犬瘟熱病毒檢測方法研究進展

王改麗,呼延含蓉，程榮華，郭衍冰，郝良玉，劉沂霖，李昱潔，姚新華*

(1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春 130062；2.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林長春 130062；3.吉林省畜牧業(yè)管理局，吉林長春 130000)

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由麻疹病毒屬成員犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起犬的一種急性發(fā)熱性、接觸性傳染病，可感染多種家養(yǎng)動物和野生動物，對世界各地的瀕危物種保護構(gòu)成威脅。CDV感染會導(dǎo)致淋巴細胞減少和長時間免疫抑制，且易造成繼發(fā)感染?；既R床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、卡他性呼吸道癥狀、胃腸道疾病、皮疹和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。自1950年以來，CDV疫苗的廣泛使用有效控制了多個國家和地區(qū)CD的暴發(fā)。但近年來免疫動物包括家養(yǎng)和野生動物發(fā)病的報道不斷增多，非人靈長類猴群致病率和病死率分別可達60%和30%。研究發(fā)現(xiàn)商業(yè)疫苗株和流行的CDV野毒株抗原之間存在較大差異，導(dǎo)致現(xiàn)用疫苗不能達到完全的免疫保護。此外，CDV宿主范圍的不斷擴大，來自不同地域或在不同物種宿主間傳播導(dǎo)致其生物學(xué)特性發(fā)生變化，其基因也更加多樣性。因此，對CDV的檢測方法進行綜述，以期為CDV的診斷提供有效的檢測方法。

1 基因組結(jié)構(gòu)

CDV顆粒為多形性，多為球形，直徑約150 nm。CDV為有囊膜包裹的、單股、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。目前，CDV僅有1個血清型。CDV基因組約15 690個核苷酸，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白，核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大蛋白(L)，而P基因分別利用重疊的開放閱讀框(ORF)和在mRNA合成過程中插入非模板G殘基進行RNA編輯編碼C和V非結(jié)構(gòu)蛋白，V和C蛋白能夠阻礙宿主的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)[1]。其中，N蛋白在CDV轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中具有調(diào)節(jié)和裝配的作用；P和L蛋白為轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)蛋白；M蛋白與病毒粒子的裝配和感染釋放相關(guān)；H和F蛋白為病毒囊膜糖蛋白，在病毒吸附和侵入宿主細胞過程發(fā)揮重要作用[2]。H蛋白是CDV嗜性蛋白，能夠調(diào)控宿主特異性，也是變異性最大的蛋白，在CDV毒株之間核苷酸差異可高達11%，是研究CDV變異和進化的適宜靶點，常將H蛋白作為CDV分型依據(jù)[2]。F蛋白在誘導(dǎo)病毒囊膜與宿主細胞膜融合反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)二者膜融合，完成CDV入侵宿主細胞過程[3]。

2 流行病學(xué)特點

CD是由CDV引起的高度接觸性傳染病，感染犬科動物后其病死率為30%～80%，雪貂的病死率甚至可達100%。該病一年四季均可發(fā)生，但冬季、春季多發(fā)，不同年齡、性別及品種的犬均可感染，但是1歲以下的犬最為易感。目前，CDV只有1個血清型，通過對疾病流行地區(qū)H基因的比對分析發(fā)現(xiàn)目前CDV毒株同時有多個基因型流行[4]。CDV的主要傳染源為發(fā)病動物、隱性感染的帶毒動物及其排泄物，其中眼、鼻分泌物、呼吸道及糞便中病毒載量較高。CDV可經(jīng)垂直和水平方式傳播，被污染的水、食物、環(huán)境等是CDV的主要傳染途徑。

CD最初被認(rèn)為是一種家犬易感的傳染性疾病，但目前CDV已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的多宿主病原體，自然感染宿主范圍廣泛，包括犬科、貓科、鼬科、浣熊科、鬣狗科、熊貓科以及靈長目獼猴科、偶蹄目豬科、鰭足目海豹科、鯨目海豚科等；還有CDV感染大熊貓和東北虎致死的報道[5]。CDV可跨宿主種屬傳播，其感染譜系呈不斷擴大趨勢。此外，CDV還可人工感染豚鼠、地鼠、小白鼠及松鼠猴等動物。雖然目前尚無人類感染CDV的報道，但在人類癌細胞系如乳腺癌、肺癌和前列腺癌細胞系均可分離獲得CDV，研究人員在人Paget變形性骨炎患者骨組織中檢測到CDV核酸及抗原，推測CDV可能與慢性骨病發(fā)生相關(guān)，但是CD是否為潛在的人獸共患病還需進一步研究證實。

