反相-親水作用色譜-定制多反應(yīng)監(jiān)測法同步測定肉蓯蓉多成分含量

宋青青 張珂 李婷 管朋維 龔興成 許霞 李軍 屠鵬飛 宋月林

摘?要?建立了反相色譜-親水作用色譜-定制多反應(yīng)監(jiān)測（RPLC-HILIC-tailored MRM）方法，對肉蓯蓉中極性跨度大、含量差異大的27個(gè)化學(xué)成分的含量進(jìn)行同步測定。利用RPLC與HILIC的在線直接偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)大、中、小極性化學(xué)成分的同步色譜保留和分離。Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）用于RPLC，Xbridge Amide色譜柱（150 mm×4.6 mm， 3.5 μm）用于HILIC，色譜柱間通過混合器引入稀釋泵來解決色譜機(jī)制不一致的問題。泵A（0.1%甲酸-水）和泵B（乙腈）輸送流動相至RPLC柱進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.15 mL/min; 泵C（0.1%甲酸-水）和泵D（乙腈）以1.0 mL/min的流速輸送流動相至混合器，改變RPLC柱洗脫液的組成，促進(jìn)極性大的化學(xué)成分在HILIC柱中的保留。通過靈活調(diào)節(jié)在線碰撞能，提高微量成分的質(zhì)譜響應(yīng)，抑制常量成分的質(zhì)譜響應(yīng)，形成定制多反應(yīng)監(jiān)測模式。最終同步測定36批肉蓯蓉中27個(gè)化學(xué)成分，包括氨基酸類、有機(jī)酸類、糖類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類等類型。方法檢出限為0.0032～160 μg/g，定量限為0.032～320 μg/g，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9929，加標(biāo)回收率為74.7%～125.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～13.7%。本方法線性范圍寬、準(zhǔn)確度高、適用性廣，為肉蓯蓉及其它中藥化學(xué)成分的深入定量分析提供了有效手段。

關(guān)鍵詞?反相色譜-親水作用色譜; 定制多反應(yīng)監(jiān)測模式; 極性跨度; 含量跨度; 肉蓯蓉

1?引 言

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物荒漠肉蓯蓉Cistanche deserticola Y.C. Ma干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便等功效[1]，從1977年開始為歷版《中國藥典》收錄。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，肉蓯蓉具有提高性功能、抗老年癡呆癥、抗帕金森病、提高學(xué)習(xí)記憶能力、抗衰老、抗疲勞、保肝、通便等多種作用[2～5]。肉蓯蓉也被我國衛(wèi)健委列入“藥食同源物質(zhì)”名錄。

迄今，已從肉蓯蓉中分離得到120余種化合物，主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、寡糖酯類、多元醇及多糖類等[2，3]。苯乙醇苷類化合物為肉蓯蓉主要活性化學(xué)成分群，以苯乙醇苷為主要成分的蓯蓉總苷膠囊被用于血管性癡呆的臨床治療。松果菊苷于2017年獲得新藥臨床批件，主要適應(yīng)癥為老年癡呆。除含量較高的松果菊苷和毛蕊花糖苷外，肉蓯蓉中甘露糖醇、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、紅景天苷等微量成分也具有廣泛的生物活性[5～7]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）前處理過程簡單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，適用于復(fù)雜基質(zhì)的化學(xué)成分分析[8，9]，尤其是在中藥多成分定量研究中得到了廣泛應(yīng)用[10，11]。然而，中藥活性成分常表現(xiàn)出不同的極性，單一色譜體系難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)、中、弱極性化學(xué)成分的全面分析，無法滿足中藥全面質(zhì)量評價(jià)的要求。全二維色譜[12]、中心切割色譜[13]等多維色譜體系以及多種新型色譜填料技術(shù)[14]雖然可以提高色譜的峰容量，增強(qiáng)對不同極性化合物的保留和分離能力，但仍難以同步定量分析具有大極性跨度的有效成分群。單一批次中藥樣品同時(shí)含有常量及微量成分，對于不同批次樣品，各化合物的含量差異非常大。肉蓯蓉中主要成分松果菊苷含量是其它微量苯乙醇苷類化合物的數(shù)十倍甚至數(shù)千倍[15，16]。由于生長環(huán)境、采收時(shí)間和后期飲片加工方式等因素，不同批次肉蓯蓉中松果菊苷的含量差異也可達(dá)千倍以上[17]。Zou等[18]利用1H NMR技術(shù)比較了肉蓯蓉的三種不同干燥方式，發(fā)現(xiàn)蒸汽殺酶結(jié)合冷凍干燥的肉蓯蓉中苯乙醇苷含量比直接冷凍干燥、蒸汽殺酶結(jié)合烘干的肉蓯蓉高2～3倍，且三者中糖類、有機(jī)酸等強(qiáng)極性的初生代謝產(chǎn)物的含量也存在顯著差異。

