小反芻獸疫流行狀況及分子診斷技術(shù)研究現(xiàn)狀

吳昊天，滿初日嘎，王鳳陽，李 昌，金寧一，陳巧玲*

(1.海南大學(xué)動物科技學(xué)院/海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南海口 570228；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130122)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)也稱為羊瘟、小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎，是一種以山羊、綿羊、鹿、駱駝以及其他野生小反芻動物為主要感染對象的病毒性疾病。近年來在牛、水牛、牦牛、豬、狗、吸血蠓等多種動物體內(nèi)都分離到PPRV或檢測到過病毒核酸，或可在實驗條件下人為感染[1]。駱駝和牛已經(jīng)被證實是PPRV的偶然宿主，感染PPRV的駱駝和牛不會繼續(xù)傳播PPRV[2]。PPR分為急性型、標準型和溫和型，典型臨床癥狀為發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、口腔與鼻黏膜潰瘍和結(jié)膜炎等[3]，急性型患畜出現(xiàn)發(fā)熱和結(jié)膜炎癥狀后便迅速死亡，標準型則會出現(xiàn)多種典型臨床癥狀，少部分僅有口腔病變的溫和型病羊能夠恢復(fù)，多數(shù)會在發(fā)病后數(shù)天內(nèi)死亡[4]。

PPR是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須報告的動物疫病，在我國屬于一類動物疫病。PPR給全球養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的損失。根據(jù)OIE、世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)據(jù)，截止2019年5月，全球仍有67個國家有PPR流行，這些國家的小反芻動物數(shù)占世界總數(shù)的68%，超3億以飼養(yǎng)小反芻動物為生的家庭受PPR直接影響[5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年因PPR帶來的經(jīng)濟損失可達15億～20億美元。我國周邊國家如印度、阿富汗、巴基斯坦、尼泊爾等，PPR疫情常年呈地方性流行，給我國的PPR防控帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。

1 小反芻獸疫的病原學(xué)

PPR的病原是小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)，為單股負鏈RNA病毒，屬副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員。自然條件下主要感染各類小反芻動物，人工條件下可以在原代牛和綿羊細胞以及某些細胞系(如Vero細胞和B95a細胞)中生長。該病毒感染細胞3 d～5 d后，會導(dǎo)致宿主細胞出現(xiàn)特定的細胞病變,最初細胞呈葡萄簇狀，然后空泡化，細胞質(zhì)顆?；詈笮纬商禺愋院习w。PPRV大小為150 nm～700 nm，由N蛋白、P蛋白和L蛋白相連共同組成的核衣殼復(fù)合體與單股負鏈無節(jié)段RNA基因組構(gòu)成。PPRV基因組包含6個基因，分別編碼核衣殼蛋白N、磷蛋白P、融合蛋白F、基質(zhì)蛋白M、血凝素蛋白H/HN和大蛋白L等6種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)以及C、V兩種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，依次為3′-N-P/C/V-M-F-H/HN-L-5′。其中M、F、H和N 4種蛋白質(zhì)能夠形成PPRV的病毒樣顆粒(VLPs)，可誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生足夠抵抗PPRV感染的中和抗體[6]。

1.1 小反芻獸疫病毒各蛋白與功能

N蛋白是PPRV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。N蛋白的作用是與M蛋白共同促進病毒的組裝，并參與P-L聚合物復(fù)合物形成。PPRV的 N蛋白編碼區(qū)起始于核苷酸位點108(UAC)，終止于1 685位點(AUU)，蛋白大小為59 ku，其最高免疫活性區(qū)在425-472氨基酸位點。根據(jù)不同毒株間基因相似度可以將N蛋白劃分為4個區(qū)域，分別為區(qū)域1(氨基酸位點1-120位)、區(qū)域2(氨基酸位點122-145位)、區(qū)域3(146-398位)和區(qū)域4(421-525位)，其中區(qū)域3保守性最高，區(qū)域4保守性最低[7]。