3 臨床表現(xiàn)

CDV能夠引起動物消化、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)病癥[6]，不同病毒來源、數(shù)量、毒力強弱和患病動物免疫力不同其臨床癥狀也不同，臨床表現(xiàn)主要為雙相熱、胃腸道炎癥、上呼吸道炎癥、卡他性肺炎及神經(jīng)癥狀?；疾∪饕R床癥狀為雙相熱，初期精神沉郁，食欲減退，鼻鏡干燥、龜裂，結(jié)膜潮紅腫脹。消化系統(tǒng)癥狀病犬常發(fā)生腹瀉，排血便或伴有黏液的糞便，有時可見嘔吐。呼吸系統(tǒng)癥狀病犬眼、鼻可見有水樣分泌物，嚴(yán)重時可見有膿性分泌物，咳嗽，打噴嚏，肺炎，呼吸困難。神經(jīng)癥狀病犬可見局部如口唇、耳根及眼瞼抽搐，重癥空嚼，流涎，步態(tài)不穩(wěn)、轉(zhuǎn)圈、共濟失調(diào)、肌肉痙攣等，一般出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病犬預(yù)后不良[7]。部分病犬也會出現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)育不全、紅色丘疹、足墊角質(zhì)化等癥狀。根據(jù)病犬發(fā)病史、臨床癥狀并結(jié)合流行病學(xué)情況進行初步診斷，確診還需結(jié)合實驗室診斷。

4 犬瘟熱病毒檢測技術(shù)

4.1 病原檢測

4.1.1 病毒分離鑒定 病毒分離是診斷犬瘟熱最確切的方法，但CDV對環(huán)境的抵抗力很弱，易在外界環(huán)境中滅活，病毒的分離率很低，且病毒分離培養(yǎng)及鑒定工作量較大。臨床上常用犬或貂肺泡或腹腔巨噬細胞或被感染組織與健康犬有絲分裂原刺激的淋巴細胞共培養(yǎng)分離CDV。但是分離培養(yǎng)原代細胞費時費力，且傳代次數(shù)少。因此，建立方便、快捷分離培養(yǎng)的細胞系對CDV致病性研究顯得尤為重要。犬瘟熱病毒受體信號淋巴細胞激活分子(signal lymphatic activation molecule，SLAM)的發(fā)現(xiàn)，為構(gòu)建穩(wěn)定表達SLAM細胞系奠定了基礎(chǔ)。Seki F等[8]分別用表達犬細胞SLAM的Vero細胞系與B95a細胞和Vero細胞分離CDV感染病料，Vero細胞未成功分離到CDV病毒株，B95a細胞通過連續(xù)傳代,在7 d～10 d后分離到3株，而SLAM-Vero細胞系在24 h分離獲得5株CDV病毒株，表明穩(wěn)定表達SLAM受體細胞系能極大提高CDV的分離率。劉玉秀[4]構(gòu)建了Vero/DogSLAM細胞系，利用該細胞系分離獲得猴源和犬源CDV野毒株，在接種病料36 h～48 h可見典型細胞病變，極大地縮短了病毒分離時間，為CDV分子特性研究提供了基礎(chǔ)。但該方法對試驗條件要求較為苛刻，不適于CDV的快速檢測，難以在基層臨床中推廣應(yīng)用。

