攀枝花市首例食源感染菌血癥病例中分離的烏撒拉茂沙門菌的生物學(xué)特征

陳 嫣，顧桂敏，龐載元，楊曉蓉，雷高鵬，封正娟，沈來紅，白永華，許學(xué)斌

2019年5月15日，我們從攀枝花市中心醫(yī)院1例臨床疑似膿毒血癥感染男性患者血液標(biāo)本中分離的1株腸道沙門菌(亞種Ⅰ)，通過形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)生化和血清學(xué)鑒定為烏撒拉茂沙門菌(SalmonellaUzaramo，1,6,14,25:z4,z24:-)，經(jīng)國內(nèi)同行驗(yàn)證和沙門菌血清型數(shù)據(jù)庫比對屬國內(nèi)首次分離并報(bào)道的食源性沙門菌的致病菌型和臨床血流感染病例，病例株耐藥和分子克隆特征有別于環(huán)境水源菌株?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1病例調(diào)查 患者為50歲男性，四川省攀枝花市人。2019年5月14日上午因房顫、高血壓、高血壓心臟病至四川省攀枝花市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療。入院體檢時(shí)體征正常，主訴午餐在院外米線店點(diǎn)食過1份米線(主料為加工熟制米線，其他葷素配料和輔食均不詳)，餐后回家取住院物品后即返回病房。15日凌晨(2點(diǎn))，患者經(jīng)過潛伏期后的急性發(fā)病期：高熱、寒顫、頭痛伴腹瀉、體溫達(dá)39.9 ℃、呼吸困難，實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞12.97×109/L(比值87.80%)；糞便性狀黃色水樣、紅細(xì)胞0～2個(gè)/高倍視野(HP)，白細(xì)胞30～50個(gè)/HP，隱血試驗(yàn)陽性；臨床緊急以黃連素口服和慶大霉素8萬單位肌注處置；1 h后患者體溫有所下降(39.0 ℃)、2 h后患者體溫突然升高(40 ℃)伴黃色水樣便伴里急后重、有惡心和嘔吐，臨床改施頭孢派酮/舒巴坦和泮托拉唑抑酸處置；第2 d(16日)患者體溫正常、無腹痛和里急后重、仍黃色水樣腹瀉伴惡心、嘔吐，醫(yī)囑繼續(xù)抗感染和蒙脫石散止瀉；第3 d(17日)主治醫(yī)生查房：病情好轉(zhuǎn)，白細(xì)胞7.53×109/L(比值84.10%)；第5 d(19日)患者體溫正常、無腹瀉，血培養(yǎng)報(bào)告檢出沙門菌、糞便培養(yǎng)未見沙門菌和志賀菌，臨床據(jù)此診斷為感染性腹瀉并發(fā)菌血癥，繼續(xù)以頭孢噻肟鈉聯(lián)合帕珠沙星、鹽酸小檗堿強(qiáng)化治療。第8 d(22日)患者體征正常，血常規(guī)正常，?？股兀坏? d(23日)二次血培養(yǎng)陰性。回顧性流行病調(diào)查：患者1個(gè)月內(nèi)無旅游史，家中無飼養(yǎng)寵物，直系親屬亦無不適。根據(jù)診斷病原菌的潛伏期判斷患者暴露源于不潔(或交叉污染)就餐環(huán)境，偶然攝入病原菌所致孤立、散發(fā)案例，調(diào)查中也未見后續(xù)和加工熟制米線相關(guān)病例，見圖1。

圖1 烏撒拉茂沙門菌血流感染病例的病程時(shí)間軸Fig.1 Timeline of course in cases of blood stream infection with Salmonella Uzaramo

1.2培養(yǎng)基、試劑和儀器 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD，北京路橋技術(shù)有限公司，北京)；腸道菌發(fā)酵雙糖管和沙門菌顯色瓊脂平板(無錫市賽微生物技術(shù)有限公司，無錫)；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2(生物梅里埃，法國)；沙門菌H抗原誘導(dǎo)培養(yǎng)基swarmagar和60種、130種沙門菌分型診斷血清(SSI，丹麥)；沙門菌分型智能導(dǎo)航系統(tǒng)(上海景學(xué)微生物應(yīng)用技術(shù)有限責(zé)任公司，上海)；抗生素藥敏定量測試板條(CMV3AGNF，賽默飛，美國)；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(TAKARA，日本)；低熔點(diǎn)瓊脂糖(伯樂，美國)，以上試劑和血清等均避光置10 ℃以下保存，有效期內(nèi)使用。PCR電泳儀和脈沖凝膠電泳儀(CHEF mapper system)與凝膠成像系統(tǒng)(GEL Doc2000，伯樂公司，美國)；菌液比濁儀(生物梅里埃，法國)；抗生素自動(dòng)分液和讀數(shù)系統(tǒng)(賽默飛，美國)。