P蛋白基因起始于1 807位堿基，編碼大小約60 ku的P蛋白，這段基因序列的替代閱讀框也可以產(chǎn)生C蛋白和V蛋白兩種非結(jié)構(gòu)蛋白。麻疹病毒屬病毒的P蛋白都是磷酸化蛋白，存在5個保守的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點。P蛋白有助于L蛋白的正確折疊。研究表明，P蛋白可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 1 (STAT1)的磷酸化，進而阻斷JAK-STAT信號傳導(dǎo)途徑，從而抑制干擾素產(chǎn)生[8]。

M蛋白基因位于3 428-4 445位堿基之間，麻疹病毒屬中高度保守，在屬內(nèi)相似度高達91%，作用為連接N蛋白與表面糖蛋白。M蛋白還是促進PPRV的病毒樣顆粒組裝和釋放的組分[9]。

H蛋白基因位于7 326-9 155位堿基之間，麻疹病毒屬的H蛋白位于囊膜，可將病毒吸附于宿主細胞的細胞膜上。PPRV的H蛋白還具有紅細胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的作用，因此也被稱為血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)。H蛋白在PPRV感染山羊的過程中，可以降低山羊體內(nèi)能夠抑制PPRV復(fù)制的親環(huán)蛋白A(CypA)的水平，從而拮抗山羊的抗病毒反應(yīng)[10]。麻疹病毒屬中H蛋白的保守性極低，是不同種類的麻疹病毒細胞嗜性以及產(chǎn)生的體液免疫不同的主要原因。

F蛋白基因位于5 526-7 166位堿基之間，F(xiàn)蛋白與H/HN蛋白定位于病毒囊膜上，F(xiàn)蛋白的主要作用是在H蛋白協(xié)助下介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細胞膜的融合。在共表達PPRV的F與H蛋白的Vero-DST細胞中，F(xiàn)蛋白和H蛋白也能誘導(dǎo)細胞間形成合胞體[11]。副黏病毒科的F蛋白首先在宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成前體F0蛋白，然后在酶的作用下分解為由二硫鍵相連的F1和F2組成的功能性F蛋白。在PPRV通過出芽的方式被釋放到細胞外時，H蛋白以及F蛋白有可能會殘留在宿主細胞膜上，這些殘留的蛋白會作為靶標誘導(dǎo)動物產(chǎn)生針對被感染細胞的抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用(ADCC)[12]。

L蛋白是PPRV中分子質(zhì)量最大的蛋白，與P蛋白一起發(fā)揮RNA聚合酶活性，負責基因組RNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。L蛋白還能對病毒mRNA進行加帽、甲基化等加工修飾作用。近年的研究確定了L蛋白的RNA三磷酸酶(RTPase)活性的最小結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域位于L蛋白C末端，氨基酸位點1 640-1 840之間，這段區(qū)域依賴于鎂離子或者錳離子發(fā)揮RTPase活性[13]。

1.2 小反芻獸疫病毒的分類

PPRV只有一個血清型，但根據(jù)F基因部分序列和N基因的序列可以進行遺傳進化分析，其中N基因的分析能夠按照地理來源將PPRV分類，F(xiàn)基因偏向于以時間軸反映PPRV的演化過程[14]。對N基因的部分序列分析，可以將PPRV在不同地區(qū)的分離株分為4個不同的譜系，其中譜系Ⅰ和譜系Ⅱ來自于西非，譜系Ⅲ來自于東非、阿拉伯和南印度，譜系Ⅳ來自于中東、印度等亞洲地區(qū)。

