一株羊種變異布魯氏菌分離株遺傳特征分析

楊曉雯，韓秀瑞，樸東日，趙鴻雁，田國忠，姜 海

布魯氏菌(Brucella)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，易造成宿主持續(xù)性感染，引起全球性人獸共患流行性疾病—布魯氏菌病。該病主要表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，嚴(yán)重者使患者喪失勞動(dòng)能力，影響公共衛(wèi)生安全以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。人感染布魯氏菌若診療不及時(shí)，容易引起各種并發(fā)癥，如脊柱炎、心內(nèi)膜炎、腦炎等[2]。羊種、牛種、豬種和犬種布魯氏菌能夠感染人。全球人間布魯氏菌病發(fā)病率年平均超過50萬例[3]，中東地區(qū)每百萬人口的布魯氏菌病發(fā)病率均在200以上，敘利亞發(fā)病率最高(1 603.4/10萬)，但據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查表明，實(shí)際發(fā)病率是報(bào)告的10～25倍[4]。我國布魯氏菌病首次報(bào)道于內(nèi)蒙古[5]，人間布魯氏菌病疫情于1957-1963年和1969-1971年出現(xiàn)兩次流行高峰。隨著動(dòng)物布魯氏菌病疫苗的使用，上世紀(jì)80-90年代人畜布魯氏菌病發(fā)病率顯著下降[6]，但自20世紀(jì)90年代中期開始，布魯氏菌病疫情在國內(nèi)再次肆虐，并從北方擴(kuò)展到南方[7]，全國32省市自治區(qū)均有病例報(bào)道[8]。

自然條件下，除犬種和綿羊附睪種布魯氏菌外，其余種型布魯氏菌為光滑型布魯氏菌。布魯氏菌的表型主要由外膜外側(cè)的脂多糖(LPS)決定。LPS由類脂A、核心寡聚糖和O抗原組成，根據(jù)LPS是否含有O抗原，將布魯氏菌分為光滑型和粗糙型，光滑型布魯氏菌的LPS含有O抗原(S-LPS)，而粗糙型布魯氏菌的LPS缺少O抗原(R-LPS)[9]。粗糙的布魯氏菌的致病力降低，而粗糙型通常不會(huì)引起人類布魯氏菌病[10]。本研究針對課題組保存的菌株，經(jīng)表型鑒定后，利用全基因組測序技術(shù)對變異羊種布魯氏菌進(jìn)行測序，分析其遺傳特征，為我國布魯氏菌病的防控提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1布魯氏菌菌株 布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和變異菌株于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傳代培養(yǎng)及增殖。布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組序列及其氨基酸序列于NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫中下載(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/brucella/)。

1.2粗糙表型鑒定 利用單因子R血清、三勝黃素檢測表型。取培養(yǎng)后的布魯氏菌，利用生理鹽水調(diào)整其比濁度為0.5 McF，取30 μL菌液與分別等體積的單因子R血清和三勝黃素混合，2 min觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。粗糙型布魯氏菌存在凝集現(xiàn)象，而光滑型布魯氏菌不凝集[11]。

結(jié)晶紫染色檢測表型。待平板上長出單菌落后，稀釋結(jié)晶紫染液至工作濃度，覆蓋單菌落表面染色15～20 s，棄掉染液后放大鏡觀察菌落著色情況。粗糙型布魯氏菌著色，被染成紅色或者紫色；光滑型菌落不著色，仍然為原來的黃色或黃綠色[11]。

1.3LPS提取及鑒定 劃線培養(yǎng)布魯氏菌，取適量培養(yǎng)48 h的菌體，利用生理鹽水調(diào)整比濁度為1.5 McF，此時(shí)細(xì)菌濃度約為1.0×109CFU/mL。將菌液于室溫下13 000 r/min離心，棄掉上清液，重復(fù)2～3次，獲取足夠的細(xì)菌，然后按照脂多糖提取試劑盒(iTron，韓國)的操作說明提取LPS，-20 ℃保存。將提取的LPS利用SDS-PAGE(康為世紀(jì)，中國)檢測，選用銀染試劑盒(碧云天，中國)染色。

