具核梭桿菌促進結直腸癌發(fā)生機理的研究進展

張艷芳，李 鵬，潘耀謙*，劉興友*

(1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007； 2.新鄉(xiāng)學院生命科學和基礎醫(yī)學學院,河南新鄉(xiāng) 453003)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是人類消化道常見的致命性惡性腫瘤，在全球發(fā)病率很高，死亡率位列惡性腫瘤的第3位，每年因CRC死亡的人數高達50萬，對人類健康的危害很大[1]。導致CRC發(fā)生的病因很多，但近年來越來越多的研究發(fā)現，腸道微生態(tài)改變，特別是菌群失調在CRC發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[2-4]。人類腸道有一個數量龐大、結構復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲等，其中細菌占據主要地位，約有1 000余種。據報道，成人腸道系統(tǒng)中至少有100萬億個微生物，質量約為1.5 kg，是人體細胞總數的10倍，其編碼的基因數目是人類基因的150倍。這些微生物群與腸道黏膜免疫系統(tǒng)等組成復雜的腸道微生態(tài)。一旦微生態(tài)平衡被打破，就會引起腸道疾病和腫瘤的發(fā)生。近年來[5-7]，通過基因組序列檢測、宏基因組學及高通量測序技術運用，不僅發(fā)現結直腸癌患者的腸道微生態(tài)的破壞，腫瘤組織和周圍正常組織的菌群存在很大差異(前者是后者的250倍，而CRC組織中的數量更是高達1 000倍以上)，而且還揭示具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)數量與CRC的發(fā)生有密切關系。最近的一些研究[8-10]證明，具核梭桿菌在改變的結直腸微生態(tài)中異?；钴S，是誘發(fā)結直腸癌重要病因。迄今為止，具核梭桿菌促進CRC發(fā)生和發(fā)展的作用機理還不清楚。作者查閱了大量有關文獻，就具核梭桿菌促進結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機理做一綜述。

1 具核梭桿菌對結腸和CRC組織固有免疫細胞的抑制作用

固有免疫(innate immunity)是機體在種系發(fā)育和進化過程中形成的一系列天然免疫防御功能，在啟動及調節(jié)特異性免疫方面發(fā)揮重要作用，而且對機體的抗腫瘤免疫效應也起著不可忽視的作用。具核梭桿菌對固有免疫細胞具有較強的抑制作用[11]，從而影響了機體對CRC特異性免疫的形成。

1.1 具核梭桿菌對髓源性免疫細胞的影響

Kostic等在CRC小鼠模型中發(fā)現具核梭桿菌能增強腫瘤負荷、促炎標志物和髓系免疫細胞的浸潤，特別是CD11b+細胞，包括樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、巨噬細胞和粒細胞。Castellarin等的研究表明，CD11b+骨髓細胞在促進腫瘤發(fā)展和血管生成中起關鍵作用。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)可通過產生介質(如表皮生長因子和促血管生成素)等來促進腫瘤生長。灌注具核梭桿菌的小鼠在腫瘤微生態(tài)環(huán)境中增加了TAMs種群(是正常組織的7.8倍)，并導致對CD4+T細胞的抑制，影響了適應性免疫的產生。血管生成為腫瘤細胞提供氧氣和營養(yǎng)物質，以促進其進一步生長和發(fā)展[12]。促進血管生成的條件有很多，比如缺氧。組織器官在缺氧的條件下[13]，缺氧誘導因子1 (hypoxia inducible factor 1,HIF 1))可增加血管生長因子的表達，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptors,VEGFRs)。Mendes等的研究也獲得了相同結果，即用具核梭桿菌感染上皮細胞通過上調VEGF和VEGFR1/2而增加血管生成。低氧和HIF1在腫瘤微生態(tài)環(huán)境中的另一作用與促進骨髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)的形成有關，MDSCs在腫瘤中起免疫抑制細胞的作用[14]。已有研究表明，MDSCs可減少T細胞向腫瘤組織的浸潤，阻止T細胞對CRC細胞的侵擾，并通過增加基質金屬蛋白酶-9而增加血管生成和維持干細胞的特性。Toor等證明，灌注具核梭桿菌小鼠的MDSCs和腫瘤相關中性粒細胞(tumor associated neutrophils，TANs)的數量增多。MDSCs能生成高水平的誘導型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1，表明它們可通過抑制T細胞而幫助癌細胞實現免疫逃避，而TANs也參與了腫瘤的發(fā)展、血管生成和轉移。另外，給小鼠灌注具核梭桿菌改變了腸道微生態(tài)后，局部組織中增加的另一種髓系免疫細胞是CD103+調節(jié)性樹突狀細胞。這些細胞通過增強Foxp3+功能，而抑制T細胞的表達從而減弱了抗腫瘤免疫。

