牛冠狀病毒研究進(jìn)展

沈思思，陳 亮，馮萬宇，蘭世捷，李 丹，苗 艷，張 蕾，黃寶銀，王 歡，劉 文，劉德會，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

冠狀病毒(Coronavirus，CoV)是一種嚴(yán)重危害人類和動物健康的病原，主要引起宿主的呼吸道和消化道感染。繼2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)和2012年的中東呼吸綜合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)之后，2019年由SARS-CoV-2引起的人類群體性肺炎——新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 19,COVID-19)，又將冠狀病毒重新引入大眾視野[1-2]。這3種冠狀病毒的共同特點(diǎn)是由動物傳播到人類，并且嚴(yán)重威脅人類健康，給世界各國造成巨大的危害。牛冠狀病毒(Bovine coronavirus,BCoV)與1967年首次分離的人類冠狀病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)高度相似，核苷酸同源性為96%[3]。1988年，從德國一名兒童的腹瀉樣本中分離出1種命名為HEC4408的冠狀病毒毒株，其基因組顯示該毒株與BCoV的關(guān)系比其他人類冠狀病毒關(guān)系更加密切，說明該毒株可能來源于BCoV[4]。這些都提示BCoV和人類冠狀病毒之間有跨越物種傳播的可能。本文從BCoV的基因組結(jié)構(gòu)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、臨床癥狀、診斷、治療和預(yù)防等方面進(jìn)行綜述，以期為BCoV的進(jìn)一步研究提供考。

1 基因組結(jié)構(gòu)

BCoV屬于冠狀病毒科、β冠狀病毒屬?；蚪M為一個約31 kb的單股正鏈RNA病毒，包括10個開放閱讀框(open reading frames,ORFs)，兩端是5′和3′非翻譯區(qū)域。ORF1編碼多聚蛋白pp1a，通過核糖體轉(zhuǎn)移為pp1ab，然后被蛋白酶水解成多個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein,NSP)。ORF3、ORF4、ORF8、ORF9和ORF10分別編碼血凝素酯酶蛋白(hemagglutinin protein,HE)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)，它們是病毒粒子的組成部分，其余的ORFs編碼額外的NSPs，如32 ku和12 ku，對其功能未有深入研究[5]。

在冠狀病毒中研究最多的是S蛋白，屬于Ⅰ類病毒融合蛋白，在病毒入胞和致病作用中起著重要的作用。S蛋白分裂為S1(N端)和S2(C端)亞基。S1亞基負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、中和抗體誘導(dǎo)和血凝素活性。S1亞基內(nèi)的氨基酸突變反映了病毒抗原性和致病性的變化，S1核苷酸序列常用于系統(tǒng)發(fā)育研究和分子流行病學(xué)調(diào)查。S2亞基為跨膜蛋白，在病毒侵襲過程中介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜融合[6]。

BCoV有一種獨(dú)特基因編碼的表面血凝素酯酶(HE)蛋白，在其他冠狀病毒未曾發(fā)現(xiàn)。HE蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗BCoV的中和抗體[7]。HE蛋白包含2個重要的功能結(jié)構(gòu)域凝集素結(jié)構(gòu)域和酯酶結(jié)構(gòu)域。凝集素結(jié)構(gòu)域識別細(xì)胞內(nèi)的糖受體，而酯酶結(jié)構(gòu)域可以破壞受體的酶活性，能夠從目標(biāo)細(xì)胞表面移除細(xì)胞受體。受體結(jié)合(凝集素)和受體破壞(酯酶)區(qū)域?qū)Σ《镜娜氚兄匾绊?。因此，除了S蛋白外，HE蛋白還充當(dāng)了感染起始的第二種病毒附著蛋白的角色[8]。

2 流行病學(xué)

BCoV是引起新生犢牛腹瀉、冬季痢疾和牛呼吸道感染的重要病原之一。冬季痢疾通常發(fā)生在較冷的地區(qū)，但最新研究顯示在較暖的季節(jié)和熱帶地方也曾發(fā)生該病，如韓國的夏季，以及泰國、巴西和古巴等[9]。牛感染BCoV可導(dǎo)致幼畜死亡、生長遲緩、產(chǎn)奶量減少和奶品質(zhì)降低，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除了感染牛外，BCoV也可以感染野生反芻動物，如馴鹿、非洲大羚羊、麋鹿、羊駝和長頸鹿等[10]。

根據(jù)臨床癥狀，可將BCoV引起的疾病可分為腸道型和呼吸道型。BCoV感染途徑是糞-口或氣溶膠等傳播，感染牛是主要的傳染源[11]。研究表明，病毒在亞臨床感染的成年牛體內(nèi)可持續(xù)存在[12]。BCoV分離株在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的聚類并不取決于它們是腸道型還是呼吸道型，而是取決于樣本的地理來源[7]。在加拿大冠狀病毒呼吸道分離株魁北克BCG-3994就與加拿大腸道分離株在同一分支[12]。BCoV只有一種血清型，可以用分子生物學(xué)和血清學(xué)等方法進(jìn)行鑒別。