4.1.2 電鏡觀察 通過電鏡負(fù)染、超薄切片法和液相免疫電鏡等觀察病毒粒子是檢查、確定CDV感染最簡便快速的方法。將采集的臨床樣品經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后可直接進行電鏡觀察，只需2 h～3 h就可完成整個操作過程。在病毒不易提純或無高效價高滴度抗體的情況下，可通過離子捕獲法純化CDV，進行電鏡觀察，整個過程僅需1 h～2 h，方便快速。研究人員將離子捕獲電鏡技術(shù)與免疫電鏡技術(shù)結(jié)合起來，建立了改良離子捕獲電鏡法，提高了完整粒子的檢測率，且效果優(yōu)于單純離子捕獲電鏡法。但是電鏡檢查對病毒數(shù)量和操作人員要求較高，且該法在病毒鑒定時只能觀察病毒的外觀形態(tài)，很難與同科的病毒相區(qū)別，因此一般不作為常規(guī)手段。

4.1.3 包涵體檢測 采集病犬眼結(jié)膜、鼻黏膜、膀胱刮取物和外周血液等制成涂片，或取病死犬淋巴、肺、腦組織等做常規(guī)石蠟切片，進行HE染色，鏡檢可在核內(nèi)和胞漿觀察到紅色或暗紅色的圓形或橢圓形嗜酸性包涵體，是CDV感染的重要標(biāo)志之一。但狂犬病病毒和犬傳染性肝炎病毒等也可形成包涵體，因此僅通過包涵體檢測難以確診，可通過與其他檢測方法結(jié)合如免疫熒光技術(shù)對包涵體內(nèi)病毒抗原進行診斷。

4.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

4.2.1 瓊脂擴散試驗 任文陟等[9]用CDV病貉肝臟制備瓊脂擴散抗原，CDV雞胚成纖維細胞弱毒疫苗免疫綿羊制備瓊脂擴散抗體，建立了CDV瓊脂擴散試驗(agar gel precipitation,AGP)，用于檢測病死動物脾臟、肝臟中CDV抗原，與電鏡檢查結(jié)果總體符合率為90%(9/10) 。該方法操作簡便，易于在獸醫(yī)臨床推廣應(yīng)用，但其靈敏性較差。

4.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)具有特異性高、靈敏度強、適用范圍寬、檢測速度快等優(yōu)點，可用于病毒抗原或動物血清中抗體檢測，已廣泛用于動物疫病的診斷。郭霄峰等[10]建立了檢測犬瘟熱病毒及抗體的間接ELISA方法，具有良好的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，可作為定量檢測犬瘟熱病毒抗體含量的有效方法。張鴻等[11]用CDV單克隆抗體作為捕獲抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的第2種CDV單克隆抗體為檢測抗體，建立了單克隆抗體夾心ELISA方法，特異性良好，該方法敏感性接近于套式PCR，兩種方法的符合率為85%。研究人員將桿狀病毒重組表達的CDV N蛋白作為包被抗原建立了捕獲夾心ELISA方法，用于檢測犬血清中抗CDV特異性的IgG和IgM含量，可用于急性犬瘟熱診斷。通過簡化血清免疫球蛋白的檢測程序，研究人員還建立了IgM-ELISA方法，可用于犬和水貂CDV早期感染的檢測。國內(nèi)學(xué)者將建立的三抗體夾心Dot-ELISA法用于CDV抗原檢測，其最低抗原檢出量為1.15 μg/mL，比常規(guī)ELISA具有更高的敏感性和特異性。

4.2.3 血清中和試驗 血清中和試驗具有較強的特異性和敏感性，是檢測動物體內(nèi)CDV抗體水平和疫苗免疫效果的標(biāo)準(zhǔn)方法。喬貴林等[12]用CDV弱毒及自制的高免犬血清建立了檢測CDV抗體的中和試驗。研究人員在此基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化，采用微量血清法進行中和試驗，其特異性、敏感性更高。但是微量血清中和試驗的試驗周期長，結(jié)果容易誤判，不適于臨床快速診斷，僅適用于實驗室的診斷。