1.4全基因組測序 劃線培養(yǎng)菌株，取適量培養(yǎng)48 h的菌體，使用Wizard Genomic DNA Purification試劑盒(Promega，美國)提取細(xì)菌基因組DNA。檢測合格的基因組DNA，使用Nextera XT Library Prep試劑盒(Illumina，美國)添加接頭，進(jìn)行了測序文庫的制備。將序列送交華大基因有限公司(中國)，使用Illumina / Solexa測序分析儀對文庫進(jìn)行測序，基因組覆蓋度大于100倍(100 ×)。

測序完成后獲得原始數(shù)據(jù)(raw data)，應(yīng)用fastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)進(jìn)行測序質(zhì)量評價(jià)，去除冗余序列及質(zhì)量低的序列。同時(shí)，將通過測序質(zhì)量評價(jià)的序列去掉接頭，即為clean data，后續(xù)分析使用clean data進(jìn)行。

1.5比較基因組分析 利用BWA[12]將clean data比對到參考基因組上，允許最大gap為5，應(yīng)用samtools[13]輸出測序深度，同時(shí)輸出4 ×和20 ×測序覆蓋度，利用excel統(tǒng)計(jì)測序深度和覆蓋度。利用velvet[14]將clean data進(jìn)行組裝成大片段序列contig，利用BLAST將contig在全基因組中定位，利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物將gap補(bǔ)全成為完整基因組，利用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP)[15]進(jìn)行全基因組注釋。

利用samtools和GATK[16]相結(jié)合的方法檢測SNP和InDel，更準(zhǔn)確地對變異進(jìn)行識別。通過多種算法各自識別的SNP和InDel進(jìn)行一致性分析，保留具有高度一致性的變異作為最終結(jié)果，這些高度一致性的SNP和InDel具有非常高的可信度。將最終結(jié)果利用GATK進(jìn)行過濾，留下測序質(zhì)量大于20且兩個(gè)SNP的距離不小于5的SNP和InDel。

將參考基因組的序列建庫，提取出參考基因組的蛋白編碼序列，蛋白序列和信使RNA序列(mRNA)等，利用snpEff[17]對找到的變異進(jìn)行注釋，包括同義突變，錯(cuò)義突變，移碼突變等，同時(shí)利用excel統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的變異位點(diǎn)，數(shù)量和每kb SNP的大小用于比較變異率。

對完整的基因組來說，利用MAUVE[18]將全基因組比對SNP結(jié)果輸出；對測序樣品來說，利用samtools和GATK結(jié)合尋找變異位點(diǎn)，從過濾后的最終結(jié)果中提取出SNP位點(diǎn)。利用phyloSNP將兩者的輸出結(jié)果構(gòu)建矩陣，采用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，自檢值為1 000。

2 結(jié) 果

2.1變異羊種布魯氏菌 本研究發(fā)現(xiàn)，分離自寧夏的1株羊種布魯氏菌能夠與R血清和三勝黃素(圖1)發(fā)生凝集，且被結(jié)晶紫染色，初步判斷該菌株為變異羊種布魯氏菌。

圖1 三勝黃素凝集試驗(yàn)檢測布魯氏菌表型Fig.1 Rough phenotype detection by acriflavinium chloride

提取該菌株以及參考布魯氏菌菌株的LPS后，利用SDS-PAGE凝膠檢測，發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌參考菌株16M、羊種疫苗株M5以及另外兩株分離株LPS條帶分布基本一致，除共有的條帶簇之外，在34-43 kDa，55-95 kDa及180 kDa附近也有明顯的LPS組成條帶分布(圖2)。而犬種布魯氏菌RM6/66和寧夏分離株的LPS則不具有以上3個(gè)條帶簇。從LPS的凝膠檢測條帶中可以發(fā)現(xiàn)，光滑型布魯氏菌含有長鏈的O側(cè)鏈，而寧夏分離株的脂多糖條帶更接近于粗糙型犬種布魯氏菌RM6/66，主要包括中鏈和短鏈的O側(cè)鏈，這和凝集試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.2變異菌株全基因組注釋 寧夏分離株共獲得1.48 Gb大小的原始數(shù)據(jù)，過濾后共獲得1.25 Gb大小的clean data。利用velevet進(jìn)行組裝時(shí)，收集大于500 bp的contig。寧夏分離株基因組草圖包含27個(gè)contigs，最長contig片段為609 252 bp，N50大小為358 887 bp，序列GC含量為57.24%。

