紅細(xì)胞微粒及其生物學(xué)性質(zhì)的研究進(jìn)展

朱躍躍 卞茂紅

微粒（microparticles，M P s）又名微囊泡 （microvesicles）或核外顆粒體（ectosomes），是由不同類型的細(xì)胞例如血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞甚至腫瘤細(xì)胞等釋放的一種直徑在0.1～1 μm之間的漿膜囊泡[1]。研究表明各種細(xì)胞衍生的MPs在大小、磷脂成分、表面抗原和蛋白組成方面有很大不同，但同時(shí)也保留了來(lái)自親代細(xì)胞蛋白質(zhì)的子集和以便識(shí)別它們起源的表面受體[2]。在健康人體中循環(huán)MPs大部分來(lái)自血小板和/或巨核細(xì)胞[3,4]。MPs的釋放是由各種刺激引起的調(diào)控過(guò)程，包括活化、凋亡、剪切應(yīng)力、補(bǔ)體攻擊或損傷等[5]。在各種病理狀態(tài)如血栓形成、心血管疾病中，血漿MPs濃度會(huì)顯著增加。

1 紅細(xì)胞微粒（red blood cell microparticles, RMPs） 盡管紅細(xì)胞輸注是臨床上常用的輔助治療手段之一，但也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。在過(guò)去10年里，越來(lái)越多的證據(jù)表明，輸注儲(chǔ)存的紅細(xì)胞可能引起感染、輸血相關(guān)性急性肺損傷（TRALI）、多器官功能衰竭和死亡等輸血相關(guān)副反應(yīng)。研究提示紅細(xì)胞的免疫功能會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而降低，從而影響臨床輸血的安全性[6]，其釋放的RMPs也與輸血不良反應(yīng)有較高相關(guān)性[7]。但也有證據(jù)表明輸注的紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)短與輸血后不良反應(yīng)沒(méi)有直接關(guān)系[8]。這種爭(zhēng)議可能部分是由“短期儲(chǔ)存”的定義引起的。有數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)紅細(xì)胞促凝活性的顯著變化發(fā)生在存儲(chǔ)的第5天[9]。而最近的兩篇報(bào)道，Lacroix等人[10]和Steiner等人[11]對(duì)短期儲(chǔ)存的定義分別為6天和7天。

1.1 RMPs的來(lái)源：RMPs的主要特點(diǎn)與來(lái)自其他細(xì)胞的MPs有相似之處，但RMPs的大小更均勻，平均直徑0.15 μm左右，并常伴有更小的囊泡體，稱為納米囊泡[12]。分析全血分離獲取的血液成分，結(jié)果表明RMPs約占富含血小板血漿中總MPs的4%～8%[13]。RMPs是在多種病理?xiàng)l件如炎癥反應(yīng)、缺氧等各種刺激因素作用下紅細(xì)胞激活或者程序性細(xì)胞死亡時(shí)的產(chǎn)物。RMPs的形成和釋放貫穿于紅細(xì)胞的整個(gè)老化過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)紅細(xì)胞產(chǎn)生RMPs的因素有血流切應(yīng)力、補(bǔ)體蛋白C5b-9、氧化產(chǎn)物或者程序性細(xì)胞死亡前的刺激[5]等。RMPs的具體形成機(jī)制尚未闡明，目前比較受認(rèn)可的RMPs形成模型主要有二種：紅細(xì)胞程序性死亡模型和帶3蛋白聚簇模型。前者將有核細(xì)胞對(duì)各種應(yīng)力發(fā)生類似細(xì)胞凋亡機(jī)制應(yīng)用于紅細(xì)胞。因?yàn)橛泻思?xì)胞凋亡的典型特征如細(xì)胞皺縮、膜出泡及磷脂酰絲氨酸暴露同樣也在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。具體就是紅細(xì)胞通過(guò)非特異性陽(yáng)離子通道的Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+活性增加，可進(jìn)一步激活Ca2+-K+通道，隨后K+外流，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜超極化。另外Ca2+可刺激半胱氨酸內(nèi)肽酶降解紅細(xì)胞骨架蛋白，以上幾種因素可導(dǎo)致紅細(xì)胞膜出泡釋放RMPs[14]。在帶3蛋白聚簇模型中，將血紅蛋白的氧化和高鐵血色原的形成與細(xì)胞膜上通過(guò)二硫鍵結(jié)合的帶3蛋白二聚體相關(guān)聯(lián)，此二聚體誘導(dǎo)了帶3蛋白細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域的改變，易被天然的帶3抗體識(shí)別而清除。雖然未能直接證明帶3新抗原導(dǎo)致紅細(xì)胞產(chǎn)生囊泡，然而從RMPs富含帶3和其二聚體可以推測(cè)這可能是紅細(xì)胞排除新抗原的一種方式。以上兩種模型都是與紅細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻和細(xì)胞骨架蛋白降解、帶3蛋白的磷酸化有關(guān)。這一過(guò)程會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而促進(jìn)了RMPs的形成和釋放[15]。