2 小反芻獸疫的流行情況

2.1 國內(nèi)小反芻獸疫的流行現(xiàn)狀

我國PPR的流行可以根據(jù)時間大致劃分為三個階段，分別為2007年-2013年、2013年-2014年以及2014年以后。2007年，在西藏阿里地區(qū)發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)首例PPR，在此之后的幾年疫情通過混群混牧和引種等方式向東緩慢傳播，并分別于2008年和2010年在西藏那曲和阿里地區(qū)暴發(fā)。2013年-2014年P(guān)PR在全國各地暴發(fā)，形成了一次大流行。2013年新疆伊犁發(fā)生PPR疫情，同年新疆哈密地區(qū)、阿克蘇地區(qū)發(fā)生疫情。2014年1月至3月，甘肅、內(nèi)蒙古、安徽和重慶等地依次暴發(fā)PPR疫情，總體表現(xiàn)為由西向東傳播，到2014年4月，全國包括西藏、新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、湖南、遼寧、江西、安徽、江蘇和重慶等20個省、直轄市和自治區(qū)均有報告PPR疫情[15]。

近年來，PPR在我國呈散發(fā)流行。2015年-2020年，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報的疫情一共5起，均發(fā)生于2018年和2020年。其中2020年的2起疫情均為輸入性疫情，涉及新疆、遼寧、湖南、江蘇和青海。PPRV除了在家畜中流行以外，也多次在野生動物中發(fā)現(xiàn)，2016年在新疆烏魯木齊和庫車的北山羊和鵝喉羚種群中發(fā)現(xiàn)PPRV感染，引起7只動物死亡[16]；2018年在甘肅發(fā)現(xiàn)了野生普氏原羚感染PPRV[17]；2019年在青海發(fā)現(xiàn)了野生巖羊感染PPRV[18]，這些野生動物感染的病例警示了PPRV有在國內(nèi)形成自然疫源地的風險。2013年11月至2018年11月國內(nèi)報道的PPR病例數(shù)為294例。Ma J[19]等將這段時期內(nèi)的PPR病例劃分為了三個時空相關(guān)的分布集群，分別為東北群、華東群和華南群，并且發(fā)現(xiàn)當?shù)刈罡珊翟路莸慕涤炅繒@著影響PPR暴發(fā)。

聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界動物衛(wèi)生組織于2015年提出了至2030年全球范圍內(nèi)PPR根除計劃，同年我國農(nóng)業(yè)部也提出了至2020年國內(nèi)PPR根除計劃，按照計劃，PPR被列入強制免疫疾病。近兩年國內(nèi)部分省市對PPRV的血清學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示，這些省市的羊場的PPRV血清免疫抗體陽性率普遍達到了國家規(guī)定的70%以上，部分地方如山東省[20]、江蘇太倉市[21]、四川攀枝花市[22]等地區(qū)平均抗體陽性率達到了90%以上，全國僅有少數(shù)縣市如安徽省蕪湖市及淮南市[23]的部分羊場仍然未能達標。

2.2 世界范圍內(nèi)小反芻獸疫的分布和分子流行病學(xué)研究現(xiàn)狀

PPRV在世界范圍內(nèi)主要分布于非洲、中東以及南亞地區(qū)，呈現(xiàn)由西向東擴散的趨勢。從PPRV 4個譜系的流行區(qū)域來看，譜系Ⅰ主要分布于西非的科特迪瓦、塞內(nèi)加爾和幾內(nèi)亞等國家；譜系Ⅱ主要分布于西非的加納、尼日利亞、馬里等國家；譜系Ⅲ主要分布于東非的埃塞俄比亞、蘇丹、索馬里等國家和阿拉伯半島南部的阿曼和阿聯(lián)酋等國家；譜系Ⅳ主要分布于北非的阿爾及利亞、埃及等國家、中東的土耳其、以色列、沙特阿拉伯等國家、南亞的印度、孟加拉等國家。我國流行的PPRV均為譜系Ⅳ，整個譜系Ⅳ又分為4個分支，分別是土耳其分支、非洲分支、印度分支和中國2013年-2017年分支。

在2014年P(guān)PR大暴發(fā)后，我國多個省市分離出了PPRV毒株。盛琰翔[24]對來自江蘇、西藏、貴州等13個省份時間跨度從2013年-2017年的53株P(guān)PRV的全基因組和來自其他國家(地區(qū))的16株代表性PPRV毒株的全基因組進行了遺傳進化分析。結(jié)果顯示，這段時期內(nèi)我國的PPRV主要來自于譜系Ⅳ，并且與2007年西藏PPRV毒株同源性最高。根據(jù)王凈等[25]的研究，2013年-2014年P(guān)PRV毒株與2007年西藏PPRV毒株又可以進一步劃分到2個分支中。

