中國(guó)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)分子流行病學(xué)研究進(jìn)展

李俊強(qiáng), 張苗苗, 張峻晨, 付寅, 秦子揚(yáng), 李曉迎, 張龍現(xiàn)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;2.河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046)

十二指腸賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)(亦稱藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)或腸賈第蟲(chóng))是引起賈第蟲(chóng)病的主要病原。據(jù)估算,全球范圍內(nèi)每年約2.8億人感染十二指腸賈第蟲(chóng),其引起的賈第蟲(chóng)病在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較高[1]。賈第蟲(chóng)病典型的臨床癥狀為腹瀉,5歲及以下兒童嚴(yán)重時(shí)可能出現(xiàn)死亡[2]。賈第蟲(chóng)主要通過(guò)糞口途徑進(jìn)行傳播,被感染個(gè)體排出的包囊可通過(guò)飲水或食物傳播,是潛在的傳染來(lái)源,目前已經(jīng)報(bào)道多起水源性及食源性賈第蟲(chóng)病的暴發(fā)[3]。然而,迄今為止尚無(wú)有效防控賈第蟲(chóng)病的藥物與疫苗[4]。家兔是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,同時(shí)也是多種人獸共患病原的重要傳播來(lái)源[5],ROBINSON等[6]和NAGUIB等[7]曾分別報(bào)道家兔是導(dǎo)致人隱孢子蟲(chóng)病暴發(fā)和感染的主要來(lái)源。同時(shí),家兔也可作為寵物進(jìn)行家庭飼養(yǎng),其攜帶的人獸共患病原具有通過(guò)食物或飲水進(jìn)行傳播的潛在威脅。國(guó)內(nèi)外報(bào)道十二指腸賈第蟲(chóng)在家兔中的感染率為1.9%～72.3%[8-15],基因型鑒定分類為A、B和E這3種集聚體,均具有潛在的人獸共患性[8,14-15],表明家兔在十二指腸賈第蟲(chóng)的人獸共患傳播過(guò)程中起重要作用。中國(guó)是世界上最大的兔肉生產(chǎn)國(guó)[16]。本綜述對(duì)目前中國(guó)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的分子流行病學(xué)研究進(jìn)行了總結(jié)和分析,以更好了解賈第蟲(chóng)病在中國(guó)家兔中的流行病學(xué)特點(diǎn),評(píng)估其人獸共患傳播風(fēng)險(xiǎn),以期為中國(guó)兔源賈第蟲(chóng)病的防控提供理論指導(dǎo)。

1 十二指腸賈第蟲(chóng)分類

賈第蟲(chóng)(Giardiaspp.)是一種廣泛存在于人類和多種動(dòng)物的腸道寄生性原蟲(chóng),根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染宿主范圍目前被分為9個(gè)種類[17],分別為十二指腸賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)、微小賈第蟲(chóng)(Giardiamicroti)、鼠賈第蟲(chóng)(Giardiamuris)、敏捷賈第蟲(chóng)(Giardiaagilis)、蒼鷺賈第蟲(chóng)(Giardiaardeae)、鸚鵡賈第蟲(chóng)(Giardiapsittaci)、瓦氏賈第蟲(chóng)(Giardiavarani)、袋貍賈第蟲(chóng)(Giardiaperamelis)和倉(cāng)鼠賈第蟲(chóng)(Giardiacricetidarum)。新的賈第蟲(chóng)種還在不斷被發(fā)現(xiàn)與鑒定,其中袋貍賈第蟲(chóng)和倉(cāng)鼠賈第蟲(chóng)分別于2016年[18]和2018年[19]被命名。

十二指腸賈第蟲(chóng)宿主范圍最為廣泛,可感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物,具有重要的人獸共患性[20]。十二指腸賈第蟲(chóng)在全球范圍內(nèi)流行,對(duì)人類、寵物及家畜健康造成嚴(yán)重危害,引起較為重大的經(jīng)濟(jì)損失[21]。十二指腸賈第蟲(chóng)是一個(gè)復(fù)雜的綜合體[22],常用于十二指腸賈第蟲(chóng)基因型分型的位點(diǎn)包括小亞基核糖體(small subunit ribosomal RNA,SSUrRNA)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase,tpi)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,gdh)和β-賈第素(β-giardin,bg)。通過(guò)比較基因片段的特異性和序列的差異性,十二指腸賈第蟲(chóng)被分為8個(gè)集聚體(A～H),每個(gè)集聚體形態(tài)學(xué)差異不顯著,但具有一定的宿主特異性[20-21]。十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A和集聚體B感染人類和多種哺乳動(dòng)物,具有顯著人獸共患潛力[2];集聚體C和D主要感染犬科動(dòng)物;集聚體E主要感染豬和反芻動(dòng)物;集聚體F多感染貓科動(dòng)物;集聚體G僅感染嚙齒類動(dòng)物;集聚體H僅感染海洋動(dòng)物[20]。十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體之間感染宿主范圍存在顯著差異,因此將不同的集聚體分別命名為不同的賈第蟲(chóng)種[20-21]。

