羊種布魯氏菌疫苗株P(guān)CR-RFLP鑒定方法的建立

馬曉菁，鐘 旗，葉 鋒，谷文喜，劉麗婭，馬俊杰，薛 晶，易新萍

（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

羊種布魯氏菌（Brucella melitensis）是引起綿羊和山羊布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡稱布?。┑闹匾≡?，導(dǎo)致母羊不孕及流產(chǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]，同時也可導(dǎo)致人感染，對人類公共安全造成巨大威脅。近年來的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，羊種布魯氏菌仍然是我國的主要流行菌株[2]。羊種布魯氏菌共有3種生物型（生物型1、2和3），均能感染綿羊和山羊，但在不同地區(qū)，存在優(yōu)勢生物型差異。

疫苗免疫是防控布病的重要手段。在布病流行地區(qū)進(jìn)行全群免疫是控制該病最適合的方式[3]。國際上普遍認(rèn)為，羊種布魯氏菌弱毒Rev.1活疫苗是預(yù)防綿羊和山羊布病的最佳疫苗。歐洲大部分國家以及亞洲的部分國家廣泛使用該疫苗，用于綿羊及山羊的布病防控[4]。羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1是由Elberg等[5]1957年將Brucella melitensis強(qiáng)毒株6056通過兩步篩選獲得的，具有鏈霉素抗性。目前疫苗株Rev.1與羊種布魯氏菌野菌株的鑒別主要依靠其生長特性，如Rev.1生長緩慢且菌落較小，具有鏈霉素抗性[6]。研究表明，疫苗株Rev.1的鏈霉素抗性與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因突變密切相關(guān)[7-9]。Axel等[10]對疫苗株Rev.1的rpsL基因進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，91位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

目的片段特定位點(diǎn)堿基突變常發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，造成酶切位點(diǎn)增加或消失，從而改變酶切性質(zhì)。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）就是利用這一特性，通過檢測致病基因已知的點(diǎn)突變進(jìn)行直接基因診斷，也可以此作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，從而進(jìn)行間接基因診斷。本研究以編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因?yàn)檠芯繉ο螅醚蚍N布魯氏菌疫苗株Rev.1的鏈霉素抗性且與rpsL基因突變相關(guān)這一特點(diǎn)，建立了一種快速、準(zhǔn)確鑒定羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的 PCR-RFLP方法，為今后區(qū)分疫苗株Rev.1免疫與羊種布魯氏菌自然感染提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 羊種布魯氏菌減毒活疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M：均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛種布魯氏菌疫苗株A19、pUC-19K、大腸桿菌E.coliDH5α克隆菌株：均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 Brucella broth培養(yǎng)基和Brucella agar培養(yǎng)基：購自美國BD公司；PCR mix：購自北京莊盟生物技術(shù)有限公司；NciI限制性內(nèi)切酶：購自NEB公司；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒：購自Promega公司。

1.1.3 引物 根據(jù)Genbank已公開發(fā)表羊種布魯氏菌株16M序列（AE008917），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)rpsL基因相應(yīng)的引物序列。上游引物RpslF：CATGAAGCGTCAGCTTCCTCT；下游引物RpslR：CTTGCCATGAAGCATGACTGGCA。擴(kuò)增片段為681 bp。委托上?；瞪镉邢薰竞铣?。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌AMOS-PCR鑒定 以羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯氏菌疫苗株A19基因組DNA為模板，按照參考文獻(xiàn)[11]中的AMOS-PCR方法，組合插入序列IS711、牛種布魯氏菌（1.2.3a型）、牛種布魯氏菌（5.6.9.3b型）以及羊種布魯氏菌（1.2.3型）。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，40 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.2 羊種布魯氏菌rpsL基因擴(kuò)增 以羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M基因組DNA為模板，以RpslF和RpslR為引物，PCR擴(kuò)增rpsL基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物切膠回收與pMD19-T載體混勻后，置4 ℃連接過夜、轉(zhuǎn)化、鋪板，37 ℃恒溫培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌落于含Amp+（50 mg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒送上海生工測序。

1.2.3rpsL基因PCR產(chǎn)物NciI酶切 分別將羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M 的rpsL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 37 ℃ 2 h酶切，其中 NciI酶 0.5 μL、10×NEBuffer 1 μL、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，滅菌水補(bǔ)足至10 μL。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌AMOS-PCR鑒定

對羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M、牛種布魯氏菌疫苗株A19進(jìn)行AMOS-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌A19擴(kuò)增出498 bp條帶，羊種布魯氏菌Rev.1和16M均擴(kuò)增出731 bp條帶（圖1）。

2.2 rpsL基因擴(kuò)增

羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16M分別擴(kuò)增rpsL基因，均獲得681 bp條帶（圖2），與目的片段大小一致。測序結(jié)果與Genbank發(fā)表rpsL基因序列一致。

2.2 PCR產(chǎn)物NciI酶切

分別將羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯

圖1 布魯氏菌AMOS-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 rpsL基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

氏菌標(biāo)準(zhǔn)株16MrpL基因的PCR產(chǎn)物NciI酶切，電泳后可見標(biāo)準(zhǔn)株16M出現(xiàn)384 bp條帶，疫苗株Rev.1出現(xiàn)500 bp左右條帶（圖3）。

3 討論

羊種布魯氏菌的自然宿主是成年山羊和某些品種綿羊，能夠引起綿羊和山羊布病的發(fā)生和流行。牛種布魯氏菌和豬種布魯氏菌也會造成綿羊和山羊感染，但幾乎未見臨床病例[12]。近年來有報(bào)道顯示，牛乳中能分離到羊種布魯氏菌[13]，因此羊種布魯氏菌不僅對畜牧業(yè)發(fā)展造成威脅，同時影響人類健康。在布病防控和根除過程中，疫苗免疫具有重要意義。在我國，對羊免疫常選用弱毒活疫苗豬種布魯氏菌S2

[14-15]。但國際上公認(rèn)，羊種布魯氏菌Rev.1是用于羊布病防控最有效的疫苗，在希臘、約旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等國家具有顯著的布病防控效果[16]，但免疫后的鑒別診斷成為亟待解決的問題。

圖3 rpsL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物NciI酶切

羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1為羊種1型布魯氏菌，與近年來我國主要流行的羊種3型布魯氏菌存在型的差異。目前AMOS-PCR方法能夠快速將羊種布魯氏菌與其它種型布魯氏菌區(qū)分，但羊種布魯氏菌型的鑒定依靠染料抑制、單項(xiàng)特異性血清凝集，以及噬菌體試驗(yàn)結(jié)果判定，不僅耗時，而且增大了操作人員感染風(fēng)險(xiǎn)。

生物型的判定也無法最終區(qū)分疫苗株與野株。RFLP分析是以DNA指紋圖譜為基礎(chǔ)用于微生物分型鑒定的方法。Jensen[17]等利用該方法證實(shí)RB51菌株與其它牛種布魯氏菌株不同。Ridler[18]等用限制性內(nèi)切酶SwaI消化綿羊附睪種布魯氏菌進(jìn)行電泳后發(fā)現(xiàn)綿羊附睪種存在變種。在我國，駱利敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豬種與犬種菌之間關(guān)系密切。

4 結(jié)論

本研究利用疫苗株Rev.1 編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因片段CCG突變?yōu)镃TG，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)NciI缺失，建立了羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的PCR-RFLP鑒定方法，可以快速、特異地區(qū)分羊種布魯氏菌疫苗株與野株。

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