1.2 RMPs的組成：MPs是由膜和膜內(nèi)容物構(gòu)成，膜主要含脂類和蛋白質(zhì)，具有脂質(zhì)雙分子層，外層是帶負(fù)電荷的磷脂。膜內(nèi)容物包含母細(xì)胞來(lái)源的基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、遺傳物質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器等。其生物學(xué)特性一方面取決于它們的循環(huán)數(shù)量，但更主要的是取決于其成分。RMPs中血紅蛋白的含量約為循環(huán)紅細(xì)胞的20%[16]。RMPs的脂質(zhì)是包含特異蛋白分子的脂質(zhì)筏形式，其富含糖基醇磷脂（glycosylphosphatidylinositol，GPI）-錨定蛋白，缺乏主要的跨膜蛋白。RMPs的磷脂成分與完整紅細(xì)胞膜上含有的磷脂類似，但也有不同之處，比如RMPs的磷脂酸含量比紅細(xì)胞多10倍而磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）含量略低于紅細(xì)胞[17]。

1.3 RMPs的檢測(cè)方法：迄今為止，雖然MPs已引起越來(lái)越廣泛的關(guān)注，但仍沒(méi)有確立標(biāo)準(zhǔn)的MPs計(jì)數(shù)分析方法。較常用的方法有電子顯微鏡、蛋白質(zhì)組學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)等。其中流式細(xì)胞術(shù)是目前臨床廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)方法，不僅可以檢測(cè) RMPs 的來(lái)源，還可以對(duì)其進(jìn)行半定量分析。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于直徑＜0.30 μm 的細(xì)胞微粒不敏感，所以計(jì)數(shù)MPs時(shí)，往往忽略了直徑較小的RMPs。在RMPs濃度很高的樣本中，由于RMPs的黏附特性，流式細(xì)胞儀不能區(qū)分大的RMPs和聚集的RMPs，從而也可能造成RMPs計(jì)數(shù)偏低[18]。較小的MPs可能會(huì)提供一個(gè)促凝表面，而事實(shí)上已經(jīng)證明直徑小于200 nm的MPs至少占了50%的凝血酶生成能力[19]。微粒計(jì)數(shù)方面的偏差可能是引起RMPs性質(zhì)和功能諸多爭(zhēng)論的部分原因。