根據(jù)宿主范圍,十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A和B具有廣泛的宿主范圍,可在人類與動(dòng)物間進(jìn)行傳播,嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全[2]。到目前為止,除了集聚體A和B之外,集聚體C、D、E和F也均有感染人的零星報(bào)道[23-29],其中集聚體E感染人的報(bào)道稍多[23,25-27,29]?；谑改c賈第蟲(chóng)多位點(diǎn)基因分型(multi locus genotyping,MLG)技術(shù),集聚體A又可以分為3個(gè)亞型,分別為AⅠ、AⅡ、AⅢ,各亞型之間具有寄生宿主偏好性[21,30]。亞集聚體AⅠ主要感染家畜;AⅡ主要感染人;AⅢ主要感染野生哺乳動(dòng)物[21]。集聚體B之前被分為2個(gè)亞型(BⅢ和BⅣ)[21-22],然而在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析中并沒(méi)有獲得足夠支持,且有其他亞型存在[9,31-32]。

2 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)概述

針對(duì)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的分子流行病學(xué)研究主要是利用巢式PCR擴(kuò)增和序列分析技術(shù)[20],可以鑒別賈第蟲(chóng)不同物種及同物種的不同基因型或亞型,對(duì)于賈第蟲(chóng)基因型(集聚體)分析常用的靶點(diǎn)基因包括SSUrRNA、bg、gdh和tpi等[20,33]。其中,SSUrRNA基因最為保守,主要用于檢測(cè)其感染情況;bg、tpi和gdh基因主要用于集聚體或亞型鑒定[13]。PCR檢測(cè)具有特異性強(qiáng)和敏感性高的特點(diǎn),但不同集聚體混合感染同一宿主或集聚體遺傳差異較小時(shí),難以依靠單一分子位點(diǎn)對(duì)十二指腸賈第蟲(chóng)分離株進(jìn)行準(zhǔn)確分型鑒定與區(qū)分混合感染情況,因此需要進(jìn)行多位點(diǎn)基因分型技術(shù)進(jìn)行基因型的鑒定。

目前,在世界范圍內(nèi),關(guān)于兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查研究較少。除中國(guó)外,只有尼日利亞、厄瓜多爾、澳大利亞和歐洲的部分國(guó)家報(bào)道了兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的感染情況。其中,尼日利亞的兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率最高,可達(dá)72.3%[8];其次是厄瓜多爾為20.0%[34];歐洲多個(gè)國(guó)家的平均感染率為7.6%[35];俄羅斯和澳大利亞的感染率分別為1.8%[36]和1.0%[37]。這表明兔源十二指腸賈第蟲(chóng)在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害動(dòng)物健康和威脅公共衛(wèi)生安全。

3 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)流行病學(xué)分析

3.1 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)分子流行情況

截至2022年6月,中國(guó)共有9個(gè)省、自治區(qū)、直轄市報(bào)道了兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的分子感染流行情況(表1),感染率為1.5%～18.7%,總體平均感染率為9.5%(412/4 324)。不同地區(qū)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的平均感染情況存在差異,其中,吉林地區(qū)感染率最高,為18.4%(81/438);黑龍江、山東、甘肅、河南、上海、陜西、新疆地區(qū)感染率分別為16.1%(95/590)、11.2%(69/616)、8.6%(51/592)、8.4%(80/955)、6.5%(9/139)、3.5%(19/537)和1.9%(6/321);遼寧地區(qū)感染率最低,為1.5%(2/136)。不同地區(qū)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)感染率不同,可能是采樣的動(dòng)物品種、飼養(yǎng)條件和免疫狀態(tài)等條件不同所致,但是總體感染率較高,應(yīng)該引起足夠的重視。

表1 中國(guó)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)流行和集聚體分布情況

3.2 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)感染風(fēng)險(xiǎn)因素分析

家兔是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。據(jù)統(tǒng)計(jì)不同的年齡、品種、經(jīng)濟(jì)用途和飼養(yǎng)地點(diǎn)的家兔中十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率各異。對(duì)于家兔不同的年齡組,雖然十二指腸賈第蟲(chóng)感染率差異不顯著(χ2=0.42,P>0.05),然而年齡≥6月齡家兔十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率(7.8%,132/1 695)要略高于年齡<6月齡的感染率(7.2%,149/2 077)[13,15,39,41-45]。

