生腹瀉時(shí)，養(yǎng)殖技術(shù)人員常主觀判斷病因?yàn)榇竽c埃希氏菌、沙門氏菌等細(xì)菌感染，以及輪狀病毒等病毒感染，忽視或不大考慮寄生蟲感染如賈第鞭毛蟲、球蟲和隱孢子蟲。事實(shí)上，在臨床中引起犢牛腹瀉的原因較為復(fù)雜，包括犢牛自身免疫力、所處環(huán)境、營養(yǎng)以及傳染性因子等多種因素，是這些因素相互作用的結(jié)果。因此，準(zhǔn)確及時(shí)診斷犢牛腹瀉的病因尤為重要。

奶牛和肉牛產(chǎn)業(yè)為寧夏地區(qū)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，在國內(nèi)肉牛和奶牛養(yǎng)殖量和養(yǎng)殖水平上均名列前茅，但是犢牛腹瀉問題一直是困擾養(yǎng)殖戶的重要難題之一。因此，本研究通過對(duì)寧夏地區(qū)10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)0～60日齡132份頭腹瀉犢牛糞便樣本進(jìn)行隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲和球蟲進(jìn)行病原學(xué)調(diào)查，旨在掌握寧夏地區(qū)致犢牛腹瀉的主要病原體及常發(fā)年齡段，為犢牛腹瀉病的診斷和治療及疾病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 BoviD-5 Ag Test Kit(輪狀病毒、冠狀病毒、隱孢子蟲、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲)(RG1302DD)，韓國安捷公司產(chǎn)品；氯化鈉，天津市鼎盛鑫化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)板(A3875)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所產(chǎn)品；顯微鏡(CX31)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便采集 通過直腸采集腹瀉犢牛糞便，記錄牛場(chǎng)、牛號(hào)、出生日期。共采集了10個(gè)規(guī)?；?chǎng)0～60日齡犢牛糞便共計(jì)132份。

1.2.2 病原檢測(cè) 輪狀病毒、冠狀病毒、隱孢子蟲、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲檢測(cè)：用棉簽收集糞便，將糞便插入試管并攪拌10次，室溫靜止1 min，用吸管小心吸取上清液并加入4滴混合液，10 min后判斷結(jié)果。

球蟲檢測(cè)：根據(jù)麥克馬斯特法[6]計(jì)算每克糞便中的卵囊數(shù)(oocysts per gram of feces，OPG)。取糞便2 g，放入燒杯中，先加水5 mL，攪拌混勻后，加飽和食鹽水至60 mL，混勻后用銅篩網(wǎng)過濾，吸取糞液，注入麥克馬斯特計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，靜置5 min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)2個(gè)刻度室中的卵囊數(shù)。2個(gè)計(jì)數(shù)室的蟲卵數(shù)的平均值乘以200，即為每克糞便中的蟲卵或卵囊數(shù)(OPG=(n1+n2)/2/0.15×60/2 =A×200 其中(n1+n2)/2為平均每個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)卵囊數(shù)A，0.15為每個(gè)計(jì)數(shù)室有效體積為0.15 mL，60為糞液總體積為60 mL，2為所用糞便克數(shù)為2 g)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel軟件對(duì)檢測(cè)到的不同病原體進(jìn)行單一感染率、混合感染率、發(fā)病時(shí)間和時(shí)間軸進(jìn)行初步分析；采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)分析軟件中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同牧場(chǎng)6種病原檢測(cè)結(jié)果

不同牧場(chǎng)腹瀉犢牛6種病原檢出病原數(shù)、病原種類和檢出率見表1。132份樣品中共檢出95份陽性糞便，6種病原平均檢出率為71.96%。不同牧場(chǎng)檢出率各不同，最低檢出率33.33%，最高檢出率為100%。牧場(chǎng)1、3、4、5、6、10病原檢出率差異不顯著(P>0.05)；牧場(chǎng)2、7與牧場(chǎng)1、6、10病原檢出率差異顯著(P<0.05)；牧場(chǎng)8、9與牧場(chǎng)2、6、10病原檢出率差異極顯著(P<0.01)。

