沈思思,陳 亮,馮萬(wàn)宇,蘭世捷,李 丹,苗 艷,張 蕾,黃寶銀,王 歡,劉 文,劉德會(huì),史同瑞
(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江齊齊哈爾 161000)
冠狀病毒(Coronavirus,CoV)是一種嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的病原,主要引起宿主的呼吸道和消化道感染。繼2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)和2012年的中東呼吸綜合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)之后,2019年由SARS-CoV-2引起的人類群體性肺炎——新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 19,COVID-19),又將冠狀病毒重新引入大眾視野[1-2]。這3種冠狀病毒的共同特點(diǎn)是由動(dòng)物傳播到人類,并且嚴(yán)重威脅人類健康,給世界各國(guó)造成巨大的危害。牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)與1967年首次分離的人類冠狀病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)高度相似,核苷酸同源性為96%[3]。1988年,從德國(guó)一名兒童的腹瀉樣本中分離出1種命名為HEC4408的冠狀病毒毒株,其基因組顯示該毒株與BCoV的關(guān)系比其他人類冠狀病毒關(guān)系更加密切,說(shuō)明該毒株可能來(lái)源于BCoV[4]。這些都提示BCoV和人類冠狀病毒之間有跨越物種傳播的可能。本文從BCoV的基因組結(jié)構(gòu)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀、診斷、治療和預(yù)防等方面進(jìn)行綜述,以期為BCoV的進(jìn)一步研究提供考。
BCoV屬于冠狀病毒科、β冠狀病毒屬。基因組為一個(gè)約31 kb的單股正鏈RNA病毒,包括10個(gè)開放閱讀框(open reading frames,ORFs),兩端是5′和3′非翻譯區(qū)域。ORF1編碼多聚蛋白pp1a,通過(guò)核糖體轉(zhuǎn)移為pp1ab,然后被蛋白酶水解成多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NSP)。ORF3、ORF4、ORF8、ORF9和ORF10分別編碼血凝素酯酶蛋白(hemagglutinin protein,HE)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N),它們是病毒粒子的組成部分,其余的ORFs編碼額外的NSPs,如32 ku和12 ku,對(duì)其功能未有深入研究[5]。
在冠狀病毒中研究最多的是S蛋白,屬于Ⅰ類病毒融合蛋白,在病毒入胞和致病作用中起著重要的作用。S蛋白分裂為S1(N端)和S2(C端)亞基。S1亞基負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、中和抗體誘導(dǎo)和血凝素活性。S1亞基內(nèi)的氨基酸突變反映了病毒抗原性和致病性的變化,S1核苷酸序列常用于系統(tǒng)發(fā)育研究和分子流行病學(xué)調(diào)查。S2亞基為跨膜蛋白,在病毒侵襲過(guò)程中介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜融合[6]。