BCoV在世界各地廣泛存在[14]。挪威的研究表明，2009年，BCoV在牛群中的血清陽性率分別為39.3%和80.7%；2016年，牛群中檢測的血清陽性率為72.2%[15]。意大利在2006年期間，4次呼吸道疾病暴發(fā)均與BCoV有關(guān)，但未同時發(fā)現(xiàn)其他呼吸道病原體，并且其中的2次在腸道也檢測到了BCoV[13]，說明感染的犢?？稍谀c道和呼吸道同時攜帶BCoV。比利時30%的犢牛中檢測到BCoV的血清轉(zhuǎn)化。在愛爾蘭(2008年-2012年)的一項(xiàng)回顧性研究中，BCoV是呼吸道疾病暴發(fā)時牛鼻拭子中最常見的病毒[16]。法國的兩項(xiàng)獨(dú)立研究收集的呼吸樣本中檢測到BCoV的概率為17%～63%。2020年，譚爍等[17]報道了新疆和遼寧地區(qū)的16個奶牛場153份奶牛腹瀉糞便樣本中檢測到的BCoV陽性率為71.24%，場陽性率達(dá)100%。綜上所述，BCoV具有較高的流行性和廣泛的傳播范圍。

3 發(fā)病機(jī)制

BCoV通過S蛋白與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。最開始復(fù)制發(fā)生在呼吸道(鼻甲、氣管和肺)，還是胃腸道(腸上皮細(xì)胞)仍然是一個具有爭議性的問題。一方面，最初的復(fù)制是發(fā)生在呼吸道，大量的病毒被黏液保護(hù)，然后被吞下，感染腸道[18]。而另一面，胃腸道是首先被感染的，病毒以病毒血癥進(jìn)入的呼吸道。BCoV可以感染整個胃腸道，從十二指腸開始向大腸擴(kuò)散，引起絨毛萎縮等黏膜病變。在呼吸道，BCoV可以引起間質(zhì)性肺炎和鼻甲、氣管及肺的上皮損傷[19]。Kanno T等[20]的研究表明，病毒脫落可持續(xù)很長一段時間。用套式PCR檢測結(jié)果表明，鼻分泌物中BCoV可持續(xù)存在932 d，糞便中BCoV可持續(xù)存在1 058 d。

4 臨床癥狀

4.1 新生犢牛腹瀉

新生犢牛腹瀉能引起小腸絨毛發(fā)育遲緩，同時導(dǎo)致大腸的結(jié)腸嵴萎縮[9]。犢牛的日齡和免疫力決定了發(fā)病率和病死率[21]。被感染母牛所生的犢牛患腹瀉的風(fēng)險則更高[22]。新生犢牛對疾病的保護(hù)依賴于腸腔中存在的特異性初乳抗體。血清中的初乳抗體不是直接保護(hù)黏膜，而是取決于再分泌進(jìn)入腸腔內(nèi)的免疫球蛋白數(shù)量。只有腸腔中有大量初乳抗體，才能有效防止BCoV的感染。通過給懷孕母牛注射疫苗可以誘導(dǎo)初乳中產(chǎn)生抗體，供給犢牛被動免疫保護(hù)，有效的預(yù)防BCoV。病毒感染可引起犢牛出血性腹瀉，大多數(shù)犢牛伴有黃色稀便、脫水、體溫降低和精神沉郁等癥狀?；疾倥Ｊ秤徽窈碗娊赓|(zhì)損失，可引起代謝性酸中毒和低血糖[23]。嚴(yán)重者還會引起發(fā)熱、倒地不起和死亡等。一些犢牛還會伴有呼吸癥狀。大多數(shù)感染為3日齡～21日齡，潛伏期為1 d～7 d，臨床癥狀持續(xù)3 d～6 d，犢牛通過糞便和鼻腔分泌物進(jìn)行傳播[24]。健康犢牛和患病犢牛均可檢測到BCoV，在一項(xiàng)研究中，健康犢牛和腹瀉犢牛的BCoV陽性率分別為13%(15/118)和2.3%(1/43)。據(jù)報道，與20年至30年前的犢牛感染情況相比，BCoV引起的腹瀉流行率更高了[25]。