表1 不同牛場(chǎng)腹瀉犢牛6種病原檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同病原陽性率

通過對(duì)不同病原檢出結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示，95份陽性樣本中，隱孢子蟲感染樣本38份，占40.00%；輪狀病毒感染樣本41份，占43.16%；冠狀病毒感染樣本33份，占34.74%；大腸埃希氏菌K99感染樣本3份，占3.16%；賈第鞭毛蟲感染24份，占25.26%；艾美耳球蟲感染樣本5份，占5.26%。隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒之間的樣本陽性率差異不顯著(P>0.05)；隱孢子蟲和輪狀病毒樣本陽性率與大腸埃希氏菌K99樣本陽性率差異極顯著(P<0.01)；賈第鞭毛蟲樣本陽性率與隱孢子蟲、輪狀病毒、大腸埃希氏菌K99、球蟲樣本陽性率差異極顯著(P<0.01)。

表2 6種病原陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 單一感染和混合感染統(tǒng)計(jì)分析

在檢出的陽性樣品中，單一感染陽性樣品共58份，占61.05%。其中隱孢子蟲所占比例最大，占21.05%(20/95)；輪狀病毒占13.68%(13/95)，賈第鞭毛蟲12.63%(12/95)，冠狀病毒占6.32%(6/95)，大腸埃希氏菌K99占6.32%(3/95)。隱孢子蟲陽性率與冠狀病毒和大腸埃希氏菌陽性率差異極顯著(P<0.01)；輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲、球蟲之間的陽性率所占比例差異不顯著(P>0.05)(表3)。

2種病原混合感染樣品共27份，占28.42%。其中輪狀病毒和冠狀病毒占10.53%(10/95)，比例最大；隱孢子蟲和輪狀病毒占6.32%(6/95)；輪狀病毒和賈第鞭毛蟲占2.11%(2/95)；冠狀病毒和賈第鞭毛蟲占6.32%(6/95)；隱孢子蟲和冠狀病毒占3.16%(3/95)。輪狀病毒和冠狀病毒混合感染陽性率與輪狀病毒和賈第鞭毛混合感染蟲陽性率、隱孢子蟲和冠狀病毒混合感染陽性率差異顯著(P<0.05)(表3)。

3種病原混合感染樣本共10份，占10.53%。其中隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒占7.37%(7/95)；隱孢子蟲、輪狀病毒、賈第鞭毛蟲占2.11%(2/95)；隱孢子蟲、冠狀病毒、賈第鞭毛蟲占1.05%(1/95)。不同3種病原混合感染樣本陽性率之間差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 6種病原混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 不同疾病發(fā)病日齡統(tǒng)計(jì)分析

6種病原最早發(fā)病時(shí)間和常發(fā)日齡如圖1所示。隱孢子蟲最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～21日齡。冠狀病毒最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～27日齡。輪狀病毒最早發(fā)病日齡為5日齡，常發(fā)日齡在5日齡～18日齡。賈第鞭毛蟲最早發(fā)病日齡為8日齡，常發(fā)日齡在24日齡～60日齡；球蟲最早發(fā)病日齡為30日齡，在犢牛整個(gè)生命周期中均可發(fā)??；大腸埃希氏菌最早發(fā)病日齡為0日齡，常發(fā)日齡為0～7日齡。

