膿毒癥中線粒體的損傷及修復(fù)

龐秀峰，石斌

(上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院·同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院急診內(nèi)科，上海 200089)

線粒體是細(xì)胞基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它的功能包括能量轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生和解毒活性氧(reactive oxygen species, ROS)、滲透調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞器間溝通、細(xì)胞增殖和衰老以及細(xì)胞對多種生理和遺傳應(yīng)激的反應(yīng)。ROS可以影響脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷，其作用方式與傳統(tǒng)的第二信使分子類似[1，2]。線粒體功能障礙在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3,4]。本文就線粒體在膿毒癥患者中的損傷機(jī)制及促進(jìn)線粒體修復(fù)的方法進(jìn)行綜述，為臨床膿毒癥患者的治療提供研究思路。

1 膿毒癥對線粒體的損傷作用

1.1 呼吸鏈損傷

線粒體呼吸鏈的主要功能是傳遞電子，最終產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)。膿毒癥導(dǎo)致組織缺氧，雖然復(fù)合物IV(即細(xì)胞色素C氧化酶)的特殊酶特征使它能夠在低氧濃度下發(fā)揮作用，但過低濃度的氧仍會危及ATP的產(chǎn)生，并觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑[5]。另外膿毒癥時由于缺氧導(dǎo)致炎癥介質(zhì)、ROS以及活性氮類(reactive nitrogen species, RNS)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致乳酸大量增加及ATP減少及線粒體呼吸鏈復(fù)合物I抑制。此外，內(nèi)毒素激活了一氧化氮合酶的活性，增加了一氧化氮(nitric oxide, NO)的量，NO可直接抑制復(fù)合物IV的活性，從而抑制電子傳遞鏈的終末環(huán)節(jié)，導(dǎo)致即使在供氧充足時線粒體功能的障礙及氧化能力的損害[6]。有研究表明膿毒癥休克的患者線粒體復(fù)合物I(即NADH-CoQ氧化還原酶)活性降低，與其中NO產(chǎn)生過多有關(guān)系[7]；同樣在長期腹膜炎的嚙齒動物的肌肉和肝臟中發(fā)現(xiàn)同一現(xiàn)象[8]。觀察研究膿毒癥患者呼吸鏈復(fù)合物的變化發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者中呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ酶活性明顯受抑，其受抑程度及活性與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)。該研究表明線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性或可作為評價膿毒癥病情的生物學(xué)指標(biāo)[9]。

1.2 甲狀腺激素分泌改變

甲狀腺功能減退與膿毒癥、多發(fā)創(chuàng)傷、急性呼吸窘迫綜合征和機(jī)械通氣的不良結(jié)局之間存在相關(guān)性。研究表明重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care Unit, ICU)死亡患者中游離甲狀腺素3(free thyroxine 3, FT3)的水平較存活患者低，F(xiàn)T3降低是死亡的獨立預(yù)測因子[10]。甲狀腺激素被認(rèn)為主要通過調(diào)節(jié)線粒體活性發(fā)揮其作用。一方面，F(xiàn)T3和FT2通過細(xì)胞色素C氧化酶增加線粒體活性；另一方面，F(xiàn)T3能夠通過p43誘導(dǎo)線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄，而刺激線粒體的生物過程可能是通過甲狀腺素受體1(thyroxine receptor 1, TR1)或者TRβ1影響基因組3的表達(dá)[11]。

1.3 鈣超載

膿毒癥循環(huán)缺血過程促使了無氧代謝，致使細(xì)胞代謝和氧化磷酸化被抑制而導(dǎo)致了強(qiáng)烈持久的細(xì)胞內(nèi)酸中毒的迅速發(fā)展，在此基礎(chǔ)上由細(xì)胞膜鈉-氫交換器、Na+通道、Na+-HCO3-聯(lián)合傳輸、Na+-K+ATP酶、Na+-Ca2+交換器的共同作用，驅(qū)動細(xì)胞膜Ca2+流入，從而產(chǎn)生胞質(zhì)Ca2+過載[12,13]。Ca2+超載會導(dǎo)致ATP消耗、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)和磷脂降解、染色體損傷、促進(jìn)氧自由基生成、心律失常、肌原纖維過度收縮斷裂，最后Ca2+超載和ROS會打開線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrion permeability transition pore, mPTP)，進(jìn)一步損害細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)。

