低能量激光對(duì)大鼠牙移動(dòng)后保持過(guò)程中破骨細(xì)胞和膠原纖維改建的影響

苗倩， 彭朋, 董曉曦, 馬遙, 張錫忠,

1. 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津（300071）； 2. 天津市口腔醫(yī)院正畸科，天津（300041）； 3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所激光醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津（300192）

正畸治療結(jié)束后，被移動(dòng)的牙齒具有即刻回到最初位置的趨勢(shì)，即復(fù)發(fā)的趨勢(shì)。這一現(xiàn)象被認(rèn)為與牙周組織的改建密切相關(guān)。如何在正畸治療結(jié)束后促進(jìn)牙周組織改建，縮短保持期，減少錯(cuò)畸形的復(fù)發(fā)是研究熱點(diǎn)。低能量激光（low level laser，LLL）具有良好的生物學(xué)作用，包括光生物促進(jìn)作用、光生物學(xué)調(diào)節(jié)功能等。既往研究顯示，LLL 能夠增強(qiáng)細(xì)胞代謝，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及成骨分化［1?2］。LLL 促進(jìn)正畸牙移動(dòng)的報(bào)道較多，而對(duì)正畸牙保持的研究甚少，基于LLL 的生物促進(jìn)作用，本項(xiàng)研究將探討LLL 對(duì)大鼠牙移動(dòng)后保持過(guò)程中膠原纖維和破骨細(xì)胞的影響，為后續(xù)臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)選取8 周齡雄性健康Wistar 大鼠20 只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016?0006，體重210～300g，均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所（天津）提供，常規(guī)飲食，普通喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津市醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

直徑0.2 mm、0.25 mm 結(jié)扎絲（天天齒科，中國(guó)）、鎳鈦拉簧（有研億金，中國(guó)）、測(cè)力計(jì)、京津化學(xué)固化粘結(jié)劑（天津市合成材料工業(yè)研究所）、注射器、棉線、鼠板、膠布、一次性器械盤(pán)、天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。808 nm 波長(zhǎng)激光器［（國(guó)醫(yī)華科（天津）醫(yī)療科技集團(tuán)有限公司）］、病理切片機(jī)（RM2235，LEICA，德國(guó)）、光學(xué)顯微鏡（Nikon，日本）。水合氯醛（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、EDTA 脫鈣液、TRAP 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、Masson 試劑等。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠第一磨牙近中移動(dòng)模型 20 只8周齡雄性Wistar 大鼠，隨機(jī)分為4 組：基線組5 只，對(duì)照組5 只，保持組5 只，保持+激光組5 只?；€組不施加正畸力，作為空白對(duì)照，另外3 組共15 只大鼠建立大鼠第一磨牙近中移動(dòng)模型：10%水合氯醛麻醉下仰臥于鼠板上。用直徑0.2 mm 結(jié)扎絲結(jié)扎上頜第一磨牙后，與鎳鈦螺旋拉簧一端結(jié)扎，直徑0.25 mm 結(jié)扎絲穿過(guò)鎳鈦螺旋拉簧另一端并結(jié)扎至切牙牙頸部，粘接劑覆蓋其表面增強(qiáng)固位。測(cè)力計(jì)下50 g 力牽拉上頜第一磨牙近中移動(dòng)（圖1）。主動(dòng)加力時(shí)間為3 周，每周主動(dòng)加力1 次，期間檢查所有樣本的力值是否維持穩(wěn)定，若發(fā)現(xiàn)口內(nèi)裝置脫落，重新安裝加力裝置。

Figure 1 Establishment of mesial movement model of rat first molar圖1 建立大鼠第一磨牙近中移動(dòng)模型

1.2.2 加力結(jié)束后保持和激光照射 加力結(jié)束后拆除口內(nèi)裝置，進(jìn)行以下操作。①對(duì)照組：加力結(jié)束即刻拆除口內(nèi)裝置后，不采用任何保持措施。②保持組：加力結(jié)束拆除口內(nèi)裝置后，結(jié)扎絲擰成麻花狀作為固定保持器，維持大鼠第一磨牙與切牙之間的距離，定期檢查保持裝置是否脫落，如發(fā)現(xiàn)脫落，應(yīng)及時(shí)安裝。③保持+激光組（retention and LLL，RL group）：加力結(jié)束拆除口內(nèi)裝置后，結(jié)扎絲擰成麻花狀作為固定保持器，并在去除加力裝置后的第0 天、第3 天、第6 天、第9 天、第12 天應(yīng)用中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所提供的二極管激光器進(jìn)行照射，照射波長(zhǎng)808 nm，輸出功率100 mW。兼顧生物安全性和穿透能力兩個(gè)方面，確定照射光斑直徑2 mm，照射光斑面積合約0.03 cm2。照射部位為第一磨牙頰側(cè)、腭側(cè)牙齦約平牙根中部高度兩個(gè)位點(diǎn)。照射時(shí)間為每個(gè)位點(diǎn)7 s，劑量23 J/cm2，符合以往文獻(xiàn)［3］中20～25 J/cm2的劑量范圍。

以上所有樣本在去除加力裝置后的第14 天全部處死，并立即對(duì)第一磨牙牙周組織進(jìn)行取材。

1.2.3 樣本切片與染色 處死大鼠后，采集第一磨牙所在的牙槽骨骨塊樣本，4%多聚甲醛固定24～48 h，10%EDTA 脫鈣3 個(gè)月，脫水，透明，常規(guī)浸蠟包埋。以第一磨牙近遠(yuǎn)中方向?yàn)闄M切面，5 μm 厚度進(jìn)行切片，切片內(nèi)需同時(shí)包含牙根及牙根周?chē)啦酃?。常?guī)脫蠟、水合，HE 染色、TRAP 染色、Masson 染色。HE 染色切片觀察破骨樣細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)。TRAP 染色切片觀察破骨細(xì)胞活躍度。Masson 染色切片觀察膠原纖維的沉積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Image Pro Plus6.0 軟件半定量分析膠原纖維面積及破骨細(xì)胞數(shù)，將分析結(jié)果導(dǎo)入Graph Pad Prism5 軟件，生成柱狀圖。膠原纖維面積及破骨細(xì)胞數(shù)在各組間的差異采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色結(jié)果