4.2.4 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)(immuno fluorescence assay,IFA)又稱熒光抗體技術(shù)，是目前國際公認(rèn)的檢測CDV的通用方法。熒光抗體技術(shù)方便、快捷、特異性高，是目前實驗室常用的檢測方法，尤其適用于不產(chǎn)生細胞病變的CDV強毒株檢測。研究人員將CDV抗體進行熒光標(biāo)記，通過直接免疫熒光技術(shù)對CDV感染病犬樣品進行檢測；以及特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物后，利用熒光素標(biāo)記的第二抗體與復(fù)合物中第一抗體結(jié)合，通過顯微鏡下觀察特異性熒光，檢測臨床樣品CDV抗原或抗體，該間接免疫熒光方法比直接免疫熒光法敏感度高。湯永平等發(fā)明了檢測CDV的免疫熒光層析檢測卡，其靈敏度高，檢測結(jié)果可靠[13]。陳翠翠等以抗CDV單克隆抗體為包被抗體，Eu3+標(biāo)記的另一種CDV單克隆抗體作為檢測抗體，建立了檢測CDV的雙抗體夾心時間分辨免疫熒光分析方法，該方法具有良好的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度(稀釋回收率)及穩(wěn)定性，該方法與RT-PCR法檢測臨床樣本的符合率為100%[14]。免疫熒光技術(shù)存在易產(chǎn)生非特異性熒光的缺點，且需要特殊的儀器設(shè)備，適用于實驗室診斷。

4.2.5 免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)主要用于被感染動物的死后診斷，可對病原在組織器官和細胞中的分布情況和定位進行檢測。研究人員通過IHC對犬瘟熱病貉體內(nèi)CDV的分布及定位進行檢測，發(fā)現(xiàn)扁桃體是CDV分布最為廣泛的器官。劉雯等[15]建立了間接IHC方法，對人工感染的比格犬腸組織的CDV進行組織定位檢測，發(fā)現(xiàn)CDV主要分布于李氏隱窩的上皮細胞胞漿內(nèi)和小腸絨毛中，該方法具有較強的特異性和靈敏性。但 IHC過程復(fù)雜，需要專業(yè)人員進行操作，且檢測結(jié)果易發(fā)生非特異性染色問題，不適于基層臨床推廣應(yīng)用。

4.2.6 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)(colloidal gold immunochromatography assay,GICA)將膠體金為示蹤物，以硝酸纖維素膜作為抗原或抗體的固相載體，在特定區(qū)域發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)信號的一種快速檢測技術(shù)，該檢測方法特異性強、結(jié)果易判定、快速簡便、不需要額外的儀器，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和寵物醫(yī)院中，是診斷治療的重要輔助手段[16]。蘇建青[17]建立了CDV膠體金免疫層析試紙，與CDV直接免疫熒光方法的特異性和靈敏性相當(dāng)，且該試紙不需要儀器設(shè)備，適用于基層獸醫(yī)臨床的應(yīng)用。孫婧[18]用單克隆抗體建立了CDV膠體金免疫層析檢測方法，該方法具有良好的特異性，操作簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)CDV快速診斷和臨床樣品的快速篩查。鄧柏林等[19]發(fā)明了一種用于檢測樣品中CDV和犬細小病毒的雙重檢測試紙卡，該試紙卡具有操作簡便快速、可通過肉眼判讀結(jié)果、無需特殊試劑和儀器等優(yōu)點。

但CDV膠體金試紙敏感性差，無法定量，只能對樣品進行定性檢測和半定量檢測，重復(fù)性差。研究人員將聚合酶鏈反應(yīng)及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)與膠體金免疫層析法相結(jié)合，用于檢測病原體核酸。研究人員將聚合酶鏈反應(yīng)與膠體金免疫層析法相結(jié)合，建立了檢測乙型肝炎病毒核酸的方法，該方法與實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法陽性檢出率無差異；并在傳統(tǒng)免疫層析試紙條上增加了內(nèi)控檢測帶，實現(xiàn)了病原體的可視化檢測，該方法特異性好，靈敏度高，操作便捷，且能有效避免假陰性結(jié)果。國外學(xué)者將膠體金免疫層析技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)結(jié)合，建立了Ⅲ型錦鯉皰疹病毒快速檢測方法，該方法特異性和敏感性較高、且大大縮短了檢測時間。因此，將CDV膠體金免疫層析檢測方法與聚合酶鏈反應(yīng)等方法相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)臨床樣品的快速診斷，也可使檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。

