裂解氣相色譜-質(zhì)譜法分析土壤有機質(zhì)的化學(xué)組成

蔣逸凡 喻文娟 王姣嬌 康宏樟

摘?要?土壤有機質(zhì)（SOM）是土壤的重要組成部分，對土壤的肥力、水分含量等各種性質(zhì)具有重要作用。本研究采集了中國東部7個地區(qū)不同深度的土壤，采用直接進(jìn)樣-熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法（Py-GC/MS，直接進(jìn)樣法）和四甲基氫氧化銨衍生-熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法（TMAH-Py-GC/MS，TMAH衍生法），對土壤有機質(zhì)進(jìn)行了定性和半定量分析。TMAH衍生法采用25%TMAH的甲醇溶液浸沒24 h進(jìn)行衍生化，選擇DB-5 ms（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）色譜柱進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，測試條件與直接進(jìn)樣法相同。TMAH衍生法和直接進(jìn)樣法分別鑒定出261種和117種土壤有機質(zhì)的標(biāo)識物，TMAH衍生法檢測到的物質(zhì)種類更多、結(jié)構(gòu)更多樣，顯著提高了木質(zhì)素類和脂質(zhì)類標(biāo)識物的數(shù)目。兩種方法檢測出的各類物質(zhì)含量也存在差異，直接進(jìn)樣法中多糖（28%）、脂質(zhì)（22%）占比較高;TMAH衍生法中脂質(zhì)（33%）含量較高，其它類物質(zhì)除酚類化合物外，含量均接近10%。烷烴、烯烴、脂肪酸等物質(zhì)的色譜峰保留時間與碳原子數(shù)之間線性關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.95。 同時還對比了兩種方法所獲得的六大類物質(zhì)百分含量隨土壤深度與緯度變化規(guī)律的異同。

關(guān)鍵詞?土壤有機質(zhì); 四甲基氫氧化銨; 化學(xué)組成; 熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法

1?引 言

土壤有機質(zhì)（SOM）是土壤中所有含碳有機物的總稱，主要包括動植物殘體、微生物及其分解和合成的各種有機物。土壤中的有機質(zhì)含量雖然很低，但對土壤的肥力、水分含量、微生物活動都具有重要作用。由于土壤有機質(zhì)的總含碳量巨大（其數(shù)值高于大氣和植被含碳的總和），能夠顯著影響大氣二氧化碳濃度和全球氣候，因而受到廣泛關(guān)注[1]。

目前，研究土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的方法包括X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)譜（XANES）[2]、熱裂解場電離質(zhì)譜（Py-FIMS）[3]、核磁共振（NMR）[4]等技術(shù)。XANES是研究分子化學(xué)結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的有效工具， 利用不同元素有不同的吸收邊能量的原理，分析物質(zhì)的局域結(jié)構(gòu)和局域電子特性，在礦物土壤的研究中可以分析碳和氮的形態(tài)構(gòu)成[5]。Py-FIMS能夠非靶向表征主要的土壤有機質(zhì)，被認(rèn)為比熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法（Py-GC/MS）在定量分析方面更具優(yōu)勢。但是， 在化合物的具體鑒定方面，Py-FIMS鑒定種類相對偏少[6]。NMR的原理是在磁場內(nèi)的原子核吸收能量產(chǎn)生核磁共振，由電子云差異產(chǎn)生特征化學(xué)位移，進(jìn)而對物質(zhì)進(jìn)行鑒定。固態(tài)13C核磁共振波譜在研究土壤有機質(zhì)中較為常用，其優(yōu)點是能夠直接分析土壤樣品中的化學(xué)組成，避免提取過程中如熱解、萃取等帶來的物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使分析結(jié)果更為真實[7]， 但僅能獲取碳骨架信息，無法獲得分子單體信息[8]。

直接進(jìn)樣-熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法（Py-GC/MS，直接進(jìn)樣法）是研究土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的重要手段之一[9]。該方法通過高溫裂解的辦法，使有機質(zhì)中的生物大分子裂解為可揮發(fā)的小分子，導(dǎo)入到GC/MS系統(tǒng)中進(jìn)行分析，依據(jù)裂解產(chǎn)物的定性（質(zhì)譜圖，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜庫）和定量（峰面積百分含量）信息，結(jié)合產(chǎn)物歸屬，研究土壤有機質(zhì)的化學(xué)組成。由于各種物質(zhì)在相同條件下進(jìn)行熱裂解，所產(chǎn)生的各種碎片的相對分子質(zhì)量及其含量均穩(wěn)定，因此該方法具有很好的可重復(fù)性[10]。