總之，具核梭桿菌通過改變結直腸的微生態(tài)環(huán)境，抑制各種髓源性免疫細胞的功能，促進結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展，并通過抑制T細胞來干擾特異性免疫的形成。

1.2 具核梭桿菌對NK細胞的抑制作用

具核梭桿菌可通過抑制自然殺傷(natural killing，NK)細胞的細胞毒性作用來協(xié)助CRC細胞逃逸免疫殺傷[15-16]。NK細胞屬于固有免疫系統(tǒng)，有2種受體類型,即激活受體和抑制受體。激活受體可以與腫瘤蛋白、病毒成分、自身分子和應激誘導分子結合，并將之消除。而抑制受體則導致NK細胞功能降低。T細胞免疫球蛋白及免疫受體酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif [ITIM] domain，TIGIT)是一種作用于NK細胞等免疫細胞的抑制性受體，與配體結合后可通過細胞質域、ITIM和免疫受體尾部酪氨酸樣基序啟動對信號的抑制，使NK細胞活性降低。研究表明[17]，具核梭桿菌與人的TIGIT (hTIGIT)受體在NK細胞上相互作用，可啟動抑制性級聯反應。從CRC患者組織中分離的帶有具核梭桿菌的細胞，經培養(yǎng)證明具核梭桿菌通過激活hTIGIT來抑制NK細胞。

2 具核梭桿菌特異性毒性因子對CRC發(fā)生的影響

具核梭桿菌的毒性因子可通過調整結直腸的微生態(tài)或改變細胞的信號通路，使細胞轉化或突變，進而出現癌變傾向、免疫逃避和癌變。具核梭桿菌可以產生3種特異性毒性因子，即侵襲細胞的梭桿菌黏附素A(Fusobacteriumadhesin A，FadA)、毒害細胞的凝集素，即梭桿菌自動轉動蛋白2(Fusobacteriumautotransporter protein 2，Fap2)和外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)。這3種毒力因子可相互作用于腸上皮細胞，并在其他一些因素的參與下，導致腸上皮細胞突變和腫瘤形成。

2.1 黏附素FadA的毒性作用

FadA毒力因子既可協(xié)助具核梭桿菌對腸上皮或CRC細胞的黏附和侵害，又能激活細胞的Wnt/β-catenin信號通路，從而促進腸上皮突變。Sun G H等[6,9,11]發(fā)現了具核梭桿菌的FadA毒力因子，有利于其黏附和侵入包括CRC細胞在內的上皮細胞和內皮細胞，加速了CRC患者腸上皮細胞的細菌性癌變。FadA是具核梭桿菌產生的高度保守的毒力因子，主要以兩種形式存在，即前體非分泌型FadA(pre-FadA)和成熟的分泌型FadA(mFadA)。pre-FadA定位于內膜中，只能溶于酸性胞質中，而mFadA主要存在于菌體胞膜表面，可溶于酸性和中性胞質中。當pre-FadA和mFadA在中性胞質中彼此分開時，它們呈失活狀態(tài)，并不表達功能。一旦胞質變成酸性時兩者即可結合在一起，形成FadA復合物(FadAc)。FadAc具有強烈的活性，是具核梭桿菌黏附和侵入宿主上皮細胞并表達功能的活性毒力因子。

據認為[18]，具核梭桿菌通過其菌膜上的FadA與宿主腸上皮細胞接觸，激活了上皮細胞的經典Wnt/β-catenin信號通路，從而誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Wnt/β-catenin信號轉導通路是一條在生物進化中極為保守的通路。在健康人的上皮細胞中，β-catenin只是作為一種細胞骨架蛋白，在胞膜處與鈣黏附蛋白(E-cadherin)形成復合體，借以維持同型細胞的特性，防止細胞的移動和變態(tài)。只有當細胞外Wnt信號分子及其配體與細胞膜上特異性受體結合后，才能啟動Wnt/β-catenin信號通路。業(yè)已發(fā)現在具核梭桿菌陽性CRC組織中不僅Wnt及其物質過量表達，而且顯示出更高水平的β-catenin。據認為[19]，FadA具有Wnt信號分子配體的作用。當FadA激活Wnt信號分子并與細胞膜上的特異性受體卷曲蛋白(Frizzled，Frz)結合后，即可激活Wnt/β-catenin信號通路，使其下游靶基因，如 c-myc、cyclin D1和WISP等轉錄，導致細胞的增殖、分化和突變。在這一通路中具有兩種至關重要的致癌基因，即c-myc和cyclin D1，它們都有相關的下游效應，均能有力地促進癌細胞的生存與發(fā)展。c-myc能誘導哺乳動物上皮細胞形態(tài)變化，增強細胞的非錨定依賴生長能力;而Cyclin D1在從G0/G1期到S期的轉變中發(fā)揮重要作用，在許多癌癥中均呈現上調。研究表明，CRC患者中cyclin D1癌基因表達增加[20]，其過表達與CRC患者的預后不良有關。此外，在人類結腸癌和正常鄰近組織標本中，CRC患者fadA基因表達升高。因此，有人認為FadA基因表達水平有望成為結腸癌診斷和預后判斷的參考指標。

