祛風消癜合劑UHPLC指紋圖譜的建立

凌 霄 張 輝 李偉霞牛 璐唐進法*任獻青

（1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，中藥臨床評價技術(shù)河南省工程實驗室，河南鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學，呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450006；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科，河南鄭州 450000）

過敏性紫癜常見于兒童,相當一部分患兒由于其反復發(fā)作而引起腎臟病變等其他嚴重并發(fā)癥［1-2］,故研發(fā)合適的藥物以降低該疾病發(fā)病率、預防重要器官損傷是亟需解決的問題。研究表明,風熱傷絡證是過敏性紫癜常見證型［3］,針對其特征,河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科專家根據(jù)長期臨床經(jīng)驗總結(jié)研制了祛風消癜方,由忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草組成,方中忍冬藤善于清熱疏風通絡,荊芥長于透疹止血,共為君藥；防風祛風止癢,海風藤深入經(jīng)絡,祛除風邪,共為臣藥；配以徐長卿祛風止癢,丹參祛瘀生新、涼血活血,茜草涼血止血、化瘀通經(jīng),共為佐藥；甘草瀉火解毒、調(diào)和諸藥,為使藥,諸藥相伍,用于過敏性紫癜辨證屬風熱傷絡者,其療效顯著,不良反應小［4-5］。祛風消癜合劑是在祛風消癜方基礎上開發(fā)的院內(nèi)制劑,本實驗建立其UHPLC指紋圖譜,以期為全面評價和控制其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

XS105型電子天平 （十萬分之一,瑞士Mettler-Toledo公司）；UHPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng),配置ACQUITY-UHPLC型高效液相色譜儀、電噴霧離子源XEVO-G2XSQTOF飛行時間質(zhì)譜、Acquity UHPLC H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

馬錢苷 （純度＞98%,批號R23D7F27552）、5-O-甲基維斯阿米醇苷 （純度＞98%,批號P05M8F35478）、原兒茶醛 （純度＞98%,批號P05M7F14533）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；新綠原酸 （純度 ＞ 98%,批號lw190124015）對照品購于南京良緯科技有限公司；甘草苷（純度＞98%,批號PRF8110742）對照品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；綠原酸（純度96.8%,批號110753-201817）、槲皮苷（純度90.6%,批號111538-201606）、橙皮苷 （純度96.2%,批號110721-201818）、丹酚酸B （純度96.6%,批號111562-201917）、丹皮酚 （純度99.8%,批號110708-201908）、甘草酸銨 （純度97.7%,批號110731-201720）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

祛風消癜合劑共12批,均由醫(yī)院制劑室制備（批號分 別為 20181124、20181127、20181201、20190311、20190315、20190328、20191118、20191215、20200121、20200206、20200208、20200301）,編號S1～S12。忍冬藤（批號1809080172）購于湖北天濟中藥飲片有限公司；荊芥（批號1805282）、防風（批號1807171）、徐長卿 （批號1804112）、海風藤（批號1805192）、丹參（批號1807231）均購于安徽普仁中藥飲片有限公司；茜草（批號180916）、炙甘草（批號180916）均購于安徽人民中藥飲片有限公司,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥檢室施鈞瀚副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色譜柱 （2.1 mm×100 mm,1.7 μm）；流動相0.2%磷酸（A）-乙腈（B）,梯度洗脫（0～5 min,5%B；5～30 min,5%～22%B；30～45 min,22%～95%B；45～47 min,95% B；48～50 min,95%～5%B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長236 nm；進樣量1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）,正、負離子掃描模式；毛細管電壓2 500 V；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度250 ℃,體積流量600 L/h；離子源溫度100 ℃,錐孔氣體積流量50 L/h；亮氨酸-腦啡肽（正離子模式m/z556.277 1,負離子模式m/z554.261 5）溶液在線校正,掃描質(zhì)量100～1000 Da,全掃描模式。采用Waters UNIFI軟件對采集數(shù)據(jù)進行處理。

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 取馬錢苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、原兒茶醛、新綠原酸、甘草苷、綠原酸、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸銨對照品各約1 mg,精密稱定,甲醇制成1 mg/mL貯備液,再進一步稀釋至0.05 mg/mL,即得。