3 小反芻獸疫的分子診斷

3.1 小反芻獸疫病毒各基因的檢測研究現(xiàn)狀

PPRV的6個基因的表達量、突變速度和突變程度各有不同。2014年-2017年，全國28個PPRV毒株中共出現(xiàn)518個核苷酸突變位點，有137個導(dǎo)致了氨基酸變異，其中L基因突變位點最多，M基因最為保守[24]。6個基因中，編碼核衣殼蛋白的N蛋白是表達量最高的，雖然N蛋白不能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生保護性抗體，但是由于N蛋白可以進行原核表達且表達量高能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生大量抗體，是血清學(xué)檢測最常用的抗原。在目前的分子檢測中N基因也是最常用基因。F基因保守度較高，編碼PPRV主要的保護性抗原，也可以作為PPRV檢測的靶基因。M基因是PPRV中最為保守的基因，但是由于麻疹病毒屬內(nèi)該基因同源性較高，少用于PPRV的分子檢測。H基因是PPRV主要保護性抗原基因之一，但是保守性低，在PPRV中突變速度最快，也少用于分子檢測。關(guān)于針對L基因的檢測方法目前尚未建立。

3.2 小反芻獸疫病毒的分子檢測方法研究現(xiàn)狀

RT-PCR和RT-qPCR是目前PPRV分子檢測最常用的方法，已經(jīng)報道的RT-PCR和RT-qPCR方法主要針對的靶基因為N、F基因。我國國家標準《小反芻獸疫診斷技術(shù)》中采用的PPRV分子檢測方法為針對N基因的RT-PCR和RT-qPCR。Halecker S等[26]將磁珠提取RNA技術(shù)和RT-qPCR凍干試劑組合成了能夠快速利用RT-qPCR檢測PPRV的檢測試劑盒，該試劑盒除了能在30 min～40 min內(nèi)得出結(jié)果外，還能有效區(qū)分PPRV和其他麻疹病毒屬病毒。朱小甫等[27]建立了針對F基因的RT-nPCR方法，相較于RT-PCR大大提高了檢測的靈敏度。多項研究將各類等溫檢測技術(shù)如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)和重組酶聚合酶擴增(RPA)應(yīng)用于小反芻獸疫病毒檢測。這兩種技術(shù)的優(yōu)勢在于檢測速度快，檢測條件要求低。Mahapatra M等[28]研發(fā)了針對PPRV的N基因的RT-LAMP檢測技術(shù)，準確度與RT-qPCR相當，而且無需提取病料的RNA。徐瀅等[29]使用SYBR GreenⅠ對PPRV的F基因RT-LAMP產(chǎn)物染色，建立了可視化的RT-LAMP檢測方法，靈敏度高于傳統(tǒng)的RT-PCR。Li Y L等[30]針對PPRV的N基因開發(fā)了實時RT-RPA檢測方法，與RT-qPCR靈敏度和特異性相當，但更加簡便快捷。將PPRV的檢測與其他常見病原的檢測集成為多重檢測體系也是研究熱點?；魰喳惖萚31]建立了綿羊肺炎支原體與PPRV的雙重RT-PCR檢測方法；范晴等[32]建立了藍舌病毒與PPRV的雙重RT-LAMP檢測方法、王璐瑤等[33]建立了山羊痘病毒與PPRV的雙重PCR檢測方法。隨著更多前沿的分子檢測技術(shù)的應(yīng)用，PPRV的分子檢測正向著快速化、高通量化發(fā)展。