4.3 分子生物學(xué)檢測方法

4.3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是針對目標(biāo)基因序列設(shè)計特異性引物，擴增目的基因的一種檢測方法，該方法特異性和敏感性強，已成為核酸診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，目前已被廣泛應(yīng)用于病原體等方面的檢測。李金中等在國內(nèi)首次針對CDV融合蛋白基因序列建立了CDV的RT-PCR診斷方法，該方法具有敏感性和準(zhǔn)確度高及特異性強的特點，可用于CDV臨床診斷和實驗研究。臨床樣品檢測過程中，常發(fā)現(xiàn)CDV與犬細小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型等混合感染，單一PCR檢測方法耗時長，不能滿足對多種抗原類型的快速鑒定。因此，許多學(xué)者陸續(xù)建立了可檢測多種病原體的多重PCR方法。俞向前等[20]建立了一種快速檢測CDV、犬細小病毒和犬呼吸道冠狀病毒的多重PCR方法，通過對臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn)，該多重PCR方法與單一PCR方法檢測結(jié)果一致，且省時、省力，還極大地節(jié)約了成本，可用于常見犬呼吸道常見傳染病的流行病學(xué)調(diào)查，并可在臨床病癥相似情況下實現(xiàn)快速鑒別診斷。羅亞坤等[21]針對CDV N基因序列、犬冠狀病毒M基因序列和犬細小病毒VP2基因序列分別設(shè)計特異性引物，建立了多重納米PCR(nano-mPCR)檢測方法，該方法特異性和敏感性良好，其敏感性比普通PCR高100倍，為CDV、犬冠狀病毒和犬細小病毒的臨床鑒別診斷提供了新方法。

套式PCR(nested PCR,nPCR)方法又稱巢式PCR，具有更強的特異性和敏感性，目前已廣泛用于獸醫(yī)臨床診斷。Shin Y J等[22]針對CDV N基因建立了套式PCR方法，將RT-PCR和套式PCR方法用于疑似CDV感染病犬的血液、尿液、鼻拭子和唾液檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)套式PCR敏感性高于常規(guī)PCR方法，且陽性檢出率更。Si W等人建立了一種多重逆轉(zhuǎn)錄套式PCR(RT-nPCR)方法，能夠檢測和鑒別CDV野毒株和疫苗株感染，可用于臨床快速檢測及流行病學(xué)調(diào)查[23]。Martella V等[24]根據(jù)CDV不同譜系H基因的特點，建立了半套式PCR，可對樣品進行鑒定及分型。

實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異性和敏感性更強的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)最早由美國Applied Biosystems公司推出。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，通過實時監(jiān)測熒光信號變化，分析目標(biāo)序列拷貝數(shù)，結(jié)合已知量標(biāo)準(zhǔn)品對靶序列定量。付運星等[25]針對CDV核衣殼蛋白基因序列，建立了一步法熒光定量PCR技術(shù)，可實現(xiàn)實時定量分析，靈敏度是普通RT-PCR方法的100倍，且重復(fù)性良好。王艷杰等[26]選取高度保守且具有型特異性的CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬細小病毒和犬副流感病毒基因序列，設(shè)計特異性引物及TaqManMGB探針，建立了檢測CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬細小病毒和犬副流感病毒的4重TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR方法，適用于臨床CDV、犬腺病毒Ⅱ型、犬細小病毒和犬副流感病毒的快速鑒別診斷。研究人員還建立了鑒別犬瘟熱強弱毒株的SYBR Green Ⅰ 熒光定量RT-PCR檢測方法，能有效區(qū)分CDV野毒株與弱毒疫苗株。熒光定量PCR技術(shù)具有高特異性和敏感性，對處于亞臨床或潛伏感染的患病動物進行診斷時均能獲得很好的結(jié)果。然而，熒光定量PCR方法需要特殊的儀器設(shè)備，難以在臨床進行大范圍應(yīng)用，只可滿足實驗室的檢測及分析。

