沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品的研制

彭國(guó)瑞，魏財(cái)文，張 媛，王秀麗，李 建，辛凌翔，張一幟，彭小兵，李俊平

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌病是由馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌（Salmonella abortus equi）引起的一種以懷孕馬屬動(dòng)物流產(chǎn)為特征的傳染病，能引起地方性流行。初產(chǎn)母馬和幼駒對(duì)其最易感，幼駒感染后多呈敗血癥或局部炎癥，公畜則為睪丸炎或鬐甲瘺。易感性馬群一旦傳入此病，則可引起母馬暴發(fā)性大批流產(chǎn)。目前，對(duì)該病的診斷常采用沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)這一方法均做了規(guī)范，其中抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清是沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)的關(guān)鍵性物質(zhì)。為保證診斷試劑的質(zhì)量，確保診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2015年版）和《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》（2000年版）規(guī)定，這幾種試劑的半成品和成品檢驗(yàn)需使用沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品。

本研究按照2015年版《獸藥典》和2000年版《獸用生物制品規(guī)程》有關(guān)規(guī)定，結(jié)合以往各批次沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品的制備標(biāo)定報(bào)告及實(shí)踐，進(jìn)一步提高了該參考品的制備、標(biāo)定和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，完成了多批次參考品的制備，同時(shí)對(duì)參考品的保存期內(nèi)穩(wěn)定性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，并將其應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)和檢驗(yàn)。

1 材料

1.1 菌種

馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌C77-1株（CVCC79001）：由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備、鑒定和保管。

1.2 血清、培養(yǎng)基及試劑

效價(jià) 1∶1 600、1∶3 200 和 1∶6 400 沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清參考品（簡(jiǎn)稱(chēng)陽(yáng)性血清參考品，批號(hào)200601）、陰性血清參考品（簡(jiǎn)稱(chēng)陰性血清，批號(hào)201301）和沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品（簡(jiǎn)稱(chēng)抗原參考品，批號(hào)201101）：由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和標(biāo)定；沙門(mén)氏菌屬因子血清O4和H-enx：購(gòu)自丹麥國(guó)立血清中心。普通瓊脂、普通肉湯、TG和TSB等培養(yǎng)基：購(gòu)自北京中海生物科技有限公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 其他

細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管：由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 方法

2.1 生產(chǎn)用菌種制備

開(kāi)啟馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌C77-1株凍干菌種，接種普通肉湯，37 ℃培養(yǎng)24 h；劃線(xiàn)接種普通瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h；選擇典型光滑菌落移植于普通瓊脂斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.2 生產(chǎn)用菌種鑒定

（1）一般形態(tài)學(xué)和生化特性檢查；（2）用沙門(mén)氏菌屬因子血清O4和H-enx進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，檢查生產(chǎn)菌種的血清學(xué)特性；（3）用玻片凝集方法在1∶500吖啶黃溶液中進(jìn)行變異檢查；（4）用生理鹽水和1∶200倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清參考品進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)[1]。

2.3 抗原制備

將檢驗(yàn)合格的種子轉(zhuǎn)接普通瓊脂，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；用生理鹽水將菌苔洗下，收集于帶有玻璃珠的瓶中，搖碎菌塊，用滅菌紗布漏斗過(guò)濾；按總體積的1%加入甲醛溶液，37 ℃滅活48 h后，接種普通肉湯和普通瓊脂進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。

2.4 抗原濃度檢定

對(duì)檢驗(yàn)合格的抗原充分振搖后，取部分抗原用含1%甲醛溶液的生理鹽水作適當(dāng)比例稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取6.0 mL，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)比色卡與1.0×1010CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管比較，直至與細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管一致，根據(jù)最終稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)抗原濃度。

2.5 抗原配制

用含1 %甲醛溶液的生理鹽水調(diào)整抗原濃度至2.0×1011CFU/mL，按10 mL/瓶分裝，加蓋密封，

2～8 ℃保存。

2.6 抗原檢驗(yàn)

2.6.1 性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)和裝量檢查 依據(jù)2015年版《獸藥典》進(jìn)行[2]。