2.3.2 供試品溶液 精密吸取12批樣品,每批2 mL,甲醇定容至10 mL量瓶中,超聲提取20 min,各吸取10 mL至離心管中,150 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按照處方比例及工藝流程,制備缺忍冬藤、缺荊芥、缺防風、缺徐長卿、缺茜草、缺海風藤、缺丹參、缺炙甘草的陰性樣品,按“2.3.2” 項下方法制備,即得。

2.3.4 單味藥材溶液 按照處方比例,稱取忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草8種單味藥材,按“2.3.2” 項下方法制備,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一份供試品溶液（S4）,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.17%～2.86%,相對保留時間RSD為0.03%～0.82%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液（S4）,分別于0、3、6、12、18、24 h,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.02%～2.92%,相對保留時間RSD為0.03%～1.11%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取合劑（S4）6份,按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,以14號峰（升麻素苷）為對照,測得各共有峰相對峰面積RSD為1.19%～2.82%,相對保留時間RSD為0.04%～1.52%,表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜建立 取12批樣品,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,將所得圖譜以CDF格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）進行分析,自動多點匹配法生成對照圖譜,計算相似度,結(jié)果見圖1、表1。由此可知,各批樣品相似度均大于0.97；有24個共有峰,分離度均大于1.5,其中14號峰（升麻素苷）峰面積較高,出峰時間穩(wěn)定適中,分離度良好,故選擇其作為對照峰。各共有峰相對保留時間RSD為0.05%～1.15%,總體上較穩(wěn)定；相對峰面積RSD為3.83%～29.62%,上下浮動較大,表明個別成分在不同批次樣品中的含有量有較大差異。

圖1 12批樣品UHPLC指紋圖譜Fig.1 UHPLC fingerprints for twelve batches of samples

表1 12批樣品相似度Tab.1 Similarities of twelve batches of samples

2.6 共有峰指認和歸屬 將對照品、供試品溶液色譜圖疊加,比對兩者保留時間,指認出4、5、8、10、14、15、17、18、19、22、23、24號峰分別為新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、馬錢苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲維阿斯米醇苷、槲皮苷、橙皮苷、丹酚酸B、丹皮酚、甘草酸,見圖2。

對其余未指認出的共有峰,在分離后不經(jīng)檢測器而直接接取其出峰時間前0.5 min至出峰時間后0.5 min的洗脫液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定10次,于氮氣流下吹干,殘留物用200 μL甲醇復溶,渦流2 min,15 000 r/min離心10 min,上清液采用UHPLC-TOF-MS法進行分析,通過Waters UNIFI軟件對所采集數(shù)據(jù)進行處理,將碎片離子信息與對照品圖譜和相關(guān)文獻作比對,其裂解規(guī)律見圖3,鑒定結(jié)果見表2。

圖2 各成分UHPLC色譜圖（Ⅰ）Fig.2 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅰ）

圖3 各成分質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.3 MS fragmentation patterns for various constituents

表2 未知共有峰鑒定結(jié)果Tab.2 Results of unknown common peak identification

由此可知,3號峰一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z179.034 8 ［M-H］-,苯環(huán)上鄰二酚羥基脫水后生成碎片離子m/z161,再脫羧失去CO2,生成碎片離子m/z135,與對照品和文獻［6-7］比對后推測其為咖啡酸；11號峰一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z403.124 5 ［M-H］-,脫去一分子葡萄糖后生成碎片離子m/z223,再脫去一分子CO2和乙酰氧基,生成碎片離子m/z121,與對照品和文獻［8］比對后推測其為斷氧化馬錢苷；21號峰一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z461.072 9 ［M-H］-,從苷鍵處脫去一分子葡萄糖醛酸,生成碎片離子m/z285,與對照品和文獻［9］比對后推測其為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；20號峰一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z359.076 9 ［M-H］-,酰氧鍵斷裂,生成碎片離子m/z179,苯環(huán)上鄰二酚羥基脫水,生成碎片離子m/z161,與對照品和文獻［10］比對后推測其為迷迭香酸；7號峰一級質(zhì)譜準分子離子峰為m/z477.081 2 ［M-H］-,脫去一分子糖苷,生成碎片離子m/z315,與對照品和文獻［11］比對后推測其為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

