浙江省一規(guī)模豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌的分離鑒定

周 蕾，虞一聰，董建斐，柴 娟，王雅婷，劉愛軍，謝榮輝，倪柏鋒，張傳亮，趙靈燕，桂平雄

（浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310018）

副豬嗜血桿菌（Haemofhilus parasuis，Hps）是巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的，體積較小、不運(yùn)動(dòng)、多形性（從單球桿菌到絲狀鏈）革蘭氏陰性菌，在巧克力瓊脂平板培養(yǎng)1～3 d后，產(chǎn)生小的、棕色至灰白色菌落，在血平板上（含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），產(chǎn)生小的、半透明、不溶血菌落[1]，是定殖于仔豬上呼吸道的一種常在菌。仔豬出生后可通過分娩時(shí)與母豬接觸而感染Hps。家豬和野豬是該菌當(dāng)前已知的僅有宿主[1-2]。早在1910年，德國科學(xué)家Gl?sser在患有纖維素性漿膜炎的病豬滲出液中發(fā)現(xiàn)了該菌。1969年，Biberstein和White證實(shí)該菌在生長時(shí)不需要X因子（氯化高鐵血紅素），并將其命名為副豬嗜血桿菌[1]。2017年12月，浙江省杭州市蕭山區(qū)一規(guī)模豬場(chǎng)保育舍豬群出現(xiàn)高熱（41.5 ℃）、咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹伴有跛行和被毛粗亂等臨床癥狀，為明確病原，對(duì)2頭死病豬的肺臟進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定。

1 材料

1.1 設(shè)備

LH11 CO2培養(yǎng)箱：購自Thermo scienti fi c公司；Scope A1顯微鏡：購自ZEISS公司；1300 Series A2生物安全柜：購自Thermo scienti fi c公司；Research plus移液器：購自Eppendorf公司；Thermo Mixer C恒溫混勻儀：購自Eppendorf公司；5424離心機(jī)：購自Eppendorf公司；Speed Cycler2 PCR儀：購自Analytik jena公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

血瓊脂平板、巧克力平板：購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；革蘭氏染色液試劑盒：購自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氧化酶試劑：購自杭州怡丹生物技術(shù)有限公司；Ex Taq酶：購自TaKaRa；QIAamp?DNA純化試劑盒-Mini：購自QIAGEN；引物和探針：由上海生工公司合成。

1.3 樣本來源

2017年12月21日，對(duì)浙江省杭州市蕭山區(qū)某規(guī)模豬場(chǎng)2頭40日齡病死保育豬進(jìn)行剖檢，無菌采集2份肺臟病變樣品（編號(hào)為肺1、肺2）做細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離和純化

2.1.1 細(xì)菌分離 無菌操作，切開肺臟病變組織，用接種環(huán)刮取病料接種于血平板，再用金黃色葡萄球菌作交叉劃線，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.1.2 細(xì)菌純化 挑取單個(gè)可疑菌落接種于巧克力平板，37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 菌落形態(tài) 于血平板上培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。

2.2.2 細(xì)菌形態(tài)及染色特性 挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色情況。

2.2.3 V因子需要測(cè)定 將可疑菌株純培養(yǎng)物接種于血平板（方法同2.2.1）。

2.2.4 過氧化氫酶試驗(yàn) 在潔凈的載玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接種環(huán)挑取適量的可疑菌與H2O2溶液混勻，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

2.2.5 氧化酶試驗(yàn) 用滅菌濾紙條刮取待檢細(xì)菌純培養(yǎng)物，并在上面滴1滴氧化酶試劑，10～30 s內(nèi)觀察結(jié)果。

2.2.6 PCR檢測(cè) 根據(jù)逯忠新等[3]的方法，合成特異性引物。F1：TAT CGG GAG ATG AAA GAC；F2：GTA ATG TCT AAG GAC TAG；Revx：GAC GAA GCC GCG AGG。 用 DNA 純化試劑盒，提取待檢Hps可疑菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸，分別作為PCR模板和陽性對(duì)照。擴(kuò)增體系為：Taq 酶 0.12 μL，dNTPs 2 μL，F(xiàn)1、F2 引物各0.2 μL，Revx 引物 0.4 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 10.08 μL，DNA模板5 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 1 min，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離

在肺2樣品中分離到Hps可疑菌株，編號(hào)為ZJYK-01235。

3.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查

3.2.1 菌落形態(tài) 培養(yǎng)24 h后，血平板上呈現(xiàn)半透明、不溶血小菌落，直徑為0.5～1 mm?？拷瘘S色葡萄球菌菌苔的菌落較大，隨著與葡萄球菌生長線距離的增加而變小或不生長，呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”（圖1）。

圖1 初分離情況

3.2.2 細(xì)菌形態(tài) 涂片、革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性、短小桿菌，呈多形態(tài)，從球桿狀到絲狀鏈（圖2）。

