基于納米孔器件的光響應(yīng)分子的應(yīng)用

唐婧 王森 吳吉 梁麗媛 王亮 王德強(qiáng)

摘?要?探索生物大分子和小分子的構(gòu)象以及它們在外界環(huán)境中的響應(yīng)和作用規(guī)律對理解有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系十分重要。納米孔作為新興的第三代單分子基因測序技術(shù)， 可以實時監(jiān)測待測物分子的構(gòu)象變化過程， 在單分子檢測及核酸和蛋白測序方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步提高檢測的分辨率和精確度，可以采用光電聯(lián)合檢測方法，通過引入光響應(yīng)分子以滿足更高的檢測需求。本文綜述了目前納米孔器件的研究進(jìn)展以及代表性光響應(yīng)分子在納米孔檢測系統(tǒng)中的設(shè)計與應(yīng)用，主要介紹了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯三類光響應(yīng)分子分別在生物孔和固態(tài)孔中的光響應(yīng)性能。光調(diào)控是一種操作簡捷有效的分子結(jié)構(gòu)監(jiān)控方式，其與納米孔檢測技術(shù)的結(jié)合在單分子識別方面的應(yīng)用潛力對多功能納米器件的設(shè)計與應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞?納米孔; 光調(diào)控; 生物傳感器; 光響應(yīng)分子; 結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn); 評述

1?引 言

核酸是生命體的遺傳物質(zhì)，發(fā)揮著傳遞遺傳信息、維持生命體進(jìn)行正常生命活動的重要作用，充分了解核酸的結(jié)構(gòu)信息和運行機(jī)制十分重要。DNA除雙螺旋結(jié)構(gòu)外，還存在其它二級結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)與某些癌癥和遺傳性疾病關(guān)聯(lián)，所以相繼出現(xiàn)了一些基于核酸二級結(jié)構(gòu)的靶向治療方法[1]。在活細(xì)胞中直接觀察核酸的結(jié)構(gòu)變化以及作用機(jī)制十分困難，納米孔檢測技術(shù)可以實時監(jiān)測待測物分子的構(gòu)象變化過程，具有單分子檢測精度[2]，且檢測范圍廣泛，包括小分子有機(jī)物[3]、納米粒子[4]和生物分子聚合物[5]等。目前，按納米孔載體材料不同可將納米孔分為生物納米孔和固態(tài)納米孔，生物納米孔通常是由蛋白質(zhì)在磷脂雙分子層上自組裝成的通道結(jié)構(gòu)，具有孔徑和孔型穩(wěn)定、可重復(fù)性好和信噪比高等優(yōu)點，但是，由于支撐蛋白孔的磷脂雙層的不穩(wěn)定，使其使用壽命受到限制; 固態(tài)納米孔孔徑和孔型可控，環(huán)境耐受性強(qiáng)，易于實現(xiàn)孔表面的功能性組裝及標(biāo)記與修飾，但可重復(fù)性和信噪比不及生物納米孔[6]。為了克服生物納米孔和固態(tài)納米孔各自的缺點， 并結(jié)合它們的優(yōu)點，研究者誘導(dǎo)生物納米孔在固態(tài)納米孔中自組裝制備雜化納米孔[7]，使其具有高穩(wěn)定性和可重復(fù)性; 另外DNA折紙技術(shù)的自組裝特性和納米級精確度也為雜化納米孔的構(gòu)建指明了方向[8]。

鑒于納米孔自身的特性及納米孔限域空間內(nèi)電學(xué)信號檢測精度對分析結(jié)果的影響[9]，采用光電聯(lián)合檢測方法可進(jìn)一步提高檢測靈敏度和精確度。光電聯(lián)合檢測方法將光調(diào)控與電化學(xué)分析相結(jié)合，在納米器件表面或待測物分子上修飾光響應(yīng)分子， 獲得光誘導(dǎo)電信號[10，11]，從而進(jìn)行待測物分析，或進(jìn)行物質(zhì)傳輸?shù)萚12]。光調(diào)節(jié)是一種精確、簡單、可重復(fù)， 且光照時間、位置、強(qiáng)度都可調(diào)控的方法，有利于控制分子的運動和構(gòu)象的變化[13]。近年來有很多報道關(guān)于光響應(yīng)分子在納米孔檢測技術(shù)中的應(yīng)用，以完成納米孔自組裝[14]，實現(xiàn)離子選擇性傳輸[15]，控制納米孔開關(guān)狀態(tài)[16]，或者使待測物分子功能化[17，18]等。通過單一的光學(xué)檢測技術(shù)實現(xiàn)單分子檢測較為困難，因為目前光學(xué)傳感體積無法控制在單分子級別，新型的等離激元納米孔將等離激元和納米孔檢測兩種傳感模式相結(jié)合，同時提高了檢測精確度和信噪比[19]。本文將主要介紹偶氮苯及其衍生物[20]、螺吡喃[21]和二芳基乙烯[22]三類不同的光響應(yīng)分子的光響應(yīng)機(jī)制以及它們在光控納米孔器件中的應(yīng)用。