1.4 線粒體的滲透性轉(zhuǎn)換與細(xì)胞凋亡

mPTP是連接線粒體內(nèi)膜(inner mitochondrial membrane, IMM)和線粒體外膜(outer mitochondrial membrane, OMM)的復(fù)合蛋白孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙的開閉轉(zhuǎn)變受到多個效應(yīng)器的嚴(yán)格調(diào)控。在正常狀態(tài)下線粒體內(nèi)有多種胞質(zhì)激酶維持線粒體內(nèi)的滲透性：隨著生長因子的結(jié)合，酪氨酸激酶受體(receptor of tyrosine kinases, RTKs)激活Erk和Akt, 使凋亡蛋白Bcl-2家族遠(yuǎn)離OMM，從而不會激活GSK3β，這樣讓己糖激酶(hexokinase, HK)在OMM上與電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channels, VDAC)結(jié)合，VDAC與線粒體內(nèi)膜上的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位(adenine nucleotide translocation, ANT)、線粒體肌酸激酶(creatine kinase, CK)、基質(zhì)嗜環(huán)素D(cyclotropic D, cypD)蛋白緊密結(jié)合，維持PTP閉合狀態(tài)，使得凋亡因子隔離在線粒體膜間隙空間，處于無功能狀態(tài)。當(dāng)線粒體暴露在死亡刺激下，缺乏生長因子可抑制“生存激酶”的活性，支持促凋亡的Bcl-2家族蛋白在OMM上再定位促使HK與VDAC分離，OMM上促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族蛋白之間的平衡向誘導(dǎo)死亡傾斜。一方面，通過改變OMM本身，使細(xì)胞色素C(cytochrome, CytC)和其他死亡誘導(dǎo)物通過蛋白孔(如Bax通道)釋放；另一方面，通過打開IMM中的PTP，從而導(dǎo)致CytC釋放到細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)凋亡[14]。

1.5 線粒體DNA與細(xì)胞免疫異常

Hauser實驗室發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的CpG基序可以觸發(fā)Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)信號，激活p38和p42-44絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)活性、CXC趨化配體8(CXC chemokine ligand-8)分泌和中性粒細(xì)胞趨化，與受體結(jié)合生成炎癥小體，mtDNA能與這些形成炎癥小體的受體結(jié)合成復(fù)合物，釋放活化物，參與動脈硬化、黃斑變性及細(xì)菌感染等炎癥性疾病[15]。除了觸發(fā)促炎反應(yīng)外，胞質(zhì)和細(xì)胞外mtDNA作為一種強(qiáng)效的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)，可通過多種模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，mtDNA作為膜結(jié)合和胞質(zhì)PRRs調(diào)控I型干擾素(interferon, IFN)反應(yīng)的激動劑，可觸發(fā)I型IFNs和干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISG)表達(dá)[16，17]。

重癥患者血漿mtDNA升高。一方面，應(yīng)激狀態(tài)下線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mROS)的生成增加，mROS的增加會降低線粒體膜電位，導(dǎo)致膜完整性受損，致mtDNA滲漏到細(xì)胞質(zhì)中[18]；另一方面，mROS增加與mtDNA結(jié)合成OX-mtDNA，然后通過mPT或其他孔道釋放到胞質(zhì)中，或者mtDNA通過因凋亡啟動導(dǎo)致的Bcl-2樣蛋白4(BAX)和Bcl-2同源拮抗劑/殺傷劑(BAK)依賴性通道打開，mtDNA釋放到胞質(zhì)中[19]。Krychtiuk等[20]在一項研究中發(fā)現(xiàn)危重患者血漿mtDNA水平明顯高于健康對照組，還發(fā)現(xiàn)ICU組患者mtDNA與死亡率顯著相關(guān)，與APACHE II、性別一起能有效預(yù)測死亡率。這些研究結(jié)果表明，血漿mtDNA水平升高可作為膿毒癥患者診斷的生物標(biāo)志物，mtDNA亦是危重者死亡率的獨立測因子。

2 線粒體的修復(fù)

2.1 泛素

泛素(MitoQ)已被證明可以保護(hù)哺乳動物細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡，是線粒體靶向抗氧化劑之一，在體內(nèi)MitoQ治療能降低急性肝腎功能障礙的生化標(biāo)志物水平[21]。MitoQ被廣泛用于人類疾病動物模型后，已被證明通過口服、靜脈注射及腹腔內(nèi)注射是有效的[22]。Dare等[23]研究證明，在缺血開始前給予MitoQ可對腎臟提供功能保護(hù)，可能是因為其在再灌注時可減少腎臟組織的氧化損傷。另外，MitoQ 已應(yīng)用于2個人類Ⅱ期臨床試驗，并在一個小型丙肝患者的研究中被證明安全和耐受性良好，能長期有效地防止肝臟炎性損傷[24]?；贛itoQ已安全用于Ⅱ期臨床試驗，其作為臨床缺血再灌注多器官功能損傷的潛在治療藥物的作用值得進(jìn)一步探索。