4.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是Notomi T 等開發(fā)的一種新型、便捷的等溫核酸擴增技術(shù)。LAMP通過不同引物可同時識別多個不同目標(biāo)序列，在鏈置換DNA聚合酶作用下進行指數(shù)擴增，因此具有很高的靈敏度和特異性。與傳統(tǒng)PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)階段，在DNA聚合酶作用下即可實現(xiàn)快速擴增，且試驗結(jié)果可通過肉眼直接觀察或使用LAMP實時濁度儀測定焦磷酸鎂的混濁度以及通過添加熒光染料實現(xiàn)實時監(jiān)測。LAMP方法反應(yīng)速度快，不需要昂貴儀器，只需恒溫水浴鍋，從而有助于降低檢測成本。Liu D F等[27]針對CDV H基因建立了用于鑒別檢測CDV野毒株與疫苗株感染的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(RT-LAMP)，于65 ℃水浴鍋中反應(yīng)40 min即可完成CDV野毒株檢測，特異性高，與犬細小病毒、狂犬病病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒無交叉反應(yīng)，其敏感性是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。王林等[28]發(fā)明了用于快速檢測犬瘟熱病毒的熒光可視化RT-LAMP試劑盒，該試劑盒具有較高的特異性，檢測靈敏度為10拷貝，操作簡便，檢測結(jié)果不需進行電泳，可通過肉眼直接觀察，適用于獸醫(yī)臨床快速檢測。郝鐲等[29]將LAMP與橫向流動試紙條(lateral flow dipstick，LFD)相結(jié)合，建立了RT-LAMP LFD檢測方法，其檢測CDV下限為1×102個拷貝/mL，該方法特異性強，敏感性高，操作方便，檢測結(jié)果易于觀察，可用于臨床診斷。

目前，LAMP檢測技術(shù)具有敏感性高，操作便捷、成本低、適用于臨床現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，已被廣泛用于食品微生物檢測、臨床醫(yī)學(xué)檢測、動物病原微生物檢測等。但是LAMP也存在氣溶膠污染，檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，且擴增產(chǎn)物無法進行克隆測序等缺點。因此，通過不斷優(yōu)化改進LAMP檢測方法，消除攜帶污染，降低假陽性，LAMP檢測技術(shù)將成為臨床診斷中最具潛力的檢測方法。

4.3.3 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù) 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種新型的等溫核酸擴增技術(shù)，利用重組酶與上、下游引物結(jié)合形成蛋白-DNA混合物并啟動尋找模板DNA上的同源序列，引發(fā)鏈置換反應(yīng)。RPA不需要變溫過程，擴增效率高，特異性好，靈敏度高，操作簡單，適合臨床快速檢測，應(yīng)用前景廣闊，且RPA檢測結(jié)果讀取方式多樣。Wang J等[30]將普通RPA方法結(jié)合瓊脂糖凝集電泳對豬圓環(huán)病毒進行分析檢測，其靈敏度是普通PCR方法的10倍；實時熒光法是檢測RPA擴增產(chǎn)物最為常見的方式。張啟龍等[31]針對CDV保守N基因建立了CDV實時熒光RT-RPA檢測方法，該方法特異性較好，檢測下限為5.68×102拷貝/μL，敏感性高于常規(guī)RT-PCR方法，操作快速便捷，20 min內(nèi)即可判讀結(jié)果，可用于臨床犬瘟熱病例的快速診斷。Wang J C等[32]建立的CDV熒光RT-RP檢測方法，40 ℃反應(yīng)3 min～12 min即可，靈敏度比熒光定量PCR高10倍。側(cè)流層析試紙條方法利用雙抗體夾心法，可實現(xiàn)對RPA擴增產(chǎn)物的快速檢測，研究人員將RPA擴增產(chǎn)物經(jīng)側(cè)流層析試紙條對沙門氏菌進行檢測分析，檢測結(jié)果可用肉眼直接觀察，整個操作過程僅需要30 min，且檢測限可以達到10 CFU/mL；目前，與微流控技術(shù)的結(jié)合研究也逐漸成為RPA技術(shù)研究的熱點。