基線組牙根遠(yuǎn)中側(cè)未見(jiàn)明顯破骨樣細(xì)胞，牙周膜內(nèi)未見(jiàn)明顯異常；對(duì)照組局部區(qū)域牙周膜內(nèi)炎癥，偶見(jiàn)玻璃樣變，牙根遠(yuǎn)中側(cè)可見(jiàn)明顯破骨樣細(xì)胞；保持組未見(jiàn)明顯牙周膜炎癥及玻璃樣變，牙根遠(yuǎn)中側(cè)偶見(jiàn)破骨樣細(xì)胞；保持+激光組幾乎無(wú)破骨樣細(xì)胞，牙周膜內(nèi)無(wú)局部炎癥反應(yīng)及玻璃樣變（圖2）。

Figure 2 HE staining images of 4 groups × 100圖2 4 組HE 染色觀察照片 × 100

2.2 Masson 染色結(jié)果

基線組牙根兩側(cè)可見(jiàn)膠原纖維沉積，對(duì)照組牙根兩側(cè)未見(jiàn)明顯膠原纖維沉積，保持組牙根兩側(cè)膠原沉積較明顯；與以上三組相比，保持+激光組膠原沉積更為明顯（圖3）。

2.3 TRAP 染色結(jié)果

基線組牙根遠(yuǎn)中側(cè)未見(jiàn)明顯破骨細(xì)胞活動(dòng)，對(duì)照組遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞活動(dòng)活躍；保持組牙根遠(yuǎn)中側(cè)偶見(jiàn)破骨細(xì)胞活動(dòng)，但不如對(duì)照組活躍；保 持+激光組牙根遠(yuǎn)中側(cè)未見(jiàn)破骨細(xì)胞活動(dòng)（圖4）。

3 討 論

工程、科技、醫(yī)學(xué)界把低功率密度或低能量輻射波長(zhǎng)500～1 100 nm、輸出功率10～90 mW、能量密度為1～20 J/cm2的激光稱(chēng)之為低能量激光［2］。低能量激光的最大特點(diǎn)是良好的穿透性和生物安全性，直接照射生物組織時(shí)，不僅不會(huì)使生物組織產(chǎn)生不可逆損傷［4?6］，而且能減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)傷口愈合、加速正畸牙移動(dòng)、促進(jìn)血液微循環(huán)等。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低能量激光具有促進(jìn)成骨分化的作用［7］。Franzen 等［3］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，照射低能量激光可以加快牙齒移動(dòng)的速度，促進(jìn)骨折區(qū)新骨形成，從而加速骨折愈合。另外還有研究結(jié)果表明，激光治療可通過(guò)加速新骨沉積以及活化成骨因子如RUNX?2 和骨形成蛋白?9（bone morpho?genetic protein?9，BMP?9）等方式來(lái)促進(jìn)骨愈合［8］。

Trelles 等［9］報(bào)道，低能量激光可能通過(guò)刺激張力側(cè)成骨細(xì)胞和壓力側(cè)破骨細(xì)胞的增殖分化來(lái)加速牙槽骨改建的過(guò)程，從而縮短了正畸治療的時(shí)間。史瑞新等［10］發(fā)現(xiàn)，在正畸牙齒的壓力側(cè)，照射低能量激光可降低由壓力引起的成骨細(xì)胞活性增加，減少成骨活動(dòng)、而破骨活動(dòng)相對(duì)增加，從而促進(jìn)了牙齒的快速移動(dòng)。

Lee 等［11］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激光照射組牙周膜中BMP?2、MMP?9 基因表達(dá)水平顯著增加，提示激光照射的確加速了牙周纖維的沉積。牙齒移動(dòng)時(shí)，在基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?1 的反向調(diào)控下，牙周膜成纖維細(xì)胞分泌MMPs，明膠酶亞組MMP?2、MMP?9 能夠清除分解后的膠原片段和正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中出現(xiàn)的透明樣變性區(qū)域。MMPs 轉(zhuǎn)錄和翻譯的活性均可作為牙周纖維改建的生物學(xué)標(biāo)志。與此同時(shí)，在張力側(cè)有明顯的I 型膠原生成，形成新生牙周纖維的主體，從而加速了牙周組織的改建。

本研究中，保持+激光組表現(xiàn)為牙根兩側(cè)有更多的膠原纖維沉積，遠(yuǎn)中側(cè)未見(jiàn)破骨細(xì)胞，表明低能量激光在保持階段促進(jìn)了牙周纖維的改建，一定程度上抑制了破骨活動(dòng)，即加力結(jié)束后使用固定保持器同時(shí)進(jìn)行低能量激光照射，可以促進(jìn)大鼠第一磨牙膠原纖維沉積、抑制牙齒復(fù)發(fā)，更好地維持牙齒位置穩(wěn)定。

本研究結(jié)果顯示，正畸牙齒保持過(guò)程中，固定保持同時(shí)進(jìn)行激光照射可促進(jìn)膠原纖維的沉積、抑制破骨活動(dòng)，有助于更高效地使牙齒達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，減少正畸復(fù)發(fā)，縮短保持期。