家兔品種繁多,包括獺兔、伊拉兔、長(zhǎng)毛兔、蒙古兔、新西蘭白兔等。不同品種間兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率差異顯著(χ2=127.23,P<0.001),以蒙古兔的感染率較高,為23.1%(51/221)[41];伊普呂兔的感染率次之,感染率為13.1%(13/99)[44];新西蘭白兔、伊拉兔和獺兔的感染率分別為7.2%(15/207)[41]、6.2%(52/836)[43-44]和5.1%(43/839)[13,15,43-45];長(zhǎng)毛兔的感染率較低,為1.1%(4/377)[41,45];伊樂(lè)高兔和比利時(shí)兔未檢測(cè)到十二指腸賈第蟲(chóng)的感染[44]。

家兔根據(jù)不同經(jīng)濟(jì)用途可以分為肉用兔、皮用兔、毛用兔、寵物兔、試驗(yàn)兔和皮肉兼用兔。以不同經(jīng)濟(jì)用途進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)十二指腸賈第蟲(chóng)感染時(shí)發(fā)現(xiàn),不同用途之間兔源十二指腸賈第蟲(chóng)感染差異顯著(χ2=109.07,P<0.001)。其中,皮肉兼用兔的感染率最高,為23.1%(51/221)[41];肉用兔和試驗(yàn)兔的感染率次之,分別為7.9%(125/1 588)[41.43-44]和7.2%(37/517)[14,42];皮用兔感染率為5.1%(43/839)[13,39,43-44];毛用兔的感染率最低,為1.1%(4/377)[13,42,45]。

家兔的飼養(yǎng)地點(diǎn)一般分為室內(nèi)飼養(yǎng)和室外飼養(yǎng)。當(dāng)比較不同飼養(yǎng)地點(diǎn)對(duì)家兔感染十二指腸賈第蟲(chóng)的影響時(shí),共統(tǒng)計(jì)1 042份家兔糞便樣品,戶外飼養(yǎng)的家兔十二指腸賈第蟲(chóng)的感染率為19.2%(76/396),室內(nèi)的感染率為5.4%(35/646)[39,41],不同飼養(yǎng)地點(diǎn)家兔感染十二指腸賈第蟲(chóng)差異顯著(χ2=47.51,P<0.01)。以上不同類型(年齡、品種、用途、飼養(yǎng)地點(diǎn))所導(dǎo)致的家兔十二指腸賈第蟲(chóng)感染率的差異,可能是不同的宿主抵抗能力、飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和生態(tài)因素等共同因素導(dǎo)致[39]。

3.3 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)基因型分布

目前,在中國(guó)家兔中共檢測(cè)到3種十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體,分別為集聚體A、B和E[8,13,37,41]。山東、甘肅和河南地區(qū)的家兔中還檢測(cè)到了十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體B/E和集聚體A/E的混合感染。十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A、B和E均具有潛在的人獸共患性,集聚體B在中國(guó)為優(yōu)勢(shì)集聚體,占總檢測(cè)數(shù)量的55.1%(201/365);其次為集聚體E,所占比例31.6%(115/365);集聚體A的感染相對(duì)較低,所占比例10.7%(39/365);混合感染所占比例2.7%(10/365)。

不同地區(qū)兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的集聚體分布存在顯著差異,在現(xiàn)有的研究報(bào)道中,均檢測(cè)到集聚體B的感染,而且大部分地區(qū)報(bào)道是以集聚體B為優(yōu)勢(shì)亞型(表1)。然而,山東[41]和甘肅[44]地區(qū)以集聚體E為優(yōu)勢(shì)基因型,吉林地區(qū)以集聚體A為優(yōu)勢(shì)基因型[40]。這種集聚體基因型分布的差異可能與家兔飼養(yǎng)環(huán)境、種群密度、營(yíng)養(yǎng)狀況和生態(tài)環(huán)境等因素有關(guān)。

對(duì)于兔源十二指腸賈第蟲(chóng)進(jìn)行了集聚體亞型分析發(fā)現(xiàn),集聚體A亞型AⅠ在吉林地區(qū)的家兔中被鑒定[40];十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體B亞型BⅣ廣泛分布于河南[13]和新疆[15]。在黑龍江地區(qū),兔源十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體B亞型具有多樣性,可以分為不同的亞型[14,38]。這種不同亞型的鑒定結(jié)果,主要是集聚體B相對(duì)于其他集聚體具有較強(qiáng)的遺傳多樣性所致。