直接進(jìn)樣法自身也存在一些缺點，其中最顯著的是難以檢出極性較大的物質(zhì)。普通的非極性色譜柱難以吸附帶有氨基、羥基、羧基的極性物質(zhì)，同時相較其它物質(zhì)而言，這些物質(zhì)更難揮發(fā)[11]。為了解決這一問題，本研究采用了一種衍生化法對樣品進(jìn)行處理，即使用四甲基氫氧化銨（TMAH）將酚類與脂肪酸中的羥基甲基化[12]，轉(zhuǎn)化為甲氧基。四甲基氫氧化銨衍生-熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜法（TMAH-Py-GC/MS，TMAH衍生法）在檢測土壤脂肪酸（FAs）方面效果突出[13]。另外，由于TMAH衍生法在檢測木質(zhì)素（Lignin）、角質(zhì)中的優(yōu)勢[14]，以及在研究單寧類物質(zhì)時，因其操作簡便和效果突出，受到了越來越多的關(guān)注[15]。目前， 已有一些利用直接進(jìn)樣法或者TMAH衍生法研究土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的報道，但很少有研究同時利用這兩種方法綜合獲取更全面的土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的信息，并對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的比較。

由于緯度不同， 植被組成、溫度、降水、光照等環(huán)境差異，可能對土壤有機質(zhì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而產(chǎn)生有機質(zhì)組成差異。在不同地區(qū)選擇統(tǒng)一的栓皮櫟樹種（東亞分布最廣樹種之一），能夠有效去除不同優(yōu)勢樹種對土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的影響，從而集中探討區(qū)域尺度上其它環(huán)境因素的影響。本研究以緯度梯度上不同深度的栓皮櫟次生林土壤樣品為研究對象，對直接進(jìn)樣法和TMAH衍生法的定性與定量結(jié)果進(jìn)行比較與考察。同時， 因兩種方法樣品處理方式和目標(biāo)化合物的差異，其分析結(jié)果可互相彌補，從而更加全面地分析土壤有機質(zhì)化學(xué)組成隨緯度和土壤深度的變化規(guī)律。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

EGA/PY-3030D熱裂解儀（PY， 日本Frontier公司）; 7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS， 美國Agilent公司）。

分析純TMAH（25%的甲醇溶液， 上海阿拉?。ˋladdin）公司）。

2.2?取樣時間、地點與方法

土壤樣品于2014年7月在中國東部的7個地區(qū)被采集，緯度跨越從北京（40.25°N， 117.12°E）至江西（29.09°N， 115.62°E）。所有地點均為天然次生栓皮櫟森林，在至少50年內(nèi)未受過人類直接活動以及野火的干擾。按照美國農(nóng)業(yè)部土壤分類標(biāo)準(zhǔn)，這些土壤可分為3個土壤目：北京平谷（PG）、河北易縣（HYS）和河北邢臺（BA）為新成土，安徽宿州（HZY）和河南信陽（XY）為始成土，安徽黃山（HS）和江西永修（YS）為老成土[16]。

每一個取樣地點建立3個平行橫斷面，每一個橫斷面之間間隔20 m，一個橫斷面上每隔5 m設(shè)立1個取樣點，共設(shè)立10個取樣點。在每個取樣點的0～2 cm、 2～5 cm、 5～10 cm、 10～20 cm深度分別采集土樣，并按橫斷面混合，每個取樣地點共采集12個樣品（4個深度 × 3個重復(fù)），總樣品數(shù)為84個（12個樣品 × 7個取樣地）。

2.3?樣品處理

在直接進(jìn)樣法中，針對每一個樣品，均勻稱取5 mg風(fēng)干過篩的土樣，倒入儀器專用的鋁坩堝中，插入樣品固定鉤后放入儀器中，上機測試。

在TMAH衍生法中，針對每一個樣品，均勻稱取5 mg風(fēng)干過篩的土樣，倒入儀器專用的鋁坩堝中，加入20 μL TMAH含量為25%的甲醇溶液，使樣品完全被浸沒，反應(yīng)24 h后，上機測試。