1.3脈沖場凝膠電泳(PFGE) 按照PulseNet China技術(shù)方案規(guī)定的非傷寒沙門菌PFGE-XbaⅠ標(biāo)準(zhǔn)方法，完成2株烏撒拉茂沙門菌(四川攀枝花1株臨床血源；廣西南寧1株自然水體源)的酶切分型、凝膠電泳使用BioNumerics(Version 6.0)軟件進(jìn)行聚類分析。

1.4藥敏試驗(yàn) 檢測方法參考美國國家腸道病原菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)(NARMS，2014年度版)更新的9類14種抗生素和操作流程(SOP)及最低抑菌濃度(MIC)判讀標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)：頭孢西丁(FOX)、阿奇霉素(AZI)、氯霉素(CHL)、四環(huán)素(TET)、頭孢曲松(AXO)、阿莫斯林-克拉維酸(AUG2)、環(huán)丙沙星(CIP)、慶大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、頭孢噻呋(XNL)、磺胺異噁唑(FIS)、復(fù)方新諾明(SXT)、氨芐西林(AMP)、鏈霉素(STR)。多重耐藥菌(MDR)：至少同時(shí)耐3類以上抗生素的菌株。分別測試2株不同來源的烏撒拉茂沙門菌。

1.5基因表型 根據(jù)文獻(xiàn)的耐藥和毒力基因進(jìn)行引物合成(生工，上海)、PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測2株烏撒拉茂沙門菌的耐藥基因：β-內(nèi)酰胺酶類(blaTEM、blaOXA、blaSHV);磺胺類(sull、sul2、sul3、dfr);四環(huán)素類(tetA、tetB)；鏈霉素類(strA、strB、aadA);1類整合子(intll、qacEDI);毒力基因(inv4、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、spi4D、sopB、sciN、safB、viaB、stn、pltA)[1]。分別測試2株不同來源的烏撒拉茂沙門菌。

2 結(jié) 果

2.1菌株表型特征 菌株接種XLD經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落呈圓形、濕潤、邊緣光滑無色半透明、中心黑色；沙門菌顯色平板呈紫紅色、圓形、濕潤的菌落特征。分別挑選XLD和沙門菌顯色平板生長單個(gè)典型菌落穿刺接種腸道菌發(fā)酵雙糖管，36 ℃培養(yǎng)24 h：管1發(fā)酵甘露醇，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，尿酶陰性；管2蔗糖、吲哚陰性，動(dòng)力、硫化氫陽性，初步生化篩選符合沙門菌屬特征。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為沙門菌屬，見表1。

2.2血清學(xué)鑒定 分別使用哥倫比亞斜面和抗原誘導(dǎo)培養(yǎng)基配合丹麥沙門菌分型血清診斷菌株O、H抗原，其抗原式為1,6,14,25:z4,z24:-。依據(jù)最新公布的國際沙門菌抗原表[2]判斷為：烏撒拉茂沙門菌。經(jīng)四川省疾病預(yù)防控制中心驗(yàn)證復(fù)核，結(jié)果一致、后經(jīng)上海市疾病預(yù)防控制中心許學(xué)斌教授比對復(fù)核并經(jīng)沙門菌分型智能導(dǎo)航系統(tǒng)驗(yàn)證，均鑒定為烏撒拉茂沙門菌。

2.3藥敏試驗(yàn) 本次血流分離的烏撒拉茂沙門菌除對氯霉素中度敏感、對鏈霉素耐藥外，對其他抗生素菌敏感；環(huán)境水體的烏撒拉茂沙門菌屬M(fèi)DR：對頭孢噻呋和環(huán)丙沙星中度敏感；對四環(huán)素、頭孢西丁、氯霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑、萘啶酸、鏈霉素均耐藥，見圖2。

2.4基因表型 血流的烏撒拉茂沙門菌對5類耐藥基因除鏈霉素(strA、srtB、aad)外均為陰性，水源株對四環(huán)素(tetA、tetB)和鏈霉素(strA、strB、aad)耐藥基因陽性，耐藥基因結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致；血流烏撒拉茂沙門菌12個(gè)毒力基因均為陽性，水源株僅有6個(gè)為陽性(invA、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、sopB)，見圖2。

2.5PFGE 本次來自血流的人源型烏撒拉茂沙門菌和數(shù)據(jù)庫收錄來自廣西南寧市北溝湖分離的1株烏撒拉茂沙門菌通過酶切和電泳圖譜聚類分析比對，兩者的帶型存在較大差異，遺傳同源性僅有58%的相似度，見圖2。

圖2 烏撒拉茂沙門菌PFGE聚類分析(限制性內(nèi)切酶：XbaI)Fig.2 Cluster analysis based on PFGE of Salmonella Uzaramo (Restrictive Endochase:XbaI)