為了全面提高中藥肉蓯蓉質(zhì)量控制水平，本研究建立了適用于不同含量與極性的多指標(biāo)成分同步定量分析方法。反相色譜（RPLC）適用于中小極性化合物的保留和高效分離，而對強(qiáng)極性或是親水性化合物的保留和分離能力較弱。本研究利用RPLC及親水作用色譜（HILIC）分離機(jī)制的互補(bǔ)性，將RPLC柱及HILIC柱直接相聯(lián)，實(shí)現(xiàn)不同極性化合物的同時(shí)保留[19]; 充分利用三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜（Qtrap-MS）靈敏度高的優(yōu)勢，采用在線能量分辨質(zhì)譜技術(shù)篩選各目標(biāo)分析物的最適宜碰撞能（CE）[20]，形成定制多反應(yīng)監(jiān)測模式（Tailored MRM），同步定量分析常量及微量化學(xué)成分?；谒⒌腞PLC-HILIC-定制多反應(yīng)監(jiān)測法（RPLC-HILIC-tailored MRM），對肉蓯蓉中27種氨基酸類、有機(jī)酸類、糖類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類化學(xué)成分進(jìn)行同步定量分析，為肉蓯蓉及其它中藥質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

島津分析型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配四個(gè)LC-20AD泵、 DGU-20A真空脫氣機(jī)、SIL-20A自動進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱; SCIEX Qtrap5500質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）; 超聲波清洗器（南京壘君達(dá)超聲電子設(shè)備有限公司）; XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）; Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; XW-80A漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）; PREMIXER ASSY混合器（日本Shimadzu公司）。

色譜純甲醇、質(zhì)譜純甲酸和乙腈（美國Thermo Fisher公司）; 對照品煙酸（Nicotinic acid）、琥珀酸（Succinic acid）、莽草酸（Shikimic acid）購于美國Sigma公司; 尿苷（Uridine）、腺苷（Adenosine）、肌苷（Inosine）、腺嘌呤（Adenine）、鳥苷（Guanosine）購于北京欣經(jīng)科生物科技有限公司; 肉蓯蓉苷F（Cistanoside F）購于四川成都曼斯特生物科技有限公司; 紅景天苷（Salidroside）購于上海源葉生物科技有限公司; 肉蓯蓉苷A（Cistanoside A）、2′-乙酰毛蕊花糖苷（2′-Acetylacteoside）、芹糖甘草苷（Liquiritin apioside）購于上海詩丹德生物科技有限公司; 管花苷A（Tubuloside A）購于四川維克奇生物科技有限公司; 6-去氧梓醇（6-Deoxycatalpol）、苯丙氨酸（Phenylalaine）、8-表馬錢子酸（8-Epi-Loganic acid）、甘露糖醇（Mannitol）、蔗糖（Sucrose）、格魯苷（Gluroside）、京尼平苷（Geniposide）、阿拉善苷A（Alaschanioside A）、松果菊苷（Echinacoside）、落葉松脂素葡萄糖苷（Lariciresinol 4′-O-glucoside）、阿魏酸（Ferulic acid）、毛蕊花糖苷（Acteoside）、異毛蕊花糖苷（Isoacteoside）、松脂素葡萄糖苷（Pinoresinol 4-O-glucoside）均由本實(shí)驗(yàn)室制備、鑒定所得。經(jīng)HPLC-DAD檢測，以上對照品純度均大于98%。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備的超純水。

36批肉蓯蓉樣品（CD1-CD36）均采集于中國新疆、內(nèi)蒙古、甘肅等地區(qū)（見電子版文后支持信息表S1）， 經(jīng)鑒定為荒漠肉蓯蓉[Cistanche deserticola Y.C. Ma]干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制?精確稱取各對照品適量，分別用二甲基亞砜（DMSO）、甲醇或水配成 4 mg/mL或10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。使用前， 精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用50%（V/V）甲醇稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL，加入950 μL含內(nèi)標(biāo)物的25%（V/V）乙腈-水溶液稀釋，配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2.2?樣品制備?肉蓯蓉藥材采集后，將其切成片， 40℃干燥處理4 d后，粉碎并過篩。稱取1.0 g干燥粉末，加入50%（V/V）甲醇定容至50 mL，稱重，超聲處理30 min，冷卻后再次稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，靜置。 上清液過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液50 μL，加入950 μL含內(nèi)標(biāo)物的25%（V/V）乙腈-水（內(nèi)標(biāo)物終濃度為138 ng/mL），待測。

2.2.3?RPLC-HILIC直接偶聯(lián)系統(tǒng)條件?RPLC-HILIC直接偶聯(lián)系統(tǒng)示意圖見圖1。RPLC柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm），HILIC柱：Waters Xbridge Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）。泵A和泵C輸送流動相： 0.1%甲酸-水; 泵B和泵D輸送流動相：乙腈; 稀釋泵由泵C和泵D組成。RPLC色譜柱和稀釋泵分別連接于混合器入口，混合器出口連接HILIC色譜柱。泵A和泵B輸送流動相流入T3色譜柱進(jìn)行梯度洗脫： 0～4 min，10% B; 4～8 min，10%～20% B; 8～22 min，20%～55% B; 22.1～30 min，10% B; 流速為0.15 mL/min。同時(shí)，稀釋泵以1.0 mL/min流入混合器，與RPLC柱流出的流動相混合后，一同流入HILIC柱，稀釋泵梯度洗脫程序如下：0～4 min，100% D; 4～8 min， 100%～84% D; 8～22 min，84%～61% D; 22.1～30 min，100% D。兩根色譜柱均置于40℃的柱溫箱中，進(jìn)樣量2 μL。