3.4 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育分析

為探討兔源十二指腸賈第蟲(chóng)集與其他宿主源(人、牛、羊、豬、犬、貓、鼠等)分離株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系,并更直觀地闡明,本綜述利用已有數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)制作系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)Clustal X 2.0軟件將GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體數(shù)據(jù)[46],基于鄰接法(Neighbor-Joining)使用MEGA X軟件,選擇Kimura 2-parameter模型,使用bootstrap檢驗(yàn),進(jìn)行1 000次重復(fù)計(jì)算,分別構(gòu)建出基于tpi(圖1)、gdh(圖2)、bg(圖3)基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)?；谑改c賈第蟲(chóng)不同基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析表明,兔源十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A、B和E分離株與其他宿主源的集聚體分離株分別聚集在同一進(jìn)化分枝,并表現(xiàn)良好的自舉值。這與KUMAR等[47]研究結(jié)果一致。

三角形代表兔源分離株。下同。

圖2 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體gdh基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖3 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體bg基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

3.5 兔源十二指腸賈第蟲(chóng)基因組特征分析

第二代和第三代全基因組測(cè)序技術(shù)的提高和完善為十二指腸賈第蟲(chóng)基因組的全基因組測(cè)序提供了技術(shù)與支持。目前,已經(jīng)獲得人源和部分動(dòng)物源十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體A、B、C、D和E分離株的全基因組序列[48-50],基因組大小為10.7～12.8 Mb,特別是對(duì)于集聚體A分離株的測(cè)序和組裝基因組序列質(zhì)量還在持續(xù)不斷優(yōu)化[51]。然而,對(duì)于兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的基因組的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此,關(guān)于兔源十二指腸賈第蟲(chóng)基因組特征的研究,特別是家兔優(yōu)勢(shì)集聚體B的基因組特征,以及與其他動(dòng)物源集聚體之間的比較基因組學(xué)將是今后的研究方向之一。

4 存在問(wèn)題與展望

對(duì)十二指腸賈第蟲(chóng)的研究對(duì)于防控工作具有重大的公共衛(wèi)生意義[52]。中國(guó)已經(jīng)有9個(gè)省、自治區(qū)、直轄市報(bào)道了兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的分子流行情況,其總體平均感染率為9.5%。在家兔中共檢測(cè)到3種十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體,分別為集聚體A、B和E,均具有潛在的人獸共患性,集聚體B在中國(guó)家兔中為優(yōu)勢(shì)基因型。家兔是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,中國(guó)是世界上最大的兔肉生產(chǎn)國(guó),同時(shí)家兔也是人獸共患病原的重要傳播來(lái)源,其攜帶的人獸共患病原體具有通過(guò)食物或飲水進(jìn)行共患傳播的可能性。因此,關(guān)于兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的感染和流行情況的調(diào)查研究應(yīng)該引起足夠的重視。兔源十二指腸賈第蟲(chóng)的感染是以集聚體B為主,表現(xiàn)出明顯的宿主適應(yīng)性特征。此外,十二指腸賈第蟲(chóng)集聚體B也是人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和馬屬動(dòng)物等宿主感染的優(yōu)勢(shì)基因型[1],同樣對(duì)這些宿主表現(xiàn)出宿主適應(yīng)性特征。因此,這些宿主適應(yīng)性的分子機(jī)制值得深入研究,也是今后關(guān)于十二指腸賈第蟲(chóng)的重要研究方向之一。同時(shí),對(duì)于十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體基因組特征,以及比較基因組學(xué)將有助于進(jìn)一步解析賈第蟲(chóng)在分類學(xué)、遺傳進(jìn)化方面等的研究,并最終對(duì)賈第蟲(chóng)病傳播動(dòng)力學(xué)和防控措施的制定起到積極作用。

另一方面,十二指腸賈第蟲(chóng)宿主范圍廣泛,可感染多種類型的野生動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等。家養(yǎng)反芻動(dòng)物是十二指腸賈第蟲(chóng)重要的保蟲(chóng)宿主,嚙齒動(dòng)物在十二指腸賈第蟲(chóng)的跨物種傳播過(guò)程中可能起到重要作用[53]。然而,這些均需要更多的調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)和驗(yàn)證。十二指腸賈第蟲(chóng)鑒定的8個(gè)集聚體(A～H)中,其宿主范圍和遺傳特征均存在顯著的差異性。鑒于此,有多位學(xué)者提議將十二指腸賈第蟲(chóng)不同的集聚體及亞型分別命名為不同的賈第蟲(chóng)種類,以充分體現(xiàn)其宿主范圍和遺傳特征[54]。該提議還需要更多的響應(yīng)和認(rèn)可,但這表明對(duì)于十二指腸賈第蟲(chóng)分類地位和遺傳進(jìn)化的研究仍是今后重要的研究方向。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和提高,基于基因組學(xué)和比較基因組學(xué)研究十二指腸賈第蟲(chóng)不同集聚體之間的基因組序列特征,將推動(dòng)賈第蟲(chóng)在分類和遺傳進(jìn)化等方面的研究進(jìn)展,并最終對(duì)賈第蟲(chóng)病傳播動(dòng)力學(xué)和防控措施的制定起到積極作用。