可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)RMPs表面與紅細(xì)胞特異表達(dá)相同的血型糖蛋白A（CD235a）來(lái)驗(yàn)證RMPs的來(lái)源。膜聯(lián)蛋白V（annexin V）可與PS結(jié)合從而在流式細(xì)胞儀檢測(cè)MPs[12]，但這種方法可能會(huì)產(chǎn)生一些誤判，因?yàn)楸蝗旧某薓Ps外還有細(xì)胞碎片。此外，也有研究表明，并不是所有的微粒都表達(dá)PS[12]。羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）可以成功地用于識(shí)別特定的完整的封閉囊泡膜，用CFSE染料結(jié)合抗CD235a抗體可以很好地排除碎片干擾,更靈敏地識(shí)別RMPs。Grisendi等人提出了聯(lián)合CFSE、CD235a和annexin V多參數(shù)染色的方法來(lái)測(cè)定RMPs。數(shù)據(jù)表明CFSE/ CD235a雙標(biāo)記比annexin V/ CD235a檢出的RMPs數(shù)量多4～7倍[20]。有報(bào)道稱乳凝集素（lactadhein）是一種比annexin V更靈敏的PS標(biāo)記物[21]，但是Aung HH等人證明了二者在結(jié)合PS作用上幾乎一樣[22]。張寧潔等人指出，“二次離心”方法和超濾離心管相結(jié)合可顯著提高 RMPs 的回收率[23]。靈敏度和特異性更高的MPs檢測(cè)方法有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

2 RMPs的生物學(xué)功能 起初人們認(rèn)為MPs只是沒(méi)有任何生物功能的細(xì)胞碎片或“塵埃”[24]，但隨著對(duì)MPs的了解越來(lái)越深入，它們已經(jīng)被公認(rèn)可參與廣泛的生物學(xué)反應(yīng)，如炎癥、凝血、免疫功能的調(diào)節(jié)，并能作為細(xì)胞間生物活性物質(zhì)運(yùn)輸及轉(zhuǎn)換的傳遞介質(zhì)來(lái)進(jìn)行信息傳遞。下面介紹幾個(gè)RMPs可能具有的生物學(xué)功能。

2.1 清除物質(zhì)：紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過(guò)程中，會(huì)發(fā)生一系列生化和形態(tài)改變，稱之為“儲(chǔ)存損傷”[25]。通常，這些變化包括ATP和2,3-DPG濃度降低，酸中毒，細(xì)胞氧化損傷，細(xì)胞膜完整性受損以及可變形性下降等[26]。在輸血研究范疇下，RMPs數(shù)量的增加也被認(rèn)為是儲(chǔ)存損傷的一種表現(xiàn)形式[27]。在紅細(xì)胞生命周期內(nèi)，其通過(guò)囊泡排放損失了大約20%的體積，同時(shí)血紅蛋白濃度增加了14%[28]。有些學(xué)者認(rèn)為囊泡形成是有益的，可幫助衰老紅細(xì)胞除去其胞內(nèi)積累的特定有害物質(zhì)如變性血紅蛋白、C5b-9補(bǔ)體攻膜復(fù)合物、帶3新抗原或免疫球蛋白IgG等[28，29]。但也有學(xué)者認(rèn)為RMPs的生成會(huì)促進(jìn)人體內(nèi)紅細(xì)胞的清除。CD47是正常紅細(xì)胞膜表面的一種蛋白，巨噬細(xì)胞能夠識(shí)別CD47，從而不會(huì)吞噬紅細(xì)胞，RMPs的釋放會(huì)使紅細(xì)胞膜表面的CD47表達(dá)減少，此時(shí)巨噬細(xì)胞將啟動(dòng)其吞噬機(jī)制而導(dǎo)致體內(nèi)紅細(xì)胞減少[30]。

2.2 信息傳遞：MPs可通過(guò)其表面活性分子的作用來(lái)激活細(xì)胞受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)及改變其性質(zhì)。MPs可通過(guò)轉(zhuǎn)染mRNA和miRNA到靶細(xì)胞來(lái)影響其基因的表達(dá)，MPs也可以通過(guò)直接轉(zhuǎn)移活性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[31]。RMPs能作為細(xì)胞間生物活性物質(zhì)運(yùn)輸及轉(zhuǎn)換的傳遞介質(zhì)，主要包括轉(zhuǎn)移肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分、miRNAs、mRNA和DNA[32]。瘧原蟲感染時(shí)，體內(nèi)RMPs數(shù)量增加，此時(shí)高濃度的RMPs對(duì)于細(xì)胞間的通訊起到了至關(guān)重要的作用，已有研究證明RMPs 與瘧原蟲DNA轉(zhuǎn)錄和密度調(diào)控之間具有緊密的聯(lián)系[33]。此時(shí)RMPs從被感染的紅細(xì)胞中定量釋放，大多數(shù)RMPs是在無(wú)性生殖周期的晚期釋放的，它們含有人源和惡性瘧原蟲衍生的蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)。已有證據(jù)表明RMPs可在被感染的紅細(xì)胞之間充當(dāng)信使。RMPs在感染的紅細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，改變種群內(nèi)傳播階段的產(chǎn)生。此研究為系統(tǒng)研究RMPs在瘧疾發(fā)病機(jī)制中的作用以及作為瘧原蟲生命周期中細(xì)胞間通訊的媒介提供了理論依據(jù)[33]。