2?偶氮苯及其衍生物在光響應(yīng)體系中的應(yīng)用

偶氮苯及其衍生物是一種常用的光敏開關(guān)，紫外光下呈現(xiàn)為順式構(gòu)象（cis-azo），切換可見光，則呈現(xiàn)為反式構(gòu)象（trans-azo），且此過程可逆（圖1）。偶氮苯衍生物可以通過聚酰胺修飾在DNA雙鏈的小凹槽上[23]，平面的trans-azo與DNA堿基對之間通過π-π堆疊作用穩(wěn)定雙鏈，而cis-azo會使雙鏈DNA解鏈[24，25]。據(jù)此，研究者做了很多探索，如光調(diào)控生物分子在多通道納米器件上的自組裝[26]，以及適配體探針的修飾，不同光照條件下兩種不同結(jié)構(gòu)的適配體探針與目標(biāo)物之間的親和力差異有助于闡釋適配體與目標(biāo)物之間的相互作用，在靶向藥物傳遞和光動力治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[27]。體外控制DNA的解鏈和雜交是DNA納米技術(shù)的重要步驟，可通過調(diào)節(jié)溫度實現(xiàn)，若利用光調(diào)控， 則需要使DNA序列功能化，而偶氮苯衍生物可與DNA序列發(fā)生非共價作用，憑借平面反式構(gòu)象穩(wěn)定DNA雙鏈，在紫外光和可見光的調(diào)控下實現(xiàn)DNA雙鏈可逆的解鏈與雜交[28]，在恒定溫度條件下， 可逆地控制DNA納米結(jié)構(gòu)的組裝與拆分，這有望成為光調(diào)控DNA納米技術(shù)的一種新方法。

環(huán)糊精（CD）和葫蘆脲（CB[n]）可作為偶氮苯及其衍生物的主體分子[35，36]。生物系統(tǒng)中離子通道的開關(guān)狀態(tài)受配體、pH值及電位等因素的影響，對于體外實驗，單分子級別的人為調(diào)控對實驗條件要求較高，而在納米孔中引入光響應(yīng)分子有望實現(xiàn)這一目標(biāo)，并且在納米陣列中亦有很大的應(yīng)用潛力。固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于進(jìn)行表面功能化， 以優(yōu)化性能[37]。 Xie等[38]通過在聚酰亞胺（PI）納米孔表面修飾偶氮苯調(diào)控納米孔的開關(guān)狀態(tài)（圖2），利用偶氮苯與β-環(huán)糊精（β-CD）的主客體反應(yīng)，改變納米孔表面的親疏水性，從而使納米孔在非導(dǎo)電和導(dǎo)電狀態(tài)之間切換。該系統(tǒng)不僅具有光響應(yīng)性，還具有電壓調(diào)控性，當(dāng)非導(dǎo)電納米孔兩側(cè)的電壓達(dá)到極限值（2.6 V）時，納米孔切換為導(dǎo)電狀態(tài)，該模型特有的光響應(yīng)性和電壓調(diào)控性有助于研究和操縱納米約束環(huán)境下的水行為。此外，納米孔器件的功能化常受到分子馬達(dá)的啟發(fā)，如在可見光作用下，細(xì)菌視紫紅質(zhì)質(zhì)子泵系統(tǒng)將質(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，完成跨膜運輸（圖3A）。Xie等[39]模擬該生物質(zhì)子泵設(shè)計了一個仿生光驅(qū)動大通量運輸系統(tǒng)（圖3B），修飾有偶氮苯的PI納米孔經(jīng)光調(diào)控使表面親疏水性發(fā)生變化，處于納米孔限域空間的偶氮基團(tuán)在可見光和紫外光的循環(huán)照射下，構(gòu)象連續(xù)反轉(zhuǎn)，將積累在通道中的分子排出，其疏水性只允許β-CD通過納米孔，所展現(xiàn)的高選擇性在藥物傳遞中有潛在的應(yīng)用價值。除了將偶氮苯修飾在納米孔表面外，Liu等[40]在PI納米孔內(nèi)修飾了β-CD，制備了基于主客體系的光調(diào)控納米流體二極管（圖4），通過調(diào)節(jié)pH值實現(xiàn)高精度整流，具有不同表面性質(zhì)和狀態(tài)的納米通道為光敏納米流體器件和藥物傳輸與釋放提供了一個新的納米流體平臺。