2.2.4?質(zhì)譜條件?電噴霧離子源（ESI）， 負(fù)離子模式， 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）-信息依賴性采集（IDA）-增強(qiáng)自離子掃描模式（EPI）， 時(shí)間窗為90 s。氣簾氣： 35.0 psi（1 psi=6.89 kPa）; 碰撞氣等級： 高; 噴霧電壓： 4500 V; 霧化氣： 55 psi; 輔助氣： 55 psi; 霧化溫度： 550℃。 27個(gè)定量化合物及內(nèi)標(biāo)物的離子對、CE、去簇電壓（DP）等質(zhì)譜參數(shù)見表1。IDA設(shè)置強(qiáng)度閾值大于20000 cps的一個(gè)峰度最高的母離子，靶向獲得二級質(zhì)譜信息，EPI質(zhì)量數(shù)采集范圍m/z 100～1000，碰撞能（30±20）eV。

3?結(jié)果與討論

3.1?RPLC-HILIC-tailored MRM分析方法的建立

3.1.1?色譜條件優(yōu)化?通過實(shí)驗(yàn)考察，小內(nèi)徑RPLC柱適于作為前置色譜分離柱用來分離強(qiáng)、弱極性化合物，而在RPLC柱上無法保留的弱極性化合物能夠通過后置大內(nèi)徑HILIC色譜柱保留和分離。比較了Phenomenex Kinetex-C18 shell（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、ACE UltraCore 2.5 Super C18（150 mm×3.0 mm， 2.5 μm）、Shiseido Capcell Core C18（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）和Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）4種候選RPLC柱，相比于其它色譜柱，T3色譜柱對強(qiáng)、弱極性化合物的保留能力較強(qiáng)，分離度和峰形較好（圖2B）。比較了Shiseido Capcell Core PC HILIC（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Merck SeQuantZIC-cHILIC（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）、Phenomenex Kinetex HILIC（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）和Waters Xbridge Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）4種HILIC色譜柱，發(fā)現(xiàn)在乙腈和0.1%甲酸的流動相條件下，煙酸、琥珀酸、尿苷等親水性化合物均能夠在Amide色譜柱上良好的保留和分離，靈敏度高，峰形較好（圖2C），優(yōu)于其它三種色譜柱。因此，本研究選擇T3色譜柱以及鍵合酰胺官能團(tuán)的Amide色譜柱。

由于RPLC和HILIC流動相組成相似，但色譜原理相反。HILIC采用強(qiáng)極性固定相，需要高濃度的有機(jī)溶劑作為流動相實(shí)現(xiàn)強(qiáng)極性化合物的分離。因此，在RPLC和HILIC進(jìn)行直接偶聯(lián)時(shí)，引入了稀釋泵（泵C和泵D）提供高濃度有機(jī)溶劑（乙腈）來解決RPLC和HILIC兩個(gè)色譜體系流動相組成不一致的問題。根據(jù)各化合物的保留情況及色譜行為優(yōu)化流速，T3色譜柱流速為0.15 mL/min，稀釋泵流速為1.0 mL/min，進(jìn)入質(zhì)譜流速共計(jì)1.15 mL/min，位于Turbo VTM ESI離子源允許范圍之內(nèi)。稀釋泵采用純乙腈為起始比例，使Amide的起始流動相比例為88%，能夠保證極性化合物在Amide上良好的保留。進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序，結(jié)果如2.2.3項(xiàng)下所述。

基于已優(yōu)化方法，分別將Amide色譜柱和T3色譜柱用等長的不銹鋼管線（0.13 mm， i.d.）替代，建立RPLC單柱和HILIC單柱色譜系統(tǒng)?？疾炝嘶旌蠘?biāo)準(zhǔn)品在RPLC-HILIC、RPLC、HILIC上的色譜行為，發(fā)現(xiàn)RPLC對氨基酸、有機(jī)酸等強(qiáng)極性成分（1，3～7，11，13，15）無法有效保留，均在死體積共流出（圖2B），而HILIC的色譜分辨率較低，色譜峰寬，且對阿魏酸（23）等弱極性化合物無法有效保留（圖2C）。同時(shí)，在RPLC以及HILIC單柱系統(tǒng)中，共流出的化合物在質(zhì)譜檢測時(shí)會發(fā)生離子競爭，從而造成不同程度的基質(zhì)效應(yīng)。然而，采用RPLC-HILIC偶連系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)不同極性化合物的全面保留和良好分離（圖2A）。圖2D為肉蓯蓉樣品（CD23）的RPLC-HILIC-tailored MRM提取離子流圖，表明構(gòu)建的色譜方法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了肉蓯蓉中27個(gè)氨基酸類、有機(jī)酸類、糖類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類目標(biāo)分析物的測定。

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