2.3 凝血：RMPs同其他MPs一樣，在形成過(guò)程中伴隨著膜不對(duì)稱性喪失，從而暴露出帶有負(fù)電荷的磷脂，尤其是PS[1,14]。 PS促進(jìn)凝血因子Ⅱ、Ⅶ、IX和X的結(jié)合，以及凝血復(fù)合物的組裝，從而加速凝血酶的形成[16]。 PS外翻暴露為鈣離子依賴的凝血酶復(fù)合物的對(duì)接提供了條件，并為促進(jìn)凝血酶生成的tenase和/或凝血酶原酶復(fù)合物提供了一個(gè)催化表面。帶負(fù)電荷的PS以及鈣離子是凝血酶原酶復(fù)合物（如tenase）和凝血酶原酶裝配所必需的[34]，血小板衍生的MPs（PMPs）已被證明具有比血小板自身高50～100倍的促凝活性[35]。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)估算膜表面單元證明，RMPs膜比血小板膜能更有效地支持凝血酶的形成[36]。而RMPs表面同樣具有帶負(fù)電荷的膜結(jié)構(gòu)，能夠在含有少量外源性組織因子存在的情況下增加凝血酶的生成，甚至在沒(méi)有組織因子時(shí)亦可啟動(dòng)、傳播凝血酶生成[37]。有證據(jù)表明，這種促凝活性依賴于FⅫ[38]，也有人則認(rèn)為RMPs是通過(guò)依賴FⅪ的方式啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑[39]。Biro等人認(rèn)為RMPs膜表面表達(dá)組織因子（tissue factor，TF），有助于RMPs的促凝作用[40]。最近Jy等人又證實(shí)了RMPs通過(guò)獨(dú)立于內(nèi)源性途徑之外的途徑促進(jìn)凝血，說(shuō)明RMPs上含有TF參與凝血過(guò)程[41]。值得注意的是，RMPs數(shù)目在某些高凝病理狀態(tài)如鐮狀細(xì)胞危象時(shí)會(huì)增加[42]。有趣的是，RMPs還可以結(jié)合蛋白C的輔因子蛋白S，進(jìn)而降低FVa和FⅦa活性，抑制tenase和凝血酶原酶活性，從而導(dǎo)致凝血途徑的抑制[43]。

2.4 炎癥：有研究表明RMPs通過(guò)促進(jìn)選擇素P與其配體的相互作用，以及通過(guò)提高C反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白和CD11b的數(shù)量，間接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化作用，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[44]。Zecher等證明RMPs能夠在炎癥環(huán)境中增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞釋放炎性因子。另外，還驗(yàn)證了RMPs在補(bǔ)體5a受體缺失的小鼠體內(nèi)無(wú)法誘導(dǎo)炎性因子的釋放，進(jìn)一步說(shuō)明RMPs可通過(guò)補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑，促進(jìn)炎性因子的釋放[45]。RMPs膜表面還表達(dá)Duffy抗原，研究證實(shí)這種抗原在炎癥反應(yīng)中起重要作用，主要由趨化因子配體1（CXCL 1）的聚集以及與血小板之間的相互作用引起，刺激血小板釋放α糖蛋白顆粒而放大炎癥反應(yīng)[46]。另外，RMPs也可能有抗炎作用。Sadallah等[47]發(fā)現(xiàn)RMPs能夠持續(xù)抑制炎性因子如腫瘤壞死因子-α、白介素-8或白介素-10的釋放。RMPs還可以通過(guò)調(diào)節(jié)膜上PS的表達(dá)或者其他機(jī)制間接抑制巨噬細(xì)胞的活性，從而影響炎癥的產(chǎn)生過(guò)程?？傊壳癛MPs對(duì)炎癥反應(yīng)是促進(jìn)還是抑制作用的問(wèn)題尚未有統(tǒng)一定論，仍須進(jìn)一步研究。