此外，視覺感受器視紫紅質(zhì)中的視網(wǎng)膜成分也具有光響應(yīng)性，經(jīng)光線觸發(fā)， 11-cis-視網(wǎng)膜將轉(zhuǎn)化為全trans-視網(wǎng)膜，將光轉(zhuǎn)化為電信號，在生物離子通道的形成過程中發(fā)揮著重要作用[41]。受該通道啟發(fā)，Shi等[42]基于氧化石墨烯（GO）和偶氮苯之間的相互作用，設(shè)計了人工光敏離子?xùn)砰T，在含有微小傳導(dǎo)通道的多孔陽極氧化鋁（PAA）膜上修飾azo-DNA， 在紫外光照射下，cis-azo的空間位阻使ssDNA序列趨于伸展， 暴露在外的cis-azo與GO發(fā)生π-π堆疊作用，此時覆蓋在PAA膜上的GO阻止了離子傳輸; 而在可見光照射下， 平面trans-azo使ssDNA折疊為雙螺旋結(jié)構(gòu)，trans-azo被包裹在dsDNA內(nèi)部，表面的GO脫落，離子通道打開（圖5），光調(diào)控使該離子?xùn)砰T具有高效切換離子通道開關(guān)狀態(tài)的能力，并且生物相容性和通用性良好，在光學(xué)傳感器、光電轉(zhuǎn)換和可控藥物釋放等方面具有很好的應(yīng)用前景。α-溶血素（α-HL）納米孔是目前最廣泛使用的生物納米通道之一，可檢測多肽的結(jié)構(gòu)[43]，或探索dsDNA堿基的質(zhì)子化機(jī)理[44]等。在光敏DNA（azo-dsDNA）序列的檢測中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能（圖6A），不同的光照條件下，α-HL納米孔可識別azo-dsDNA混合物中兩種不同構(gòu)象的分子（圖6B）[17]，與cis-azo-dsDNA通過α-HL納米孔時產(chǎn)生的阻塞時間（（0.52±0.01） ms， +80 mV）相比，trans-azo-dsDNA的阻塞時間更長（（807±0.36） ms， +80 mV），這是因為trans-azo對DNA雙鏈的穩(wěn)定作用導(dǎo)致解鏈需要更長的時間，DNA雙鏈的解鏈動力學(xué)不僅可以證實trans-azo對dsDNA的穩(wěn)定作用，還可以精準(zhǔn)獲得azo-dsDNA的結(jié)構(gòu)狀態(tài); 光敏DNA在納米孔中的應(yīng)用提高了納米孔的分辨率，使得生物傳感器對異構(gòu)體的識別達(dá)到了單分子水平。

氣單胞菌溶素（AeL）是另一種在單堿基檢測中具有高靈敏性的生物納米孔，但是野生型氣單胞菌溶素納米孔（WT-AeL）只能區(qū)分2～10個堿基的單鏈寡核苷酸[3，45]，利用陽離子調(diào)控機(jī)制可檢測30個堿基[46]。AeL納米孔對修飾有偶氮苯的光敏DNA（azo-ssDNA）的檢測具有超高的時空分辨率（圖7）[18]，與α-HL納米孔相似，它可以識別azo-ssDNA混合物中兩種不同構(gòu)象的分子， trans-azo的空間位阻使azo-ssDNA在孔內(nèi)的易位速度減慢，產(chǎn)生的阻塞時間約是cis-azo-ssDNA的3.3倍，AeL納米孔可以準(zhǔn)確監(jiān)測每個azo-ssDNA分子的過孔狀態(tài)，定量檢測cis/trans混合構(gòu)型中各自的比例[47]，并且光調(diào)控可以實現(xiàn)azo-ssDNA在兩種構(gòu)象之間的可逆轉(zhuǎn)換，這有助于加深對azo-ssDNA光轉(zhuǎn)換特性的理解，納米孔提供的納米界面不僅為單分子器件的應(yīng)用提供了平臺，也對描述相關(guān)光可控生物過程和光燃料器件中的光調(diào)控活性、效率和機(jī)制具有指導(dǎo)意義。