將單味藥材、陰性樣品溶液色譜圖進行比對,發(fā)現(xiàn)各藥材色譜峰均與合劑共有峰對應,表明單味藥材與合劑化學信息的相關(guān)性良好。其中,1、3、4、6、9、10、11、13號峰歸屬于忍冬藤,12號峰歸屬于海風藤,14、17號峰歸屬于防風,15、24號峰歸屬于炙甘草,19號峰歸屬于荊芥,21、22號峰歸屬于丹參,23號峰歸屬于徐長卿；2號峰為荊芥、丹參、防風共有,18號峰為丹參、忍冬藤共有,5號峰為荊芥、忍冬藤、丹參共有,20號峰為荊芥、丹參共有,7號為忍冬藤、茜草共有,8號為忍冬藤、荊芥共有,16號峰為防風、炙甘草共有。色譜圖見圖4。

圖4 各成分UHPLC色譜圖（Ⅱ）Fig.4 UHPLC chromatograms of various constituents （Ⅱ）

2.7 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）采用PLS-DA對24個共有峰的相對峰面積進行判別分析,得分圖 ［R2X（cum）=0.87,Q2（cum）=0.964］見圖5,可知12批樣品可按生產(chǎn)年份聚為3類,即2018年產(chǎn)（S1～S3）、2019年產(chǎn)（S4～S8）、2020年產(chǎn)（S9～S12）；載荷圖見圖6,可知11、16、7、6、1、22、4、15、8、13、19、18、21號峰的圓形距離原點較遠,表明這些成分對分組貢獻較大；VIP見圖7,可知大于1的有10種,分別為5號峰（原兒茶醛）、2號峰、18號峰（槲皮苷）、21號峰（木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、19號峰（橙皮苷）、15號峰（甘草苷）、22號峰（丹酚酸B）、13號峰、4號峰（新綠原酸）、1號峰,但其相對峰面積均在2018年產(chǎn)樣品中最低,而18、21、19、15、13號峰在2019年產(chǎn)樣品中最高,5、2、22、4號峰在2020年產(chǎn)樣品中最高。綜上所述,造成不同年份樣品質(zhì)量差異的主要成分為槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新綠原酸、13號峰、1號峰。

圖5 12批樣品PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot for twelve batches of samples

3 討論

圖6 12批樣品PLS-DA載荷圖Fig.6 PLS-DA loading plot for twelve batches of samples

圖7 共有峰相對峰面積VIP圖Fig.7 VIP diagram for relative peak areas of common peaks

本實驗對色譜條件進行了考察,發(fā)現(xiàn)Waters ACQUITY UHPLC CSH C18色譜柱 （2.1 mm ×100 mm,1.7 μm）分離效果最好；乙腈-0.2% 磷酸洗脫時各成分色譜峰分離度較好,出峰時間適中；不同柱溫（25、30、35 ℃）差別不大；體積流量0.3 mL/min時洗脫效果最好；采用DAD檢測器在190～400 nm波長處進行掃描,發(fā)現(xiàn)236 nm處色譜峰數(shù)量最多,峰高度合適,故選擇其作為檢測波長。再對供試品溶液制備方法進行了考察,發(fā)現(xiàn)超聲提取效果明顯優(yōu)于冷浸,而且15 mL甲醇提取20 min時,只需1次各成分即已基本提取完全。

本實驗建立了祛風消癜合劑UHPLC指紋圖譜,確定了24個共有峰的藥材來源歸屬和其中17個的化學成分歸屬,但海風藤、茜草信號較弱,專屬峰較少,將在今后研究中加以改進。PLS-DA顯示,不同年份樣品在整體質(zhì)量上存在一定差異,原兒茶醛、槲皮苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、橙皮苷、甘草苷、丹酚酸B、新綠原酸可作為差異標志物,其中原兒茶醛、新綠原酸、丹酚酸B相對峰面積隨著貯藏時間延長逐漸降低。新綠原酸、原兒茶醛是君藥忍冬藤標志性成分,具有較好的抗氧化、抗炎作用,但其結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚等不穩(wěn)定部分［12-13］；丹酚酸B具有較強的抗氧化、清除自由基作用,是臣藥丹參重要功效成分,但其性質(zhì)也不穩(wěn)定［14-15］,這些化合物含有量差異可能是造成不同年份樣品質(zhì)量存在差異的主要原因之一,提示祛風消癜合劑在貯藏過程中需要關(guān)注成分的穩(wěn)定性。因此,建議對祛風消癜合劑進行品質(zhì)評價時應增加新綠原酸、原兒茶醛、丹酚酸B等穩(wěn)定性較差成分的含有量測定,以期最大程度保證該制劑質(zhì)量。