BCoV有一種獨(dú)特基因編碼的表面血凝素酯酶(HE)蛋白,在其他冠狀病毒未曾發(fā)現(xiàn)。HE蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗BCoV的中和抗體[7]。HE蛋白包含2個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域凝集素結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域。凝集素結(jié)構(gòu)域識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的糖受體,而酯酶結(jié)構(gòu)域可以破壞受體的酶活性,能夠從目標(biāo)細(xì)胞表面移除細(xì)胞受體。受體結(jié)合(凝集素)和受體破壞(酯酶)區(qū)域?qū)Σ《镜娜氚兄匾绊?。因此,除了S蛋白外,HE蛋白還充當(dāng)了感染起始的第二種病毒附著蛋白的角色[8]。
BCoV是引起新生犢牛腹瀉、冬季痢疾和牛呼吸道感染的重要病原之一。冬季痢疾通常發(fā)生在較冷的地區(qū),但最新研究顯示在較暖的季節(jié)和熱帶地方也曾發(fā)生該病,如韓國(guó)的夏季,以及泰國(guó)、巴西和古巴等[9]。牛感染BCoV可導(dǎo)致幼畜死亡、生長(zhǎng)遲緩、產(chǎn)奶量減少和奶品質(zhì)降低,給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除了感染牛外,BCoV也可以感染野生反芻動(dòng)物,如馴鹿、非洲大羚羊、麋鹿、羊駝和長(zhǎng)頸鹿等[10]。
根據(jù)臨床癥狀,可將BCoV引起的疾病可分為腸道型和呼吸道型。BCoV感染途徑是糞-口或氣溶膠等傳播,感染牛是主要的傳染源[11]。研究表明,病毒在亞臨床感染的成年牛體內(nèi)可持續(xù)存在[12]。BCoV分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的聚類并不取決于它們是腸道型還是呼吸道型,而是取決于樣本的地理來(lái)源[7]。在加拿大冠狀病毒呼吸道分離株魁北克BCG-3994就與加拿大腸道分離株在同一分支[12]。BCoV只有一種血清型,可以用分子生物學(xué)和血清學(xué)等方法進(jìn)行鑒別。
BCoV在世界各地廣泛存在[14]。挪威的研究表明,2009年,BCoV在牛群中的血清陽(yáng)性率分別為39.3%和80.7%;2016年,牛群中檢測(cè)的血清陽(yáng)性率為72.2%[15]。意大利在2006年期間,4次呼吸道疾病暴發(fā)均與BCoV有關(guān),但未同時(shí)發(fā)現(xiàn)其他呼吸道病原體,并且其中的2次在腸道也檢測(cè)到了BCoV[13],說(shuō)明感染的犢??稍谀c道和呼吸道同時(shí)攜帶BCoV。比利時(shí)30%的犢牛中檢測(cè)到BCoV的血清轉(zhuǎn)化。在愛爾蘭(2008年-2012年)的一項(xiàng)回顧性研究中,BCoV是呼吸道疾病暴發(fā)時(shí)牛鼻拭子中最常見的病毒[16]。法國(guó)的兩項(xiàng)獨(dú)立研究收集的呼吸樣本中檢測(cè)到BCoV的概率為17%~63%。2020年,譚爍等[17]報(bào)道了新疆和遼寧地區(qū)的16個(gè)奶牛場(chǎng)153份奶牛腹瀉糞便樣本中檢測(cè)到的BCoV陽(yáng)性率為71.24%,場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)100%。綜上所述,BCoV具有較高的流行性和廣泛的傳播范圍。
BCoV通過(guò)S蛋白與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。最開始復(fù)制發(fā)生在呼吸道(鼻甲、氣管和肺),還是胃腸道(腸上皮細(xì)胞)仍然是一個(gè)具有爭(zhēng)議性的問題。一方面,最初的復(fù)制是發(fā)生在呼吸道,大量的病毒被黏液保護(hù),然后被吞下,感染腸道[18]。而另一面,胃腸道是首先被感染的,病毒以病毒血癥進(jìn)入的呼吸道。BCoV可以感染整個(gè)胃腸道,從十二指腸開始向大腸擴(kuò)散,引起絨毛萎縮等黏膜病變。在呼吸道,BCoV可以引起間質(zhì)性肺炎和鼻甲、氣管及肺的上皮損傷[19]。Kanno T等[20]的研究表明,病毒脫落可持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。用套式PCR檢測(cè)結(jié)果表明,鼻分泌物中BCoV可持續(xù)存在932 d,糞便中BCoV可持續(xù)存在1 058 d。