Fragaceatoxin C（FraC）是一種來自Actinoporins蛋白的毒素，可在富含鞘磷脂受體的細(xì)胞表面自組裝為α-螺旋納米通道[48]，內(nèi)部收縮區(qū)僅為1.2 nm，但與α-HL和AeL納米孔不同的是，在高電位下，F(xiàn)raC 納米孔α-螺旋跨膜區(qū)的形變允許dsDNA易位[49]。FraC納米孔可調(diào)節(jié)孔徑，這使其可以識別溶液中單個肽的質(zhì)量，并且對蛋白質(zhì)進(jìn)行實時測序，可用于生物樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)表征[50，51]。光響應(yīng)分子的引入可以指導(dǎo)FraC在脂質(zhì)雙層膜上的自組裝，Mutter等[14]在FraC（azo-FraC）與鞘磷脂的結(jié)合位點附近的不同位置修飾了偶氮苯衍生物，以光作為外部觸發(fā)因素，可逆地控制FraC在脂質(zhì)雙層膜上的聚集，在紫外光照射下， cis-azo指導(dǎo)FraC與鞘磷脂的結(jié)合，甚至可以取代鞘磷脂使FraC在細(xì)胞膜上形成納米通道; 而在可見光照射下， FraC失活（圖8），這種光激活FraC可作用于多種富含鞘磷脂的真核細(xì)胞，在光激活腫瘤治療中具有應(yīng)用潛力，可控制非活性毒素在照射腫瘤部位局部激活，用白光照射腫瘤周圍的區(qū)域使其再次失活，并且光調(diào)控納米孔自組裝的能力也為降低納米孔陣列制造的復(fù)雜性提供了參考。

3?其它光響應(yīng)分子的應(yīng)用

螺吡喃及其衍生物也是廣泛使用的光致變色分子，在紫外光照射下，封閉形態(tài)的螺吡喃（SP）轉(zhuǎn)化為開環(huán)形態(tài)的花青素（MC），經(jīng)加熱或可見光照射，MC轉(zhuǎn)化為SP（圖9）[52]。螺吡喃分子的光異構(gòu)化過程不僅是簡單的立體異構(gòu)化，而且還誘導(dǎo)了化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的改變，與SP相比，MC是π-π共軛的極性更大的兩性離子，由此產(chǎn)生的光磁效應(yīng)可用于制備光致變色的室溫鐵磁材料[53]，在納米纖維/聚二甲基硅氧烷復(fù)合材料應(yīng)用中，分子顏色的改變使該材料具有機(jī)械變色性，可實現(xiàn)定向應(yīng)力和應(yīng)變的檢測[54]，以及可逆地調(diào)控納米探針的熒光性[55]。螺吡喃及其衍生物在碳納米管（CNTs）中應(yīng)用廣泛，如制備可光固化的CNTs[56]，或作為偶極開關(guān)調(diào)控碳納米管的發(fā)射響應(yīng)[57]等。此外，若將手性基團(tuán)共價連接到螺吡喃上，螺吡喃的光異構(gòu)化會引起手性信號的變化，將兩種螺吡喃對映體引入谷氨酸超分子凝膠，在紫外光和可見光交替照射下，凝膠中的螺吡喃在兩性離子MC和SP之間轉(zhuǎn)換，自組裝凝膠也會在螺旋型和纖維型之間可逆變化[58]。螺吡喃在異構(gòu)化過程中親水性的變化可用于調(diào)控納米孔的開關(guān)狀態(tài)[16]，如圖10所示，螺吡喃經(jīng)聚乙二醇（PEG） 共價修飾在錐形納米孔表面（PEG-SP），在紫外光照射下，SP轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苡谒腗C，此時PEG鏈采用能量更低的折疊構(gòu)象，使納米孔打開; 在可見光照射下，不溶于水的SP使PEG趨于伸展，納米孔關(guān)閉，光調(diào)控賦予了納米孔可逆的門控特性。