2.6.2 效價(jià)測(cè)定 將效價(jià)為1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的陽(yáng)性血清參考品及陰性血清參考品，分別稀釋到 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400……1∶6 400稀釋度。取各稀釋度血清2.0 mL，分裝于2支試管，每支1.0 mL，組成2列。一列中，每管加入1∶20稀釋的新制抗原1.0 mL，另一列每管加入1∶20稀釋的抗原參考品1.0 mL。另在2支僅加1.0 mL生理鹽水的試管，分別加入1∶20稀釋的新制抗原和抗原參考品作為對(duì)照，觀察是否有自凝現(xiàn)象。將各組試管振搖混勻，37 ℃反應(yīng)20 h后，室溫靜置2 h，進(jìn)行觀察，按最終稀釋度記錄結(jié)果。2.7 穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)

對(duì) 2～8 ℃條件下保存1、1.5、2和2.5年的抗原按照2.6的方法進(jìn)行檢驗(yàn)[3]。

3 結(jié)果

3.1 生產(chǎn)用菌種制備及鑒定

經(jīng)鑒定，該菌種為革蘭氏陰性小桿菌，其生化特性符合沙門(mén)氏菌屬特性，血清學(xué)特性檢查及變異檢查均合格（表1）。

表1 血清型特性和變異檢查結(jié)果

3.2 抗原制備

該菌在普通瓊脂上純粹生長(zhǎng)，收獲的滅活菌液在普通肉湯和普通瓊脂中無(wú)菌生長(zhǎng)。

3.3 抗原濃度檢定

抗原原液稀釋至35倍時(shí)與細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管一致，即抗原濃度為3.5×1011CFU/mL。

3.4 抗原檢驗(yàn)

3.4.1 性狀 本品為均勻混懸液，靜置后，底部有少量沉淀。

3.4.2 無(wú)菌檢驗(yàn) 抗原接種培養(yǎng)基后均無(wú)菌生長(zhǎng)，

無(wú)菌檢驗(yàn)合格（表2）。

表2 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

3.4.3 裝量檢查 隨機(jī)抽取5瓶，裝量均不低于10 mL。

3.4.4 效價(jià)測(cè)定 按照2015年版《獸藥典》馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌凝集試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清附注“凝集反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)”觀察記錄結(jié)果。被檢抗原和抗原參考品與3份陽(yáng)性血清參考品的凝集價(jià)均一致，且與陽(yáng)性血清參考品的原凝集價(jià)一致，與1∶200稀釋的陰性血清均不發(fā)生凝集，并在生理鹽水對(duì)照管中無(wú)自凝現(xiàn)象（表3）。

表3 抗原效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3.5 保存期間穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)

在監(jiān)測(cè)期內(nèi)該抗原檢驗(yàn)結(jié)果同3.4，性質(zhì)穩(wěn)定。

4 討論與結(jié)論

利用沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)對(duì)沙門(mén)氏菌引起的馬流產(chǎn)進(jìn)行診斷[4-5]，是目前最為常用的血清學(xué)方法之一，其他諸如LAMP[6]、PCR等核酸檢測(cè)方法目前尚未得到推廣。沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)所用抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清等試劑的質(zhì)量直接關(guān)系到診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此建立沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)國(guó)家參考品，對(duì)于該診斷制品的質(zhì)量控制具有重要意義。

用本文所述方法制備并用3種效價(jià)陽(yáng)性參考血清標(biāo)定的沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原參考品，較用2種效價(jià)血清標(biāo)定的抗原效價(jià)更為準(zhǔn)確，在性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定等方面符合2015年版《獸藥典》和2000年版《獸用生物制品規(guī)程》中關(guān)于沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原制備、標(biāo)定和檢驗(yàn)的規(guī)定。該參考品性質(zhì)穩(wěn)定、品質(zhì)良好，能夠滿(mǎn)足沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清和陰性血清參考品的標(biāo)定及沙門(mén)氏菌馬流產(chǎn)凝集試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清的成品、半成品檢驗(yàn)的實(shí)際生產(chǎn)和使用要求，可以作為抗原參考品用于獸用生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

[1] 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì). 中華人民共和獸用生物制品規(guī)程（2000年版）[A]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2000.

[2] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典：2015年版，三部[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2016.

[3] 康凱. 馬流產(chǎn)凝集抗原及凍干陽(yáng)性血清的保存期試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸藥雜志，1996（3）：32-34.

[4] 農(nóng)業(yè)部. 馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌病診斷技術(shù)：NY/T 570-2002[S]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2002.

[5] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 馬流產(chǎn)沙門(mén)氏菌病凝集試驗(yàn)方法：SN/T 1382-2004[S]. 北京：國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2004.

[6] 王福厚，張進(jìn)隆，劉根新，等. 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）-檢測(cè)沙門(mén)氏菌[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2011，28（5）：44-46.