2.4?測試條件

直接進(jìn)樣法與TMAH衍生法采用相同的測試條件。EGA/PY-3030D熱裂解儀（PY）與氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）聯(lián)用; 裂解條件： 單擊模式，600℃瞬間裂解; 色譜柱： DB-5ms（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）; 進(jìn)樣溫度： 300℃; 分流比： 20∶1; 載氣： 氦氣（99.999%）; 流量： 1 mL/min; 柱溫： 40℃保持5 min， 以5℃/min升至310℃，保持5 min; 接口溫度： 300℃; 離子源溫度： 230℃; 四極桿溫度： 150℃; 電離方式： EI+，70 eV; 檢測器電壓： 1438 V; 掃描方式： 全掃描; 溶劑延遲： 2 min; 掃描范圍： 20～500; 標(biāo)準(zhǔn)譜庫： NIST 2014譜庫。

2.5?數(shù)據(jù)分析

在定性分析中，由于土壤有機質(zhì)裂解產(chǎn)物組成復(fù)雜，因此本研究主要采用以下3種方法對裂解產(chǎn)物進(jìn)行定性分析： （1）將裂解產(chǎn)物質(zhì)譜圖的特征離子峰與文獻(xiàn)和NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比對，選取比對結(jié)果中系統(tǒng)匹配度較高（大于800）或關(guān)鍵質(zhì)譜碎片能夠互相匹配的化合物; （2）檢索了近百篇相關(guān)文獻(xiàn)，提煉了6篇含有大量化合物質(zhì)譜碎片的文章[17～22]，將其中的化合物關(guān)鍵質(zhì)譜碎片信息提取出來，自建一個包含278種物質(zhì)質(zhì)譜信息的數(shù)據(jù)表格進(jìn)行人工比對，以彌補NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)譜庫所含化合物質(zhì)譜信息有限的缺陷，拓寬了化合物的檢測范圍; （3）基于現(xiàn)階段木質(zhì)素裂解產(chǎn)物還未被全部確認(rèn)的問題，除了檢索文獻(xiàn)以外，本研究使用純木質(zhì)素樣品進(jìn)行衍生化裂解，構(gòu)建出木質(zhì)素裂解產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，為木質(zhì)素的歸類提供可靠的參考依據(jù)。本研究將所有已鑒定的物質(zhì)分為6個大類： 木質(zhì)素（Lignin）、脂質(zhì)（Lipid）、含氮化合物（N-bearing）、多糖（Polysaccharide）、非木質(zhì)素的芳香族（Non-lignin aromatic）和酚類（Phenol），并記錄了各檢出物質(zhì)的化學(xué)名稱、化學(xué)式、結(jié)構(gòu)式、所屬大類、保留時間以及相對分子質(zhì)量。

定量分析采用半定量分析法，即以某一特征化合物的峰面積除以所有檢出的化合物峰面積之和，記為其相對百分比。再將各類物質(zhì)的裂解產(chǎn)物含量相加，獲得其在土壤有機質(zhì)中的含量。

對于上述分析后所得的數(shù)據(jù)，本研究使用Origin軟件（OriginLab， Hampton， USA）進(jìn)行了保留時間與碳原子數(shù)目的線性回歸分析，使用SPSS軟件（IBM SPSS， Armonk， USA）進(jìn)行了方差分析和Duncan兩兩比較，用SIMCA-P軟件（Umetrics， Ume， Sweden）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。

3?結(jié)果與討論

3.1?TMAH衍生法與直接進(jìn)樣法的對比

3.1.1?色譜圖的比較?選取YS樣地0～2 cm深度的土壤樣品，將兩種方法所獲得的有機質(zhì)色譜圖進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，TMAH衍生法所得到的色譜峰整體響應(yīng)高于直接進(jìn)樣法所得的色譜峰，表明TMAH衍生法的靈敏度更高（圖1）。這與Chefetz等[12]在利用兩種方法分析土壤有機質(zhì)腐殖酸時得出的結(jié)果類似。