新生犢牛腹瀉能引起小腸絨毛發(fā)育遲緩,同時(shí)導(dǎo)致大腸的結(jié)腸嵴萎縮[9]。犢牛的日齡和免疫力決定了發(fā)病率和病死率[21]。被感染母牛所生的犢?;几篂a的風(fēng)險(xiǎn)則更高[22]。新生犢牛對(duì)疾病的保護(hù)依賴于腸腔中存在的特異性初乳抗體。血清中的初乳抗體不是直接保護(hù)黏膜,而是取決于再分泌進(jìn)入腸腔內(nèi)的免疫球蛋白數(shù)量。只有腸腔中有大量初乳抗體,才能有效防止BCoV的感染。通過(guò)給懷孕母牛注射疫苗可以誘導(dǎo)初乳中產(chǎn)生抗體,供給犢牛被動(dòng)免疫保護(hù),有效的預(yù)防BCoV。病毒感染可引起犢牛出血性腹瀉,大多數(shù)犢牛伴有黃色稀便、脫水、體溫降低和精神沉郁等癥狀?;疾倥J秤徽窈碗娊赓|(zhì)損失,可引起代謝性酸中毒和低血糖[23]。嚴(yán)重者還會(huì)引起發(fā)熱、倒地不起和死亡等。一些犢牛還會(huì)伴有呼吸癥狀。大多數(shù)感染為3日齡~21日齡,潛伏期為1 d~7 d,臨床癥狀持續(xù)3 d~6 d,犢牛通過(guò)糞便和鼻腔分泌物進(jìn)行傳播[24]。健康犢牛和患病犢牛均可檢測(cè)到BCoV,在一項(xiàng)研究中,健康犢牛和腹瀉犢牛的BCoV陽(yáng)性率分別為13%(15/118)和2.3%(1/43)。據(jù)報(bào)道,與20年至30年前的犢牛感染情況相比,BCoV引起的腹瀉流行率更高了[25]。
冬季痢疾(Winter dysentery,WD)的特點(diǎn)是成年牛突然腹瀉。通常在冬季流行,由牛冠狀病毒引起,冬季痢疾在世界各地的牛群中發(fā)生。WD的臨床癥狀有血便、發(fā)熱、精神沉郁、脫水、厭食和產(chǎn)奶量下降等,嚴(yán)重時(shí),會(huì)導(dǎo)致貧血。該病毒可在糞便和鼻腔分泌物中檢測(cè)到BCoV,一般潛伏期為2 d~8 d,發(fā)病率高達(dá)100%,但病死率很低。對(duì)患病動(dòng)物支持性治療效果良好,一般在2 d~3 d內(nèi)恢復(fù)健康,發(fā)病通常會(huì)在1周~2周內(nèi)結(jié)束。WD造成的經(jīng)濟(jì)影響巨大,特別是對(duì)奶牛產(chǎn)后影響最大,研究表明,與感染前的日產(chǎn)奶量相比,每次暴發(fā)的產(chǎn)奶量下降幅度可能在1%~70%之間。Toftaker I等[15]通過(guò)模擬線性混合模型來(lái)評(píng)估WD對(duì)奶牛產(chǎn)奶量的影響,并利用線性回歸的方式來(lái)評(píng)估WD對(duì)牛奶成分的影響。發(fā)現(xiàn)在發(fā)病后2 d產(chǎn)奶量損失為15%,發(fā)病后的7 d~ 19 d平均每頭牛損失量約為51 L。牛群產(chǎn)奶量在疫情發(fā)生4個(gè)月后仍有所下降。對(duì)牛奶成分的研究發(fā)現(xiàn),牛奶中游離脂肪酸增加約11%,脂肪/蛋白質(zhì)比小幅增加,WD可能使奶牛進(jìn)入負(fù)能量平衡。Ribeiro J等[26]發(fā)現(xiàn)巴西牧場(chǎng)患有WD的牛同時(shí)還伴有呼吸道癥狀。