3 討 論

沙門菌血清型最新公布共2 659[3]。我國2006年至2014通過國際交流合作和技術(shù)引進(jìn)重新確認(rèn)人源和非人源沙門菌血清型有133個(gè)[2,4]。隨著國內(nèi)食物供應(yīng)鏈多樣化和食品安全機(jī)構(gòu)重視沙門菌風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，將有更多非傷寒沙門菌型被報(bào)道[5]。本次自臨床血流感染病例分離和鑒定的烏撒拉茂沙門菌經(jīng)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室復(fù)核和國內(nèi)醫(yī)學(xué)情報(bào)機(jī)構(gòu)查新證實(shí)屬國內(nèi)首次臨床報(bào)告病例?；谌蚪M測序的菌型確認(rèn)和數(shù)據(jù)分析另文報(bào)告。

本次烏撒拉茂病例源于當(dāng)?shù)匦⌒筒惋嫏C(jī)構(gòu)的食源性暴露，病菌經(jīng)口攝入經(jīng)消化道或腸內(nèi)粘膜入血致全身感染(嚴(yán)重可致膿毒血癥)，急性發(fā)作期導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，所幸患者正值原發(fā)性高血壓住院期間，醫(yī)護(hù)搶救及時(shí)否則存在休克死亡風(fēng)險(xiǎn)。診療初期慶大霉素肌注的措施值得商榷，未考慮肌注入血的慶大霉素直接作用于菌體成為內(nèi)毒素致熱源(菌體抗原)刺激體溫迅速升高的應(yīng)激后果。細(xì)菌性腹瀉不用抗生素治療對預(yù)后有保護(hù)性作用的最近實(shí)踐是2012年德國EHECO104病例[6]。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)(CLSI)建議對感染沙門菌病例應(yīng)限制使用氨基糖苷類藥物。國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室普遍對沙門菌感染相關(guān)病原學(xué)與診療能力不足，是導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)用藥的直接原因[7]。血培養(yǎng)證實(shí)本次感染的病原為烏撒拉茂沙門菌，我們通過國內(nèi)沙門菌血清型數(shù)據(jù)庫比對證實(shí)屬國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的人感染沙門菌型[3,5]，1株同型菌來自廣西南寧市的湖水。兩者耐藥性不同，臨床菌株對抗生素幾乎全敏感，而水源株為MDR，提示菌株在環(huán)境中有機(jī)會(huì)獲得更強(qiáng)耐藥性；基因型和分子型提示兩者的耐藥、毒力基因和遺傳相似性較低，臨床株毒力強(qiáng)而耐藥性低，環(huán)境株表型特征則相反。該病例為充實(shí)我國現(xiàn)有非傷寒沙門菌型多樣性和臨床診療及溯源研究有重要意義。該菌型的生物學(xué)特征和臨床病例類傷寒、類膿毒血癥的侵襲性癥狀值得同行關(guān)注，因?yàn)槿巳簩Ψ侵髁魃抽T菌型可能缺少保護(hù)性抗體而變得易感，個(gè)別罹患基礎(chǔ)性疾病的患者可能增加致死率。

烏撒拉茂沙門菌首次報(bào)道于1951年[2]。感染者病例多和養(yǎng)殖寵物蛇有關(guān)[8]。兒童是罕見血清型易感者緣于家養(yǎng)寵物(龜、蜥蜴、蛇)的接觸[9]。美國是烏撒拉茂病例最多的國家：2006-2016年有13例[10]。本次患者無寵物接觸史和外出旅游史，暴露源于不潔飲食，未能對病例溯源取證調(diào)查找到烏撒拉茂的源頭使本次的結(jié)論存在局限性：無法明確米線污染源于加工過程還是環(huán)境導(dǎo)致(交叉污染)。攀枝花地區(qū)處于四川省最南部，毗鄰云貴，氣候濕熱、水系發(fā)達(dá)，烏撒拉茂本地或外來輸入均有可能，期待通過后續(xù)省級(jí)和國家致病菌監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)分享信息、追溯源頭。

近10年我國的食物供應(yīng)逐漸從傳統(tǒng)自足自給型向全球化采購轉(zhuǎn)變，加之人口老齡化因素，必然加重更多的侵襲性、非傷寒沙門菌型病例的疾病負(fù)擔(dān)[11]。我國侵襲性沙門菌血清型病例提示甲魚和寵物龜?shù)扰佬袆?dòng)物中存在高致病性克隆、對抗生素多敏感[12-13]。烏撒拉茂沙門菌是我們首次證實(shí)國內(nèi)臨床血流感染的罕見沙門菌型病例，建議從城市健康角度出發(fā)，加強(qiáng)醫(yī)防結(jié)合和傳染病生態(tài)行為宣教，結(jié)合暴發(fā)病例溯源，做好生態(tài)學(xué)監(jiān)測，防控重點(diǎn)人群降低非傷寒沙門菌疾病負(fù)擔(dān)。

利益沖突：無