4 展望

由于PPR帶來的損失巨大，且PPRV在自然環(huán)境下難以生存且需要密切接觸傳播，而且PPR減毒活疫苗能夠提供針對所有毒株的長期保護，具備被根除的條件，我國農(nóng)業(yè)部于2015年底制定了全國PPR消滅計劃。該計劃目標為到2020年，除毗鄰PPR疫情國家的陸地邊境縣(團場)或沿邊境線30 km范圍內(nèi)的免疫隔離帶以外，力爭達到全國非免疫無疫區(qū)標準。自2018年以后我國沒有再出現(xiàn)過本土PPR病例，直到2021年我國已經(jīng)完成了全國消滅小反芻獸疫的任務(wù)。OIE和FAO也于2016年宣布了全球根除PPR計劃，計劃于2030年前在世界范圍內(nèi)根除PPR。目前世界范圍內(nèi)PPR根除計劃面臨的主要問題為PPR大多流行于非洲和南亞地區(qū)的欠發(fā)達國家，沒有足夠的資金和技術(shù)支持PPR根除計劃。此外，過去曾經(jīng)認為野生動物在PPR傳播中沒有流行病學(xué)意義，但是越來越多的研究表明瀕危野生動物不但會受到PPRV威脅，而且在PPRV的傳播中有重要意義[34]。除了我國多次在野生動物中檢測到PPRV以外，近年來我國周邊鄰國也有在野生動物中發(fā)現(xiàn)PPRV的報道，2016年-2017年蒙古國賽加羚羊等野生有蹄類種群就暴發(fā)了一次譜系Ⅳ PPRV引起的PPR疫情[35]。要完成全球范圍內(nèi)根除PPR的計劃，首先是需要進一步研究PPRV在野生動物中的傳播機制，防止自然疫源地的形成；其次是需要研發(fā)在欠發(fā)達國家或者野外環(huán)境下能夠使用的、穩(wěn)定準確廉價易操作的PPRV檢測方法；已經(jīng)控制和消滅PPR的國家和地區(qū)要加強境外輸入的防控，仍在流行的國家和地區(qū)要推進疫苗和快速檢測技術(shù)的推廣。

我國在2020年以及2021年初西北地區(qū)仍然發(fā)生了輸入型的PPR。輸入型PPR病例的發(fā)生與我國周邊，尤其是西南鄰國如印度、孟加拉國等國家的PPR持續(xù)流行密切相關(guān)。從這些國家進口的動物制品或者活體動物有輸入PPRV的風險，野生動物的遷徙也會帶來潛在的PPRV輸入風險。分子流行病學(xué)研究也證明了我國曾流行的PPRV毒株與這些國家的PPRV毒株有密切的關(guān)系。鑒于我國各地養(yǎng)羊場的PPR抗體陽性普遍達標，且周邊國家的PPR疫情仍然十分嚴峻的情況，為了在我國消滅PPR，目前我國PPR的預(yù)防與清除措施除了繼續(xù)保持羊群的免疫接種以外，重點應(yīng)放在防止感染動物從境外輸入。目前帶毒動物的輸入途徑主要為帶毒的野生動物越境與家畜接觸和進口帶毒家畜。除了加強邊境地區(qū)的畜群管理和野生動物遷徙監(jiān)控以外，海關(guān)等檢疫機構(gòu)需要加強對PPRV的檢測力度。研發(fā)更加方便快捷的PPRV檢測手段對于海關(guān)、檢疫站以及養(yǎng)殖場動物引進檢疫都有重要的意義。整合PPR與其他羊常見疾病的綜合檢測方法目前還有待繼續(xù)研究開發(fā)。多種日益成熟的新型檢測技術(shù)都有應(yīng)用于PPRV檢測的潛力，如基于各種等溫擴增技術(shù)和微流控技術(shù)開發(fā)的微流控芯片技術(shù)、基于CRISPR/Cas13a的SHERLOCK檢測技術(shù)等。結(jié)合各類新型技術(shù)開發(fā)小型化、快速化、簡便化、高通量化和數(shù)字化的PPRV檢測方法是未來PPRV分子檢測的發(fā)展方向。