2.2 凝集素Fap2的毒性作用

Fap2主要通過兩種方式對宿主細胞產生毒害作用，一是通過凝集作用使具核梭桿菌與上皮細胞結合，導致上皮細胞損傷或突變；二是抑制固有免疫細胞的活性，發(fā)揮具核梭桿菌致病作用。研究發(fā)現[1-2,6]具核梭桿菌產生的Fap2蛋白通過與CRC中過表達的D-半乳糖-β(1，3)-N-乙酰-D-半乳糖胺(D-galactose-β(1,3) -N-acetyl-D-galactosamine,Gal-GalNAc)結合，在介導CRC中的細菌富集和細胞的突變過程中發(fā)揮著重要作用。為了證實這一發(fā)現，他們用O-glycanase抑制Gal-GalNAc的表達，從而減輕具核梭桿菌在CRC中的積累。Casasanta M A等[21]證明Fap2可介導具核梭桿菌與小鼠CRC細胞特異性結合，并且Gal-GalNAc在CRC細胞中呈高水平表達。如果抑制Fap2或宿主上皮Gal-GalNAc的表達則可阻止具核梭桿菌誘發(fā)的CRC形成?？傊?，Fap2是具核梭桿菌產生的可與上皮細胞生成的Gal-GalNAc相互識別的特異性凝集素，能夠引起具核梭桿菌與CRC中過表達的Gal-GalNAc特異性結合。另外，產生Fap2的具核梭桿菌還可通過血液循環(huán)進入結直腸，定植在腸上皮或腫瘤上，改變其微生態(tài)環(huán)境，從而引起上皮的突變或促進腫瘤的發(fā)展。

另外，具核梭桿菌的Fap2還能與TIGIT分子結合，抑制適應性免疫的產生。研究證明，除NK細胞外，其他腫瘤浸潤的淋巴細胞，包括CD4+和CD8+T細胞，均表達TIGIT受體。Gur等曾證明具核梭桿菌通過Fap2介導的TIGIT相互作用，可抑制T輔助細胞和細胞毒性T淋巴細胞。具核梭桿菌抑制蛋白可使人的T細胞在細胞周期的G1期發(fā)生阻滯。具核梭桿菌這種從不同的方面抑制具有特異性免疫作用細胞的活性，干擾了適應性免疫的產生，從而有利于癌細胞的分化，生長，并能促進癌細胞的轉移。

2.3 外膜囊的毒性作用

眾所周知[22]，革蘭氏陰性細菌能夠分泌一種毒性因子的傳遞系統(tǒng)，即OMVs。具核梭桿菌表面的蛋白和FadA可促進OMVs與宿主上皮細胞相互作用，并借助OMVs內蛋白酶來降解腸上皮細胞膜的E-cadherin。E-cadherin是一種緊密連接蛋白，可促進細菌入侵和誘導炎癥反應。此外，來自具核梭桿菌的OMVs還可誘導上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，成為腫瘤轉移的一個主要途徑。具核梭桿菌和OMVs都能上調EMT標記物，包括E-cadherin、整合素抑制因子(integrin inhibitor )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和纖連蛋白1(fibronectin-1)。Yan等也證明在帶有EMT標記物和腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)標記的CRC Ⅲ/Ⅳ期患者之間，具核梭桿菌水平呈現正相關，并認為具核梭桿菌可能在EMT- CSCs交互過程中促進CRC的發(fā)展。另外，Melinda A等[23]證明，具核梭桿菌的OMVs還有促進IL-8和TNF的分泌，具有誘導炎性反應的作用。