圖2 ZJYK-01235菌株顯微鏡下形態(tài)

3.3 V因子需要測(cè)定

可疑菌株（ZJYK-01235）在血平板上生長有“衛(wèi)星現(xiàn)象”（圖1），表明該菌株需要V因子。

3.4 過氧化氫酶、氧化酶試驗(yàn)

ZJYK-01235菌株過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性。

3.5 PCR檢測(cè)

對(duì)ZJYK-01235菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一條1 090 bp大小條帶，表明該菌株為Hps（圖3）。

圖3 ZJYK-01235菌株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

3.6 結(jié)果判定

綜合分析ZJYK-01235菌株的菌落形態(tài)、生長特性、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查情況和PCR檢測(cè)結(jié)果，可以判定該菌株為Hps。

4 討論

Hps可導(dǎo)致原發(fā)性或繼發(fā)性呼吸道疾病，但在免疫抑制情況下能夠侵入機(jī)體，擴(kuò)散到機(jī)體其他部分，因而可從全身各部位分離獲得[1]。浙江省流行的Hps血清型主要為5/12型、4型、13型和14型，部分豬場(chǎng)還存在2種血清型共感染現(xiàn)象[4]。健康狀態(tài)下，仔豬在受母源抗體保護(hù)時(shí)可出現(xiàn)Hps定居，而且在定居菌與仔豬免疫之間達(dá)成平衡。當(dāng)室內(nèi)溫度不穩(wěn)定、通風(fēng)不良、早期斷奶，以及存在其他病原體感染或豬群中引進(jìn)了Hps毒力菌株或新毒力菌株時(shí)，這種平衡便被打破，從而引起本病發(fā)生。Hps可影響2周齡到4月齡的豬，主要導(dǎo)致斷奶后和保育階段的豬發(fā)病，通常見于5～8周齡仔豬，發(fā)病率一般在10%～15%之間，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂，主要剖檢病變?yōu)槔w維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等[5]。

Hps在生長過程中需要V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），可在巧克力瓊脂平板和含NAD的TSA平板上生長。該菌雖然在普通血平板上不能生長，但如果將其接種在能夠提供V因子來源的葡萄球菌劃線血平板上進(jìn)行培養(yǎng)，在靠近葡萄球菌菌苔附近能夠生長，并呈現(xiàn)特征性的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。在臨床病料初分離時(shí)，可以利用這一特點(diǎn)，挑取可疑菌落作進(jìn)一步純化和鑒定，這有助于提高該菌的分離率。在Hps初分離時(shí)，初學(xué)者不宜直接使用巧克力平板和TSA平板。因?yàn)樵谶@兩種培養(yǎng)基上，Hps菌落特征并不明顯，很難與其他雜菌菌落區(qū)分開。在Hps純化培養(yǎng)時(shí)，可選用巧克力平板或TSA平板。

在Hps鑒定時(shí)要重視形態(tài)學(xué)檢查，并做初步的生化試驗(yàn)，對(duì)符合Hps特點(diǎn)的可疑菌株進(jìn)一步做PCR檢測(cè)，然后綜合形態(tài)學(xué)、生化特性和PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)分離菌株作出最終鑒定結(jié)果。

值得注意的是，Hps也是豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）的病原體之一。采用抗生素防治是控制保育階段Hps、豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌等細(xì)菌繼發(fā)/混合感染的有效手段，是減少豬群死淘率的重要措施。

5 結(jié)論

本研究剖檢2頭具有Hps感染癥狀病死豬，可見纖維素性肺炎和心包積液；將肺臟病料接種于血平板，并用金黃色葡萄球菌作交叉劃線，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，其中一份病料分離到呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”生長的Hps可疑菌落。挑取可疑菌落純化培養(yǎng)鏡檢，發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陰性短小桿菌，呈多形態(tài)。氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性，過氧化氫酶試驗(yàn)為陽性。提取該菌株DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一條1 090 bp條帶。綜合病豬臨床癥狀、剖檢變化和分離菌株的形態(tài)學(xué)檢查、生化試驗(yàn)及PCR檢測(cè)結(jié)果，證明該分離株為Hps。

[1] ZIMMERMAN J J，KARRIKER L A，RAMIREZ A，et al.豬病學(xué)[M]. 10版. 趙德明，張仲秋，周向梅，等主譯.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2014：795-803.

[2] 蔣增海，徐耀輝，鄧同煒，等. 副豬嗜血桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（6）：124-128.

[3] 逯忠新，賀英，儲(chǔ)岳峰，等. 副豬嗜血桿菌PCR檢測(cè)方法：NY/T2417-2013[S]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2014.

[4] 江軍，姜平，王一成，等. 浙江省副豬嗜血桿菌血清型調(diào)查及其潛在毒力相關(guān)基因分析[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2016，48（8）：1-7.

[5] 蔡旭旺，劉正飛，陳煥春，等. 副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（1）：55-58.