1982年,英國(guó)的Thomas L H等[27]在研究犢牛肺炎微生物時(shí)首次發(fā)現(xiàn)BCoV是一種呼吸道病原體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道分離的BCoV血清免疫凝集了呼吸道型BCoV,證明腸道型BCoV和呼吸道型BCoV是屬于同一種血清型。呼吸道BCoV可感染不同年齡段的牛,臨床表現(xiàn)為流鼻涕、呼吸困難、咳嗽和發(fā)熱等,并伴有間質(zhì)性肺炎和Ⅱ型肺細(xì)胞增生[11]。BCoV在牛呼吸系統(tǒng)疾病復(fù)合物(Bovine respiratory disease complex,BRDC)中的作用一直存在爭(zhēng)議。在沒有其他重要呼吸道病原體的情況下,自然發(fā)生BRDC的牛中可觀察到BCoV的脫落,并且已經(jīng)從肺中分離到BCoV。而多項(xiàng)研究結(jié)果表明,與較低BCoV抗體滴度牛相比,較高的BCoV抗體滴度牛在進(jìn)入飼養(yǎng)場(chǎng)時(shí)更不容易發(fā)生BRDC。Workman A M等[28]的研究結(jié)果表明血清抗BCoV抗體滴度與病毒脫落無(wú)關(guān),而病毒脫落與BRDC的發(fā)生呈正相關(guān)。
BCoV常與其他病毒、細(xì)菌和寄生蟲呈混合感染,如牛病毒性腹瀉病毒、輪狀病毒、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和隱孢子蟲等。臨床診斷較困難,根據(jù)動(dòng)物的疾病史、流行情況、臨床表現(xiàn)和病理變化,只能初步診斷為BCoV感染[29]。若想進(jìn)一步確診,則需通過(guò)電子顯微鏡、病毒培養(yǎng)、血清學(xué)或分子檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行確診。
快速橫向流動(dòng)免疫分析技術(shù)可應(yīng)用于奶牛和犢牛[30],活體動(dòng)物可采集鼻拭子和糞便樣本,必須注意的是,BCoV在最初感染時(shí)病毒脫落率很高,隨后停止脫落或變?yōu)殚g歇性脫落;病死動(dòng)物可采集氣管、鼻甲、結(jié)腸和腸系膜淋巴結(jié)等部位進(jìn)行檢測(cè)[24]。電子顯微鏡因靈敏度低而未被廣泛使用。從腸道或呼吸道分離到的BCoV,可使用HRT-18細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),但是這個(gè)操作較為繁瑣,且耗時(shí)較長(zhǎng),不適用于臨床診斷。免疫熒光或免疫組化染色用于檢測(cè)組織中的病毒抗原。為了判定動(dòng)物的血清學(xué)反應(yīng),可進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。使用ELISA可以檢測(cè)鼻拭子和糞便樣本中的抗原,由于牛的血清轉(zhuǎn)化很常見,所以要做重復(fù)試驗(yàn)。分子檢測(cè)方法耗時(shí)短、靈敏度高,被廣泛應(yīng)用,包括RT-PCR、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR和基因組測(cè)序[31]。BCoV N基因常被用作首選基因,因?yàn)镹基因序列有較高的保守性。S基因則常被用于流行病學(xué)調(diào)查和病毒分離鑒定[32]。但是由于分子檢測(cè)方法存在較高的靈敏度,也可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。例如Oma V S等[18]對(duì)牛進(jìn)行接種試驗(yàn),接種第3周,沒有犢牛被感染,接種第5周后,用RT-qPCR檢測(cè)到病毒脫落,但是沒有分離出病毒。
由于目前對(duì)病毒性疾病沒有有效的治療方法,一般常用支持性治療。犢牛腹瀉的治療包括補(bǔ)充體液、葡萄糖和電解質(zhì)等,以對(duì)抗脫水、低血糖、電解質(zhì)失衡和酸中毒等病癥。同時(shí)將犢牛置于溫暖和干燥的畜欄中飼養(yǎng)。冬季痢疾通常是一種自限性疾病,然而,在晚期的病例中需要口服或靜脈輸液治療,嚴(yán)重的痢疾則須輸血治療,也可配合使用非甾體抗炎藥和抗出血藥物[29]。對(duì)于呼吸道BCoV,由于繼發(fā)性細(xì)菌感染很常見,仍建議抗菌治療,配合使用非甾體抗炎藥效果更好。