3.1.2?定性與定量結(jié)分析果的比較?表1列出了兩種方法在各類物質(zhì)檢測數(shù)目上的差異，仍以YS樣地0～2 cm深度的土壤樣品為例，除少部分物質(zhì)無法鑒定外， TMAH衍生法共鑒定出了261種土壤有機質(zhì)的標(biāo)識物（電子版文后支持信息表S1，S2），其中有243種被成功歸納至6個大類中，而直接進(jìn)樣法只鑒定出了117種（電子版文后支持信息表S3），TMAH衍生法顯著提高了木質(zhì)素類和脂質(zhì)類標(biāo)識物的數(shù)目。同時，TMAH衍生法檢測的物質(zhì)結(jié)構(gòu)更多樣，例如，對于脂肪酸的標(biāo)識物，直接進(jìn)樣法主要檢測出直鏈飽和脂肪酸，而TMAH衍生法則可以檢測出支鏈脂肪酸、羥基脂肪酸、不飽和脂肪酸以及雙脂肪酸。相對于傳統(tǒng)裂解技術(shù)，TMAH衍生法使木質(zhì)素的酚羥基和羧基被甲基化，從而使更多的木質(zhì)素的標(biāo)識物被檢出[12]。而直接進(jìn)樣法則對木質(zhì)素遺漏較多（電子版文后支持信息表S1，S2，S3），僅檢測出了一種紫丁香基木質(zhì)素，并完全遺漏了對羥苯基結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素單元，在其它研究報道中也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象[23]。需要注意的是，由于TMAH衍生法無法區(qū)分自由羥基和既存的甲氧基，從而導(dǎo)致一些單寧或去甲基化合物可能被誤認(rèn)為木質(zhì)素的產(chǎn)物[24]。直接進(jìn)樣法在脂質(zhì)的檢測數(shù)上比TMAH衍生法少很多，故一些研究將直接進(jìn)樣法與TMAH衍生法的結(jié)果相結(jié)合[25]。

兩種方法檢出的不同物質(zhì)的含量占比也有差異。TMAH衍生法中（圖2A），脂質(zhì)類含量較高，超過30%，而多糖、木質(zhì)素、含氮化合物、非木質(zhì)素的芳香族化合物含量均在10%左右，酚類含量較低。直接進(jìn)樣法中（圖2B），多糖含量最高（～30%），脂質(zhì)、非木質(zhì)素的芳香族化合物占比各約為20%，酚類占比16%，含氮化合物占比12%，而木質(zhì)素類物質(zhì)占比很低。TMAH衍生法中木質(zhì)素、脂質(zhì)含量明顯高于直接進(jìn)樣的結(jié)果，這可能是由于木質(zhì)素類和脂肪酸類的裂解產(chǎn)物中包含極性基團，直接進(jìn)樣法時這些物質(zhì)很難被檢出，而TMAH衍生法有效地提高了含羧基、羥基等極性基團的化合物的檢出率。直接進(jìn)樣法檢測的酚類物質(zhì)含量明顯高于TMAH衍生法，表明直接進(jìn)樣法對酚類化合物的檢測更加敏感。

上述研究結(jié)果表明，相比直接進(jìn)樣法，TMAH衍生法檢測到的標(biāo)識物更多、結(jié)構(gòu)更豐富，并提高了木質(zhì)素和脂質(zhì)的含量，能更全面地揭示土壤有機質(zhì)化學(xué)組成的信息。

3.1.3?各類物質(zhì)隨深度、緯度分布格局的比較?用TMAH衍生法和直接進(jìn)樣法測得所有樣品中不同土壤有機質(zhì)（木質(zhì)素、脂質(zhì)、多糖、含氮化合物、非木質(zhì)素的芳香族、酚類化合物）的變化范圍如表2所示。

TMAH衍生法的結(jié)果表明，木質(zhì)素含量隨土壤深度增加明顯減少（圖3A）; 脂質(zhì)含量也在大部分地區(qū)隨著土壤深度增加而逐漸減少（圖3B）; 除PG、YS外，含氮化合物含量也隨著土壤深度增加而顯著下降（圖3C）; 非木質(zhì)素的芳香族化合物含量則隨著深度變化不顯著（圖3D）; 多糖含量在偏北方的4個地區(qū)（PG、HYS、BA、HZY）隨著深度增加而減少，而在偏南方的3個地區(qū)（XY、HS、YS）則與深度沒有顯著相關(guān)性（圖3E）; 酚類化合物含量隨土壤深度增加而下降（圖3F）。 6類物質(zhì)均未呈現(xiàn)出隨緯度的一致變化規(guī)律。