圖1 6種疾病常發(fā)時(shí)間軸

3 討論

麥克馬斯特氏法檢測(cè)糞便球蟲卵囊數(shù)雖然是比較傳統(tǒng)的方法，但是該方法不僅可以準(zhǔn)確地觀察到球蟲，而且可以對(duì)球蟲種類進(jìn)行直觀的形態(tài)學(xué)觀察和卵囊大小的測(cè)量。因?yàn)榕袛嗲蛳x病不僅要檢測(cè)球蟲數(shù)量，還要檢測(cè)致病性蟲種。該方法成本最低，而且檢測(cè)時(shí)間較短，視為球蟲檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99和賈第鞭毛蟲為初生犢牛常發(fā)的腹瀉性病原，這幾種病原的快速檢測(cè)可以達(dá)到針對(duì)疾病精準(zhǔn)治療,降低犢牛死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失的目的。本研究采用膠體金病原檢測(cè)試紙進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，10 min～15 min即可快速檢出病原。

本研究對(duì)引起0～60日齡內(nèi)犢牛腹瀉的6種病原進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)132份樣品共檢出95份陽性糞便，6種病原平均檢出率為71.96%。10個(gè)牧場(chǎng)檢出率各不相同，最低檢出率33.33%，最高檢出率為100%。其中，隱孢子蟲占40.00%，輪狀病毒占43.16%，冠狀病毒占34.74%，大腸埃希氏菌K99占3.16%，賈第鞭毛蟲占25.26%，艾美耳球蟲占5.26%，說明犢牛腹瀉病原中輪狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、球蟲和大腸埃希氏菌。隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒之間的樣本陽性率差異不顯著(P>0.05)；隱孢子蟲和輪狀病毒樣本陽性率與大腸埃希氏菌K99樣本陽性率差異極顯著(P<0.01)；賈第鞭毛蟲樣本陽性率與隱孢子蟲、輪狀病毒、大腸埃希氏菌K99、球蟲樣本陽性率差異極顯著(P<0.01)。本研究結(jié)果與王文佳等[1]2017對(duì)寧夏部分地區(qū)犢牛腹瀉4病原調(diào)查中的輪狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲等結(jié)果一致，但本研究的結(jié)果多出了冠狀病毒和球蟲檢測(cè)結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，單一感染陽性樣品中隱孢子蟲所占比例最大，其次是輪狀病毒、賈第鞭毛蟲、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99；隱孢子蟲陽性率與冠狀病毒和大腸埃希氏菌陽性率差異極顯著(P<0.01)；輪狀病毒、冠狀病毒、大腸埃希氏菌K99、賈第鞭毛蟲、球蟲之間的陽性率差異不顯著(P>0.05)。2種病原混合感染中以輪狀病毒和冠狀病毒所占比例最大，其次是隱孢子蟲和輪狀病毒、輪狀病毒和賈第鞭毛蟲、冠狀病毒和賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲和冠狀病毒；輪狀病毒和冠狀病毒混合感染陽性率與輪狀病毒和賈第鞭毛混合感染蟲陽性率、隱孢子蟲和冠狀病毒混合感染陽性率差異顯著(P<0.05)。3種病原混合感染中隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒比例最大，其次是隱孢子蟲、輪狀病毒、賈第鞭毛蟲，隱孢子蟲、冠狀病毒、賈第鞭毛；不同3種病原混合感染樣本陽性率之間差異不顯著(P>0.05)。本研究說明隱孢子蟲在單一感染中為主要發(fā)病病原。輪狀病毒和冠狀病毒為混合感染的主要病原。但是0～30日齡犢牛球蟲病發(fā)病率極低，主要是其他5種病原。3種病原混合感染中以隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒混合為主，因此犢牛腹瀉病原中應(yīng)主要注意隱孢子蟲、輪狀病毒和冠狀病毒這3種病原引起的腹瀉，對(duì)于賈第鞭毛蟲和球蟲等寄生蟲性腹瀉應(yīng)采取環(huán)境消毒、保持圈舍清潔和早期驅(qū)蟲等措施來預(yù)防控制疾病的發(fā)生。

本研究通過對(duì)不同日齡犢牛6種病原流行病學(xué)調(diào)查，首次建立了適合寧夏地區(qū)的6中常見病原的最早發(fā)病時(shí)間和常發(fā)日齡圖譜，可為寧夏地區(qū)犢牛腹瀉的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。