2.2 褪黑素

褪黑素是線粒體靶向抗氧化劑，具有顯著的抗炎和抗凋亡作用。褪黑素在膿毒癥中的有益作用在研究中得到了證明；膿毒癥和多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)的大鼠接受不同劑量的褪黑素治療，其肝、腎、心血管功能障礙被完全阻止，恢復(fù)了正常代謝；并且，褪黑素以劑量依賴的方式抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)[25]。體外培養(yǎng)大鼠肝、腦線粒體發(fā)現(xiàn)，褪黑素使復(fù)合物I和IV的活性提高，其與基質(zhì)線粒體蛋白特異性結(jié)合，增加了復(fù)合物IV的亞基mtDNA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄活性[26]。滴定研究也表明了褪黑素抵消了氰化物對復(fù)合物IV的抑制作用[26]。此外，褪黑素顯著增加膿毒癥小鼠心肌中沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1, SIRT1)蛋白的表達(dá)，提示褪黑素通過激活小鼠SIRT1調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和線粒體自噬來保護(hù)小鼠免受膿毒癥心肌損傷[27]。

2.3 血紅素氧合酶-1

線粒體質(zhì)量控制(quality control, QC)，包括線粒體生物合成、線粒體自噬和線粒體動態(tài)變化，越來越被認(rèn)為是恢復(fù)與氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)的缺血性損傷的關(guān)鍵。血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1, HO-1)是一種可誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)酶，在炎癥、缺氧或熱療等多種細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下均可激活，在氧化還原穩(wěn)態(tài)維持及線粒體質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用。磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)是糖酵解過程中將3-磷酸甘油酯轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酯的一種中間代謝酶。PGAM5定位于線粒體，參與抗氧化反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和線粒體自噬。研究發(fā)現(xiàn)HO-1通過激活PGAM5信號調(diào)節(jié)線粒體QC，促進(jìn)線粒體生物合成，修復(fù)受損的線粒體，抑制線粒體分裂，從而保護(hù)肝臟免受膿毒癥缺血/再灌注損傷，這些發(fā)現(xiàn)提示HO-1可能是膿毒癥中線粒體QC的調(diào)節(jié)劑[28]。

2.4 氫

氫(H2)能通過氣體擴(kuò)散穿過血腦屏障和細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜到達(dá)線粒體，具有明確的選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，在治療膿毒癥方面很有前景。Shimada等[29]報道，低濃度的氫氣(濃度為2%)可以通過選擇性地減少細(xì)胞毒性活性氧而發(fā)揮治療性抗氧化作用。越來越多的研究表明，H2有望成為膿毒癥相關(guān)急性肺損傷、肝缺血/再灌注損傷和休克的治療氣體[30，31]。研究發(fā)現(xiàn)，H2通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)清除損傷的線粒體，改善線粒體功能，如線粒體呼吸控制率、線粒體膜電位、ATP的產(chǎn)生和線粒體呼吸復(fù)合物I等，而發(fā)揮有益影響[32]。

2.5 線粒體自噬的調(diào)控

線粒體自噬作為一種選擇性自噬，指在缺血、缺氧、氧化應(yīng)激和衰老等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，從而激活自噬體-溶酶體途徑，完成受損線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程[33]。研究顯示，免疫相關(guān)的GTPase家族M基因(immune related GTPase family-M Gene, IRGM)中自噬相關(guān)位點的多態(tài)性與膿毒癥的死亡率有關(guān)，攜帶純合子TT等位基因的患者，其死亡率幾乎是其他基因型的2倍，分別為48.1%和25.1%[34]。體外實驗顯示，TT基因型中IRGM的mRNA表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致其自噬缺陷；健康志愿者全血內(nèi)毒素刺激后，TT純合子中IRGM表達(dá)明顯降低，提示嚴(yán)重膿毒癥患者IRGM(+313)位點TT純合子可能參與抑制IRGM表達(dá)，從而抑制自噬，導(dǎo)致不良的臨床結(jié)局[34]。西羅莫司是一種自噬激動劑，可通過抑制 mTOR的功能，減弱mTOR對線粒體自噬MAPK途徑的調(diào)控，促進(jìn)腎臟缺血/再灌注損傷的修復(fù)。因此，調(diào)節(jié)自噬激動劑將有希望減少膿毒癥相關(guān)損害。

3 結(jié)論和展望

在疾病變化過程中，線粒體的功能具有可變性、多變性和特異性等特點，線粒體損傷在膿毒癥演變中起著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制目前還無法完全闡明。通過調(diào)控修復(fù)線粒體功能達(dá)到治療膿毒癥的路徑依然很長，還需要我們不斷努力。