在直接進(jìn)樣法中，木質(zhì)素類物質(zhì)含量隨土壤深度增加而劇烈減少（圖4A），與TMAH衍生法的結(jié)果類似; 隨土壤深度增加，脂質(zhì)的含量減少（圖4B），其下降趨勢比TMAH衍生法更明顯; 隨土壤深度增加，含氮化合物含量增加（圖4C），與TMAH衍生法的結(jié)果相反; 與TMAH衍生法的結(jié)果相似，非木質(zhì)素的芳香族類物質(zhì)隨土壤深度的變化基本不顯著（圖4D）; 各地區(qū)的多糖含量都隨深度變化較?。▓D4E）; 酚類化合物含量隨土壤深度變化普遍不顯著，與TMAH衍生法的結(jié)果有差異（圖4F）。6類物質(zhì)均沒有表現(xiàn)出隨緯度的明顯分布趨勢。

綜上，兩種方法反映出不同的土壤有機質(zhì)化學(xué)組成隨深度變化的規(guī)律，這些結(jié)果還需要通過更多的相關(guān)研究進(jìn)一步驗證。

3.1.4?不同地區(qū)土壤有機質(zhì)的總體組成?圖5顯示了基于PLS-DA， TMAH衍生法獲得深度為0～20 cm的不同地區(qū)土壤有機質(zhì)的總體組成。第一主成分可以解釋29%的樣品信息，第二主成分可以解釋13.3%的樣品信息。各地區(qū)間的土壤有機質(zhì)總體組成顯示出明顯的差異性，而相同地區(qū)重復(fù)樣品的土壤有機質(zhì)組成則顯示出明顯的一致性。偏北方的PG、HYS、BA 3個地區(qū)分布在圖6的上部區(qū)域，偏中部的HZY、XY兩個地區(qū)分布在中間區(qū)域，而偏南方的HS、YS兩個地區(qū)則分布在下部區(qū)域，表明土壤有機質(zhì)的總體組成隨緯度不同而不同。

3.2?TMAH衍生法色譜出峰規(guī)律探究

本方法中，烷烴在42 min后開始被大量檢出，同時， 平均每隔1.91 min，檢出的烷烴會增加一個碳原子，呈良好的線性規(guī)律（R2=0.96）（圖6A）。烯烴也有類似的規(guī)律。如圖6B所示，單烯烴在27 min后開始被大量檢出，同時， 平均每隔 1.73 min，檢出的單烯烴會增加一個碳原子，呈良好的線性規(guī)律（R2=0.97）。上述兩類烴類物質(zhì)的色譜峰具有一定的連續(xù)性，烷烴從碳23至碳34可被連續(xù)地檢出，單烯烴從碳15至碳27可被連續(xù)檢出。同時，在飽和脂肪酸、含單個雙鍵的不飽和脂肪酸兩類物質(zhì)中，碳原子數(shù)與保留時間也呈良好的線性規(guī)律。由圖6C可見，飽和脂肪酸在30 min后開始被大量檢出，同時平均每隔1.67 min，檢出的脂肪酸會增加一個碳原子，呈較好的線性規(guī)律（R2=0.98）。由圖6D可以看出，單不飽和脂肪酸在 16 min后開始被大量檢出，同時平均每隔0.44 min，檢出的脂肪酸會增加一個碳原子，呈較好的線性規(guī)律（R2=0.96）。

總之，分析結(jié)果能很好地驗證KOVATs保留指數(shù)的規(guī)律，即在同樣的升溫條件下，正構(gòu)碳數(shù)與保留時間呈線性關(guān)系[26]。結(jié)果表明，不僅是烷烴，單烯烴、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸的正構(gòu)碳數(shù)與保留時間都呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2均大于0.96。

4?結(jié) 論

采用直接進(jìn)樣法和TMAH衍生法，對不同地區(qū)不同深度的土壤有機質(zhì)進(jìn)行了定性和半定量分析。相比直接進(jìn)樣法，TMAH衍生法檢測的木質(zhì)素、脂質(zhì)、含氮化合物、非木質(zhì)素的芳香族以及多糖等大類的標(biāo)識物數(shù)目更多，結(jié)構(gòu)更多樣，因此該方法能夠更豐富地反映土壤有機質(zhì)的化學(xué)組成。兩種方法獲得的各類物質(zhì)的百分含量隨著深度和緯度的分布格局有差異。兩種方法測得的木質(zhì)素和脂質(zhì)含量隨深度變化的規(guī)律較吻合，而含氮化合物含量隨深度變化的規(guī)律相反。這些結(jié)果需要更多的相關(guān)研究來驗證。采用TMAH衍生法，烷烴、單烯烴、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸的碳原子數(shù)與保留時間均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

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