3 RMP與疾病 RMPs水平在很多疾病如免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig) A腎病、腎病綜合征 (nephrotic syndrome，NS)、溶血性疾病等中均上升，其或許可作為診斷疾病的指標(biāo)之一。

3.1 鐮狀細(xì)胞?。涸阽牋罴?xì)胞病中,聚合的異常血紅蛋白S影響了紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致紅細(xì)胞形狀由圓盤狀變?yōu)殓牭稜睢MPs水平在疾病平穩(wěn)期及危象時(shí)均升高，影響血管內(nèi)溶血率和凝血激活的程度[42]。由于其血紅蛋白含量及暴露的PS，RMPs可以作為一氧化氮（NO）清除率和促凝血活性升高的指標(biāo)之一。RMPs中含有超過(guò)一半的游離血漿血紅蛋白，可以顯著地影響NO生物利用度[48]。鐮狀細(xì)胞病中RMPs水平可與升高的血管內(nèi)溶血率、并發(fā)癥傾向一起用于定義亞臨床表型[49]。

3.2 急性移植物抗宿主?。焊杉?xì)胞移植后，發(fā)生急性移植物抗宿主病的患者RMPs水平升高。因此，RMPs可能作為區(qū)分急性移植物抗宿主與感染或膿毒癥等并發(fā)癥的診斷指標(biāo)之一。在急性移植物抗宿主病伴隨微血管病變患者中觀察到大量的RMPs，表明紅細(xì)胞的機(jī)械性破壞對(duì)RMPs釋放起到一定作用[50]。

3.3 輸血后急性肺損傷（transfusion-related acute lung injury, TRALI）：TRALI是一種具有較高死亡率的輸血相關(guān)不良反應(yīng)，其最有說(shuō)服力的發(fā)病機(jī)制是“二次打擊”模型。“第一次打擊”是外傷、感染等使中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生炎性反應(yīng)，此后輸入含有各種細(xì)胞因子、抗體及生物活性脂質(zhì)的血液制品使已經(jīng)致敏的中性粒細(xì)胞發(fā)生一系列反應(yīng)從而誘發(fā)TRALI為“第二次打擊”[51，52]。最近的研究提出RMPs中富含的IgG與補(bǔ)體通過(guò)Fc受體活化中性粒細(xì)胞或者RMPs直接結(jié)合并活化中性粒細(xì)胞，從而導(dǎo)致TRALI的發(fā)生[53]。另外RMPs具有很強(qiáng)的促凝血活性致使輸血后肺微血管血栓形成，導(dǎo)致缺血性肺損傷。

4 結(jié)語(yǔ) 由于目前檢測(cè)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)研究方法的限制，RMPs的表型和功能尚未完全明確。RMPs在疾病中的相互作用尚不明確，它們既可表現(xiàn)為協(xié)同作用，也可表現(xiàn)為拮抗作用，甚至同一種MPs可同時(shí)表現(xiàn)出相互矛盾的生物學(xué)功能。深入研究RMPs有助于明確輸注儲(chǔ)存的血液制品對(duì)受血者的影響，對(duì)臨床輸血的安全性及有效性具有重要的意義。RMPs有望作為一種新興的生物標(biāo)志物，為包括血栓性疾病在內(nèi)的多種疾病的診斷和治療提供新的思路和途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突