BCoV是牛常見的感染性病原誘發(fā)因素,在宿主、病原體和環(huán)境相關(guān)的復(fù)雜因素之間發(fā)展。治療BCoV誘發(fā)疾病的有效方法是使用抗菌藥物和抗病毒藥物,但過(guò)量使用抗菌藥物會(huì)使牛產(chǎn)生耐藥性,在機(jī)體殘留,危害人類健康。只有提前預(yù)防BCoV的感染,才能有效減少抗菌藥物的使用,進(jìn)而提高動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量。BCoV的預(yù)防最有效的方法就是疫苗接種,目前已有預(yù)防犢牛腹瀉和冬季痢疾的疫苗。研究人員為妊娠母牛開發(fā)了一種滅活病毒疫苗,以通過(guò)初乳增強(qiáng)犢牛的被動(dòng)免疫,預(yù)防犢牛腹瀉。另一種是改良的犢??诜钜呙?,也可預(yù)防犢牛腹瀉。冬季痢疾可以使用富含血凝素抗原的滅活疫苗來(lái)預(yù)防。BCoV還經(jīng)常與其他病原體混合感染,可導(dǎo)致呼吸道疾病,如犢牛肺炎和牛敗血癥。預(yù)防牛呼吸道冠狀病毒可使用鼻內(nèi)注射多價(jià)滅活疫苗或減毒活疫苗[33]。但是現(xiàn)在使用的商業(yè)疫苗中冠狀病毒的基因型與牛流行毒株的基因型之間有差異,這種差異可能使疫苗對(duì)流行毒株沒有保護(hù)作用[34]。為了提供最佳的免疫力,疫苗的抗原應(yīng)盡可能與流行毒株相近。因此,未來(lái)的研究方向應(yīng)側(cè)重于流行病學(xué)監(jiān)測(cè),從而避免疫苗接種失敗的可能性。
良好的飼養(yǎng)管理、干凈的牛舍環(huán)境和生物安全都對(duì)預(yù)防BCoV起著至關(guān)重要的作用。BCoV對(duì)溫度和消毒劑敏感,如次氯酸鈉、700 mL/L乙醇和甲醛等。冠狀病毒在低溫和相對(duì)高濕度下存活良好,可在地面存活120 h,在有機(jī)介質(zhì)中存活時(shí)間更長(zhǎng)[35]。因此,應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,定期對(duì)牛舍進(jìn)行打掃、消毒、通風(fēng)并保持干燥的牛舍環(huán)境。挪威是世界上唯一實(shí)施BCoV控制規(guī)劃的國(guó)家。自2016年以來(lái),對(duì)BCoV進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)并對(duì)陽(yáng)性和陰性畜群進(jìn)行分類管理。該計(jì)劃旨在通過(guò)采取生物安全措施保護(hù)畜群免受BCoV感染,從而預(yù)防疾病的發(fā)生。該生物安全措施包括對(duì)牛奶、初乳和犢牛及時(shí)進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè),將陰性動(dòng)物設(shè)1年有效期,并鼓勵(lì)農(nóng)戶購(gòu)買BCoV陰性的犢牛;使用不同的運(yùn)輸工具對(duì)陽(yáng)性和陰性的動(dòng)物分開運(yùn)輸;對(duì)農(nóng)場(chǎng)的管理人員等提供防護(hù)服和防護(hù)鞋;運(yùn)輸司機(jī)在不進(jìn)入牛舍的情況下接觸動(dòng)物;最后,設(shè)立熱線,及時(shí)報(bào)告疾病暴發(fā),以限制疾病進(jìn)一步的傳播。
BCoV包括3種臨床癥狀,然而,牛呼吸道冠狀病毒在BRDC中的作用仍需要被證明。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步研究感染同一種BCoV的動(dòng)物出現(xiàn)不同臨床癥狀的原因,以及牛冠狀病毒向人類之間是否能跨越物種傳播。鑒于最近冠狀病毒的大流行,了解牛是否會(huì)感染并傳播SARS-CoV-2也是至關(guān)重要的。