1為蛋白marker，2為羊種布魯氏菌16M菌株的LPS，3為羊種布魯氏菌疫苗株M5菌株的LPS，4-5為其他分離株的LPS，6為犬種布魯氏菌RM6/66菌株的LPS，7為本研究涉及的寧夏分離株的LPS。圖2 SDS-PAGE檢測LPS的完整性Fig.2 Composition of LPS by SDS-PAGE

利用Vector NTI設(shè)計(jì)引物將gap補(bǔ)全成為完整基因組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寧夏分離株的全基因組序列中包含兩條染色體，染色體1大小為2 126 100 bp，染色體2大小為1 185 600 bp，基因組大小為3 311 700 bp，GC含量為57.2%。該分離株基因組經(jīng)注釋后含有3 379個(gè)CDS，9個(gè)rRNA，55個(gè)tRNA和4個(gè)ncRNA(圖3)。

圖3 羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株全基因組基因功能注釋圖Fig.3 Annotation of the whole genome sequences of the rough B. melitensis strain

2.3變異菌株遺傳特性分析 利用全基因組構(gòu)建進(jìn)化樹可知，寧夏分離株屬于羊種布魯氏菌，且與羊種2型標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC23457親緣關(guān)系最近。以羊種2型菌株ATCC23457為參考基因組，利用GATK和samtools尋找SNPs和InDel，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與參考菌株相比，該菌株存在282個(gè)變異，其中243個(gè)SNPs，39個(gè)InDel(17個(gè)Ins和22個(gè)Del)。SNP主要存在于C和T的變異之間，其中SNPs轉(zhuǎn)換(transitions，Ts)348個(gè)，顛換(transversions，Tv)137個(gè)，Ts/Tv率為2.54，變異率較低，表明基因組與參考基因組相比差異較小(圖4)。

圖4 羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株SNP及InDel在基因組中的分布圖Fig.4 Distribution of the SNP and InDel of the rough B. melitensis strain

已知的LPS合成相關(guān)基因中，假定甘露糖轉(zhuǎn)移酶(wboA，wboB)，甘露糖合成酶(manBo-Ag，manCo-Ag)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白(wzt)，十一異戊烯-糖基轉(zhuǎn)移酶(wbkF)，異構(gòu)酶/脫水酶(wbkD)和葡萄糖磷酸變位酶(pgm)基因均在寧夏分離株中均出現(xiàn)錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼氨基酸出現(xiàn)變異。LPS合成受阻后，最終導(dǎo)致寧夏分離株表型由光滑型變?yōu)榇植谛?，見?。

表1 已知LPS合成基因的變異統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Missense variations of the LPS-related genes

3 討 論

LPS是布魯氏菌的重要毒力因子，對S-LPS合成過程中所需的基因進(jìn)行突變、表達(dá)量改變以及調(diào)控基因突變可以導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不完整的R-LPS，使其毒力降低，可以作為弱毒活疫苗候選株。參與O抗原合成的基因主要有GDP-甘露糖脫水酶(gmd)、過骨胺合成酶(per)、甲?；D(zhuǎn)移酶(wbkC)、甘露糖糖轉(zhuǎn)移酶(wbkA、wbkE)、wbkD、wbkF和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白(wzm)、wzt等，另有兩個(gè)假定甘露糖轉(zhuǎn)移酶(wboA和wboB)[19]；與合成核心寡聚糖相關(guān)的基因主要有甘露糖酶(manBcore和manCcore)、甘露糖合成酶(manAo-Ag)、manBo-Ag和manCo-Ag、糖基轉(zhuǎn)移酶(wadA、wadB、wadC)、pgm[20]。參與類脂A合成的基因主要有?；?(?；d體蛋白)UDP-N-乙酰葡糖胺-O酰基轉(zhuǎn)移酶(lpxA)、UDP-3-O-酰基-N-乙酰葡糖胺二乙酰酶(LpxC)、UDP-3-O-(3羥基肉豆蔻酰基)葡糖胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(LpxD)、脂質(zhì)-A-二糖合成酶(LpxB)、Tetraacyldisaccharide-1-P4′激酶(LpxK)、2-脫氫-3-脫氧磷酸酯酸醛縮酶(KdsA)、3-脫氧-甘露糖基磺酸酯胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(KdsB)、3-脫氧-D-甘露八油酸轉(zhuǎn)移酶(KdtA)、月桂酰?；D(zhuǎn)移酶(HtrB)[21]。自然條件下存在的布魯氏菌的表型變異主要存在兩個(gè)途徑：插入段片(如IS711)插入LPS合成相關(guān)基因中(如疫苗株RB51)和LPS合成相關(guān)基因缺失(如綿羊附睪種布魯氏菌缺失GI-2)[9]，這兩種表型變異機(jī)制均屬于LPS合成相關(guān)基因的突變/缺失。最新的研究表明，參與LPS和成相關(guān)基因的表達(dá)量變化也能導(dǎo)致菌株表型的突變。羊種布魯氏菌RM57為粗糙型菌株，與親本菌株羊種布魯氏菌M1981相比，參與LPS合成的基因未出現(xiàn)突變，但pgm基因表達(dá)水平改變，表明參與LPS合成的相關(guān)基因表達(dá)水平的變化也可能引起布魯氏菌表型的變化[22]。