RPA技術(shù)與其他核酸檢測方法相比具有一定的優(yōu)勢，但也存在一些缺點。應(yīng)用瓊脂糖凝集電泳方法檢測RPA產(chǎn)物時，需要開管操作，易產(chǎn)生交叉污染；實時熒光RPA法與傳統(tǒng)熒光PCR探針如TaqMan不兼容，且至今沒有專門針對RPA引物探針的設(shè)計軟件，需要大量合成和篩選，且需要昂貴的實時熒光檢測儀器；側(cè)流層析試紙條技術(shù)雖然實現(xiàn)了RPA 產(chǎn)物的可視化檢測，但開管操作易發(fā)生污染，因此，目前還需要不斷創(chuàng)新RPA檢測技術(shù)，與其他技術(shù)的有效結(jié)合也需要進一步去擴展，探索開發(fā)一種簡便的閉管可視化RPA檢測方法將更有利于RPA技術(shù)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床現(xiàn)場CDV的快速診斷。

4.4 其他檢測方法

雖然熒光定量PCR、LAMP和RPA等檢測方法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，但是無法滿足多種病毒平行檢測的需求。蘇霞等[33]以CDV、犬細小病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、犬冠狀病毒這5種犬腹瀉病毒為靶病毒，選取各病毒基因序列的保守區(qū)域設(shè)計引物，并針對每種病毒的變異區(qū)域設(shè)計探針，通過優(yōu)化檢測體系和反應(yīng)條件，建立了可同時區(qū)分5種病毒的基因芯片診斷方法，可對臨床中犬類混合感染樣品進行檢測，對病毒檢測和篩查具有重要作用。研究人員建立的犬瘟熱病毒抗體液相芯片檢測方法，具有特異性強，敏感性強，重復(fù)性好和檢測范圍廣的特點，能夠定性分析血清樣品中的多種病原抗體。蘇瑞紅等[34]以紅色聚苯乙烯納米微球為載體，建立了快速檢測幼犬CDV母源抗體或免疫犬抗體水平的間接凝集試驗，該方法具有良好的特異性、敏感性及穩(wěn)定性，可用于CDV抗體的快速檢測。馬志華[35]建立了犬瘟熱假病毒中和抗體檢測方法，該方法與傳統(tǒng)中和試驗具有良好的相關(guān)性和一致性，其檢測周期相比傳統(tǒng)中和試驗可縮短2 d，且生物安全性高。

5 結(jié)語

犬瘟熱發(fā)病率高，傳染性強，是嚴(yán)重威脅犬及毛皮動物健康的重要傳染病之一。因此，開發(fā)特異、快速和靈敏的檢測技術(shù)，進行CDV早期檢測，可有效防止疫病的傳播流行。目前，研究人員已研發(fā)出多種CDV檢測方法，但每種方法都存在自身優(yōu)勢和不足之處。病毒分離和包涵體檢測步驟繁瑣且費時，不利于快速診斷；電鏡觀察需要昂貴儀器，不易在獸醫(yī)臨床推廣應(yīng)用。中和試驗適用于動物疫苗免疫后的血清抗體水平檢測，無法用于急性感染診斷。ELISA方法特異性和靈敏性較高，但步驟繁瑣、成本高，可作為樣品篩查和其他檢測方法陽性樣品的確認(rèn)和復(fù)查。目前被寵物醫(yī)院等臨床工作者廣泛使用的膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡單、速度快、檢測結(jié)果易判斷的優(yōu)點，常用于CDV感染樣品的初篩和基層實驗室篩查，但該方法還存在靈敏度和重復(fù)性差、準(zhǔn)確性不高和無法定量的問題[36]。實時熒光定量PCR方法需要昂貴的儀器設(shè)備，難以應(yīng)用于臨床檢測；LAMP方法易出現(xiàn)假陽性和氣溶膠污染等問題；實時熒光RT-RPA方法核酸探針設(shè)計技術(shù)含量高。因此，在進行樣品檢測時可將多種檢測方法相結(jié)合，最大限度提高檢測的準(zhǔn)確率、特異性和敏感性。推進新型快速診斷技術(shù)的研發(fā)，促使實驗室和臨床檢測技術(shù)不斷創(chuàng)新，檢測手段不斷成熟和完善，將會有更多快速、靈敏、高特異性、低成本的檢測技術(shù)能夠滿足CDV實驗室和臨床檢測需求的檢測方法。