4.2 冬季痢疾

冬季痢疾(Winter dysentery，WD)的特點(diǎn)是成年牛突然腹瀉。通常在冬季流行，由牛冠狀病毒引起，冬季痢疾在世界各地的牛群中發(fā)生。WD的臨床癥狀有血便、發(fā)熱、精神沉郁、脫水、厭食和產(chǎn)奶量下降等，嚴(yán)重時，會導(dǎo)致貧血。該病毒可在糞便和鼻腔分泌物中檢測到BCoV，一般潛伏期為2 d～8 d，發(fā)病率高達(dá)100%，但病死率很低。對患病動物支持性治療效果良好，一般在2 d～3 d內(nèi)恢復(fù)健康，發(fā)病通常會在1周～2周內(nèi)結(jié)束。WD造成的經(jīng)濟(jì)影響巨大，特別是對奶牛產(chǎn)后影響最大，研究表明，與感染前的日產(chǎn)奶量相比，每次暴發(fā)的產(chǎn)奶量下降幅度可能在1%～70%之間。Toftaker I等[15]通過模擬線性混合模型來評估WD對奶牛產(chǎn)奶量的影響，并利用線性回歸的方式來評估WD對牛奶成分的影響。發(fā)現(xiàn)在發(fā)病后2 d產(chǎn)奶量損失為15%，發(fā)病后的7 d～ 19 d平均每頭牛損失量約為51 L。牛群產(chǎn)奶量在疫情發(fā)生4個月后仍有所下降。對牛奶成分的研究發(fā)現(xiàn)，牛奶中游離脂肪酸增加約11%，脂肪/蛋白質(zhì)比小幅增加，WD可能使奶牛進(jìn)入負(fù)能量平衡。Ribeiro J等[26]發(fā)現(xiàn)巴西牧場患有WD的牛同時還伴有呼吸道癥狀。

4.3 牛呼吸道冠狀病毒

1982年，英國的Thomas L H等[27]在研究犢牛肺炎微生物時首次發(fā)現(xiàn)BCoV是一種呼吸道病原體。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道分離的BCoV血清免疫凝集了呼吸道型BCoV，證明腸道型BCoV和呼吸道型BCoV是屬于同一種血清型。呼吸道BCoV可感染不同年齡段的牛，臨床表現(xiàn)為流鼻涕、呼吸困難、咳嗽和發(fā)熱等，并伴有間質(zhì)性肺炎和Ⅱ型肺細(xì)胞增生[11]。BCoV在牛呼吸系統(tǒng)疾病復(fù)合物(Bovine respiratory disease complex,BRDC)中的作用一直存在爭議。在沒有其他重要呼吸道病原體的情況下，自然發(fā)生BRDC的牛中可觀察到BCoV的脫落，并且已經(jīng)從肺中分離到BCoV。而多項(xiàng)研究結(jié)果表明，與較低BCoV抗體滴度牛相比，較高的BCoV抗體滴度牛在進(jìn)入飼養(yǎng)場時更不容易發(fā)生BRDC。Workman A M等[28]的研究結(jié)果表明血清抗BCoV抗體滴度與病毒脫落無關(guān)，而病毒脫落與BRDC的發(fā)生呈正相關(guān)。

5 疾病臨床診斷

BCoV常與其他病毒、細(xì)菌和寄生蟲呈混合感染，如牛病毒性腹瀉病毒、輪狀病毒、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和隱孢子蟲等。臨床診斷較困難，根據(jù)動物的疾病史、流行情況、臨床表現(xiàn)和病理變化，只能初步診斷為BCoV感染[29]。若想進(jìn)一步確診，則需通過電子顯微鏡、病毒培養(yǎng)、血清學(xué)或分子檢測等實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行確診。

快速橫向流動免疫分析技術(shù)可應(yīng)用于奶牛和犢牛[30]，活體動物可采集鼻拭子和糞便樣本，必須注意的是，BCoV在最初感染時病毒脫落率很高，隨后停止脫落或變?yōu)殚g歇性脫落；病死動物可采集氣管、鼻甲、結(jié)腸和腸系膜淋巴結(jié)等部位進(jìn)行檢測[24]。電子顯微鏡因靈敏度低而未被廣泛使用。從腸道或呼吸道分離到的BCoV，可使用HRT-18細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但是這個操作較為繁瑣，且耗時較長，不適用于臨床診斷。免疫熒光或免疫組化染色用于檢測組織中的病毒抗原。為了判定動物的血清學(xué)反應(yīng)，可進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。使用ELISA可以檢測鼻拭子和糞便樣本中的抗原，由于牛的血清轉(zhuǎn)化很常見，所以要做重復(fù)試驗(yàn)。分子檢測方法耗時短、靈敏度高，被廣泛應(yīng)用，包括RT-PCR、套式RT-PCR、熒光定量RT-PCR和基因組測序[31]。BCoV N基因常被用作首選基因，因?yàn)镹基因序列有較高的保守性。S基因則常被用于流行病學(xué)調(diào)查和病毒分離鑒定[32]。但是由于分子檢測方法存在較高的靈敏度，也可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。例如Oma V S等[18]對牛進(jìn)行接種試驗(yàn)，接種第3周，沒有犢牛被感染，接種第5周后，用RT-qPCR檢測到病毒脫落，但是沒有分離出病毒。