由于缺少O抗原的保護(hù)，R-LPS更容易暴露靶標(biāo)，影響布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存能力[23]，在感染細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)增殖能力和持續(xù)生存時(shí)間是布魯氏菌毒力判定的依據(jù)。這些因素導(dǎo)致了粗糙的布魯氏菌的致病力降低，而粗糙型通常不會(huì)引起人類布魯氏菌病[24]。研究表明，在沒有抗體等因素參與的條件下，粗糙型布魯氏菌侵入巨噬細(xì)胞的量要比光滑型布魯氏菌大，但侵入細(xì)胞形成早期布氏小體(Brucella-containing vacuole，BCV)后，光滑型布魯氏菌能夠抑制BCV與溶酶體融合，最終進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在細(xì)胞內(nèi)存活；而粗糙型布魯氏菌無法逃避與溶酶體的融合，容易被細(xì)胞清除掉。粗糙型和光滑型布魯氏菌刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體不同，粗糙型布魯氏菌的抗體不影響血清學(xué)診斷，因此，粗糙型布魯氏菌用于疫苗候選菌株具有較大的應(yīng)用前景。目前，布魯氏菌病得到有效控制的國家采取以下程序：選擇可靠的疫苗、制定恰當(dāng)?shù)拿庖叻桨?、形成廣泛的保護(hù)率、選擇合適的診斷方法，持續(xù)撲殺感染動(dòng)物并嚴(yán)格控制感染動(dòng)物群向無疫病動(dòng)物群運(yùn)輸動(dòng)物?；谶@些措施，部分國家也成功消滅了人布魯氏菌病[25]。由于粗糙型布魯氏菌毒力較光滑型低，且其刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體不影響布魯氏菌的血清學(xué)診斷，因此，粗糙型菌株在疫苗研發(fā)中存在優(yōu)勢。我國布魯氏菌病防控現(xiàn)狀嚴(yán)峻，布病發(fā)病數(shù)逐年增高，且遍布全國。疫苗作為布病防控中的手段之一，需要著重篩選疫苗候選菌株，結(jié)合我國布病流行的優(yōu)勢菌株，才能更好更全面的用于我國布病的防控。

綜上所述，與單因子R血清、三勝黃素發(fā)生凝集且能夠被結(jié)晶紫染色的粗糙型變異羊種布魯氏菌分離株，全基因組測序表明，該分離株與羊種2型菌株相似性最高。其基因組由2條染色體組成，大小為3 311 700 bp，GC含量為57.2%，含有3 379個(gè)CDS，9個(gè)rRNA，55個(gè)tRNA和4個(gè)ncRNA。與參考基因組相比，該分離株存在282個(gè)變異，其中243個(gè)SNPs，39個(gè)InDel，變異率較低。已知的LPS合成基因中，8個(gè)存在錯(cuò)義突變，LPS合成受阻，導(dǎo)致分離株表型由光滑型變?yōu)榇植谛?。本研究為羊種布魯氏菌粗糙型變異菌株的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為布魯氏菌疫苗候選株的篩選提供新思路。

利益沖突：無