二芳基乙烯及其衍生物（DAEs）是另一類光響應(yīng)分子，DAEs含有兩個芳香基團(tuán)，通過烯烴鍵相連，經(jīng)光調(diào)控發(fā)生開環(huán)和閉環(huán)的異構(gòu)化過程，圖11為典型的全氟環(huán)戊烯衍生物的光致異構(gòu)化過程示意圖[59]，其衍生物的光響應(yīng)性質(zhì)受開環(huán)異構(gòu)體、取代基的構(gòu)象、異芳基的共軛長度和乙烯橋的性質(zhì)等因素的影響[60]。

DAEs是最抗疲勞的光致變色化合物之一[61]，經(jīng)DAEs功能化的熒光探針可以作為光學(xué)納米鏡的生物標(biāo)記物，不僅可提高光學(xué)納米鏡的分辨率，而且不需要任何成像介質(zhì)添加劑即可實現(xiàn)可逆的光敏調(diào)控[62]。除此之外，DAEs可改性石墨烯電極，以提高石墨烯電極的精確度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，且具有可逆的電導(dǎo)和光效應(yīng)[63]。DAEs常用于可光調(diào)控的多孔材料中， 作為氣體儲存和分離的吸附劑，如金屬有機(jī)骨架（MOFs），DAEs在MOF內(nèi)的集成使其具有光響應(yīng)特性，可實現(xiàn)高效碳捕獲，且光驅(qū)動DAEs基元的局部異構(gòu)化不會引起MOF骨架內(nèi)的整體改變[60]。Fan等[64]制備了以DAEs為基元的金屬有機(jī)骨架（DAE-MOF），首次分離了C2H2/C2H4混合氣體，可見光下DAEs的開環(huán)異構(gòu)化使其可以與C2H2/C2H4發(fā)生主客體反應(yīng)，由于C2H2與DAEs分子之間的主客體相互作用力更強(qiáng)，DAE-MOF可以高選擇性的分離出混合氣體中的C2H2，紫外光下處于閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DAE-MOF無法分離混合氣體。此外，DAEs也用于生物研究中所需的人工納米結(jié)構(gòu)的改性， Mi等[65]?設(shè)計合成了一種可精確控制單重態(tài)氧（1O2）生成的光敏系統(tǒng)，1O2在光動力治療的細(xì)胞殺傷機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[66]，該系統(tǒng)中1O2的生成活性可被近紅外光照射遠(yuǎn)程激活。如圖12所示，摻雜鑭的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNP）作為納米結(jié)構(gòu)的核，而修飾有卟啉PSs的介孔二氧化硅（MSN）作為殼，在沒有光響應(yīng)分子DAE時，在980 nm 近紅外光照射下，UCNPs的可見上轉(zhuǎn)換發(fā)光與PSs的寬吸收光譜有很好的重疊，可將能量轉(zhuǎn)移到PS，從而高效生成1O2; 若將光響應(yīng)分子DAE放置在靠近PSs的納米孔中，介孔中的DAE處于閉環(huán)狀態(tài)時會阻止1O2的生成，在808 nm光照射下，DAE轉(zhuǎn)化為開環(huán)結(jié)構(gòu)，打開了生成1O2的通道，而紫外光照時DAE發(fā)生結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)，實現(xiàn)通道的可逆調(diào)控。

4?總 結(jié)

本文評述了納米孔單分子檢測技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，包括生物納米孔和固態(tài)納米孔在鑒別生物分子構(gòu)象及動態(tài)監(jiān)測方面的應(yīng)用; 重點介紹了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯這三類具有不同光致響應(yīng)調(diào)控機(jī)制的光開關(guān)分子在不同核酸結(jié)構(gòu)體系、納米器件與多孔材料中的體系設(shè)計與分子調(diào)控效應(yīng)。 聯(lián)合光電化學(xué)、有機(jī)合成及材料加工等技術(shù)，可設(shè)計出更多性能優(yōu)異的光響應(yīng)納米器件，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)與材料領(lǐng)域。目前，還有很多技術(shù)問題有待解決，包括一些光響應(yīng)分子在生物體系中的相容性與穩(wěn)定性，外加光源與體系的兼容與干擾等。光響應(yīng)納米系統(tǒng)有望應(yīng)用于體內(nèi)診療，而光調(diào)控方法與納米孔檢測技術(shù)的結(jié)合在單分子識別方面的潛力也為納米器件的設(shè)計提供了新思路。

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