3 具核梭桿菌的促癌性miRNA形成

研究證明[24-25],在APCmin/+小鼠模型試驗中發(fā)現具核梭桿菌感染CRC細胞后，激活核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路，導致miRNA21 表達增加，而該miRNA可以增強CRC細胞的侵襲活性并形成異種移植腫瘤。該臨床研究顯示，腫瘤組織中同時具有大量具核梭桿菌DNA和miRNA21患者的預后較差。Hur K等[26]證明有多種miRNAs在CRC的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用，其中一些還被用作CRC診斷和進展的生物標志物。Shi等證明miRNA 21在腸道慢性炎癥和結腸炎相關CRC的進展中發(fā)揮重要作用。Yang Y等[24]在體內外研究了具核梭桿菌在CRC進展中的作用及其機制，報道了用具核梭桿菌對CRC細胞株的處理，增加了細胞的增殖和侵襲，而具核梭桿菌對APCMin/+小鼠的作用則增加了腫瘤數量、腫瘤負荷和腫瘤大小。用具核梭桿菌處理CRC細胞株后，芯片分析顯示657個miRNAs中，有50個miRNAs上調，52個miRNAs下調，其中miRNA 21表達率最高。因此，miRNA 21被認為是與具核梭桿菌誘發(fā)CRC的miRNA，有可能成為檢測CRC的標志。

另外，進一步的調查顯示[27]，RASA1屬于RAS GTPase激活蛋白家族，是miRNA 21的直接靶標，抑制miRNA 21可增加RASA1表達。RASA1可以與RAS癌蛋白結合并使其失活。因此，miRNA 21可能是具核梭桿菌促進生成的有助瘤生長的miRNA。Yang Y等[24]提出了具核梭桿菌可以激活腸上細胞TLR4/MYD88/NF-κB信號通路，借以調節(jié)miRNA 21的表達。

4 具核梭桿菌性促炎因子對CRC細胞的影響

據Nasser H G等[16,28-29]報道，具核梭桿菌與其他引起腸道腫瘤相關的細菌不同，它不能直接引起腸管的炎性反應，不會加劇結腸炎、腸炎或炎癥相關的腸道病變，但由它刺激產生的促炎因子卻可以加速腫瘤的發(fā)生。暴露于具核梭桿菌的ApcMin/+小鼠的腫瘤，表現出與人類具核梭桿菌陽性結直腸癌相同的促炎表達特征。然而，在這些小鼠中沒有觀察到任何腸炎的變化。受試的ApcMin/+小鼠在沒有任何腸炎或肉眼炎癥的情況下，具核梭桿菌則能加速腫瘤的發(fā)生。

Yang Y等[24]研究表明炎癥因子有助于CRC的發(fā)展。根據他們對感染具核梭桿菌小鼠的血清分析，包括 IL-17F、IL-21、IL-22和巨噬細胞炎癥蛋白3 α(macrophage inflammatory protein 3 alpha，MIP3α)在內的炎癥因子呈上調狀態(tài)。IL-17F、IL-21和IL-22是TH-17細胞的主要細胞因子，在腫瘤發(fā)生中具有雙重作用。Jiang等曾報道IL-17F、IL-21和IL-22在患CRC病人體內呈現高表達狀態(tài)，但在特定條件下，這些因素可發(fā)揮抗腫瘤作用。例如，IL-17F可以抑制促血管生成因子，包括VEGF和前列腺素E2。這些有爭議的影響可能是這些促炎因子由不同類型的細胞產生的。Rezasoltani S等[24,30]認為TLR識別配體后可通過接頭蛋白傳遞細胞內的信號，激活 NF-κB 和MAPK途徑[31]，誘導炎癥因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-12)、血管生成因子、生長因子，細胞黏附分子和基質降解酶的表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。具核梭桿菌產物和髓樣細胞 TLR 結合，促進炎性因子IL-1、IL-6、IL-22和IL-23的釋放，而IL-23能活化下游TH-17細胞[32]，后者分泌的IL-17和IL-22可活化信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)，激活的STAT3可以調節(jié)VEGF的表達，加速腫瘤血管的形成，促進腫瘤細胞的增殖與侵襲。

5 小結

本文從具核梭桿菌對固有免疫的抑制作用、特異性毒性因子的致病性、miRNA21的形成及作用和促炎性因子的產生等方面綜述了具核梭桿菌的致病機理，從中可以發(fā)現具核梭桿菌是通過多種途徑引起結直腸局部的微生態(tài)平衡破壞，從而促進腸上皮的轉化和突變，誘導CRC細胞的產生、發(fā)展與轉移的。