6 治療

由于目前對病毒性疾病沒有有效的治療方法，一般常用支持性治療。犢牛腹瀉的治療包括補(bǔ)充體液、葡萄糖和電解質(zhì)等，以對抗脫水、低血糖、電解質(zhì)失衡和酸中毒等病癥。同時將犢牛置于溫暖和干燥的畜欄中飼養(yǎng)。冬季痢疾通常是一種自限性疾病，然而，在晚期的病例中需要口服或靜脈輸液治療，嚴(yán)重的痢疾則須輸血治療，也可配合使用非甾體抗炎藥和抗出血藥物[29]。對于呼吸道BCoV，由于繼發(fā)性細(xì)菌感染很常見，仍建議抗菌治療，配合使用非甾體抗炎藥效果更好。

7 預(yù)防

BCoV是牛常見的感染性病原誘發(fā)因素，在宿主、病原體和環(huán)境相關(guān)的復(fù)雜因素之間發(fā)展。治療BCoV誘發(fā)疾病的有效方法是使用抗菌藥物和抗病毒藥物，但過量使用抗菌藥物會使牛產(chǎn)生耐藥性，在機(jī)體殘留，危害人類健康。只有提前預(yù)防BCoV的感染，才能有效減少抗菌藥物的使用，進(jìn)而提高動物產(chǎn)品質(zhì)量。BCoV的預(yù)防最有效的方法就是疫苗接種，目前已有預(yù)防犢牛腹瀉和冬季痢疾的疫苗。研究人員為妊娠母牛開發(fā)了一種滅活病毒疫苗，以通過初乳增強(qiáng)犢牛的被動免疫，預(yù)防犢牛腹瀉。另一種是改良的犢牛口服活疫苗，也可預(yù)防犢牛腹瀉。冬季痢疾可以使用富含血凝素抗原的滅活疫苗來預(yù)防。BCoV還經(jīng)常與其他病原體混合感染，可導(dǎo)致呼吸道疾病，如犢牛肺炎和牛敗血癥。預(yù)防牛呼吸道冠狀病毒可使用鼻內(nèi)注射多價滅活疫苗或減毒活疫苗[33]。但是現(xiàn)在使用的商業(yè)疫苗中冠狀病毒的基因型與牛流行毒株的基因型之間有差異，這種差異可能使疫苗對流行毒株沒有保護(hù)作用[34]。為了提供最佳的免疫力，疫苗的抗原應(yīng)盡可能與流行毒株相近。因此，未來的研究方向應(yīng)側(cè)重于流行病學(xué)監(jiān)測，從而避免疫苗接種失敗的可能性。

良好的飼養(yǎng)管理、干凈的牛舍環(huán)境和生物安全都對預(yù)防BCoV起著至關(guān)重要的作用。BCoV對溫度和消毒劑敏感，如次氯酸鈉、700 mL/L乙醇和甲醛等。冠狀病毒在低溫和相對高濕度下存活良好，可在地面存活120 h，在有機(jī)介質(zhì)中存活時間更長[35]。因此，應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期對牛舍進(jìn)行打掃、消毒、通風(fēng)并保持干燥的牛舍環(huán)境。挪威是世界上唯一實(shí)施BCoV控制規(guī)劃的國家。自2016年以來，對BCoV進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測并對陽性和陰性畜群進(jìn)行分類管理。該計劃旨在通過采取生物安全措施保護(hù)畜群免受BCoV感染，從而預(yù)防疾病的發(fā)生。該生物安全措施包括對牛奶、初乳和犢牛及時進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測，將陰性動物設(shè)1年有效期，并鼓勵農(nóng)戶購買BCoV陰性的犢牛；使用不同的運(yùn)輸工具對陽性和陰性的動物分開運(yùn)輸；對農(nóng)場的管理人員等提供防護(hù)服和防護(hù)鞋；運(yùn)輸司機(jī)在不進(jìn)入牛舍的情況下接觸動物；最后，設(shè)立熱線，及時報告疾病暴發(fā)，以限制疾病進(jìn)一步的傳播。

8 展望

BCoV包括3種臨床癥狀，然而，牛呼吸道冠狀病毒在BRDC中的作用仍需要被證明。未來應(yīng)進(jìn)一步研究感染同一種BCoV的動物出現(xiàn)不同臨床癥狀的原因，以及牛冠狀病毒向人類之間是否能跨越物種傳播。鑒于最近冠狀病毒的大流行，了解牛是否會感染并傳播SARS-CoV-2也是至關(guān)重要的。