大鼠運動性腎臟缺血再灌注損傷及肉蓯蓉配伍維生素C的保護作用

周俊飛　曹建民　周海濤

摘要：目的：研究肉蓯蓉配伍維生素C對大鼠運動性腎缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法：將6周齡雄性Wistar大鼠96只為對象隨機分為6組：對照組（C組，12只）、一般訓練組（M組，12只）、過度訓練組（OM組，24只）、肉蓯蓉+過度訓練組（COM組，16只）、維生素C+過度訓練組（VCOM組，16只）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（CVCOM組，16只），進行56 d的力竭游泳訓練。COM組、CVCOM組采用專業(yè)灌胃器灌胃（ig），每天一次，劑量為6.01 g·kg-1，ig體積為5 mL·kg-1；VCOM組、CVCOM組采用腹腔注射（ip），劑量為100 mg·kg-1，每天一次，注射體積為0.5 mL，其他各組ig等量生理鹽水。末次訓練后24 h，進行血清尿素氮、血清肌酐等生化指標檢測。結(jié)果：1）8周的過度訓練導致大鼠運動性腎缺血“再灌注”，腎組織超微結(jié)構(gòu)被嚴重破壞、組織病理學發(fā)生明顯改變，腎功能受到嚴重損壞。2）血尿素氮和血清肌酐上升。OM組（P<0.01）、COM組（P<0.01）、VCOM組（P<0.01）、CVCOM組（P<0.05）高于C組；COM組（P<0.05）、VCOM組（P<0.05）、CVCOM組（P<0.01）低于OM組；COM組（P<0.05），CVCOM組（P<0.01）低于VCOM組。3、SOD活性降低。OM組（P<0.01）、COM組（P<0.01）、VCOM組（P<0.01）、CVCOM組（P<0.05）低于C組；COM組（P<0.05）、VCOM組（P<0.05）、CVCOM組（P<0.01）高于OM組；COM組（P<0.05），CVCOM組（P<0.01）高于VCOM組。4、MDA含量升高。OM組（P<0.01）、COM組（P<0.01）、VCOM組（P<0.01）、CVCOM組（P<0.05）高于C組，COM組（P<0.05）、VCOM組（P<0.05）、CVCOM組（P<0.01）低于OM組；COM組（P<0.05），CVCOM組（P<0.01）低于VCOM組。結(jié)論：1）過度訓練造成了大鼠腎臟缺血再灌注損傷。2）肉蓯蓉和維生素C均可以增強SOD活性，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，對運動性缺血再灌注腎臟具有保護作用。3.肉蓯蓉作用優(yōu)于維生素C，二者配伍使用效果更好。

關(guān)鍵詞：肉蓯蓉；維生素C；運動性缺血再灌注

中圖分類號：G804.7文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2014）02-0070-05

1. Department of P.E.， Guangdong University of Foreign Studies， Guangzhou 510420， China； 2.Beijing Sport University， Beijing 100084， China；3.Biochemical Engineering College of Beijing Union Univers， Beijing 100023，ChinaAbstract：Objective：To study the Herba Cistanches combined with vitamin Cs protective effect and mechanism of movement in rats renal ischemia-reperfusion injury.Methods：Randomly divide 96 7-week-old male Wistar rats into 6 groups： control group （group C， 12）， general training group （group M， 12）， overtraining group （group OM， 24）， cistanche + overtraining group （group COM， 16）， vitamin C+ overtraining group （group VCOM， 16），and cistanche + vitamin C+overtraining group （group CVCOM， 16），take a 56-day of exhaustive swimming training. The COM group， CVCOM group with professional gavage for gastric lavage （ig）， once a day， the dose of 6.01 g.kg-1， Ig volume 5mL.kg-1； group VCOM， group CVCOM ip take intraperitoneal injection，100 mg.kg-1， once a day， the injection volume is 0.5 mL；other groups ig normal saline. Detect biochemical parameters of serum urea nitrogen and serum creatinine 24 hours later after the last training.Results：1）In the 8 week of overtraining，rats resulted in movement of “renal ischemia reperfusion”， the ultrastructure of kidney was severely damaged， the histopathological changes obviously， renal function was seriously damaged. 2）Serum creatinine and blood urea nitrogen rise. OM group （P<0.01）， COM group （P<0.01）， VCOM group （P<0.01）， CVCOM group （P<0.05） higher than in group C； COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） lower than the OM group； COM group（P<0.05）， CVCOM groups（P<0.01） lower than the VCOM group.3）SOD activity decreased. OM group （P<0.01）， COM group （P<0.01）， of VCOM group（P<0.01）， CVCOM group（P<0.05） lower than in group C； M group（P<0.05）， COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） higher than the OM group； COM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） higher than the VCOM group.4）The content of MDA increased，OM group （P<0.01）， COM group（P<0.01）， VCOM group（P<0.01）， CVCOM group（P<0.05） higher than in group C；COM group（P<0.05）， VCOM group（P<0.05）， CVCOM group（P<0.01） lower than the OM group；COM group（P<0.05）， CVCOM groups （P<0.01） lower than the VCOM group.Conclusion：1）Overtraining can induce the renal ischemia-reperfusion in rats.2）Cistanche deserticola Y.C.Ma and vitamin C can enhance the activity of SOD， scavenging oxygen free radicals， reduce lipid peroxidation，they have a protective effect on exercise-induced ischemia-reperfusion kidney. 3）Cistanche is better than vitamin C，but they worked even better when taken both.

Key words：herba cistanches；vitamin C； exercise-induced ischemia-reperfusion

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展、現(xiàn)代藥理學理論及現(xiàn)代生物技術(shù)的更新，更多的單劑或配伍組方應用于體育實踐。中藥以其多靶點、多途徑作用且?guī)缀醪缓`禁成分的特點日益顯示出其獨特的優(yōu)勢，在提高運動員身體機能及緩解疲勞方面取得了一定的成就。機體在穩(wěn)定狀態(tài)下，腎血流量可以通過自身調(diào)節(jié)機制來維持相對恒定。在劇烈運動時，腎血流在神經(jīng)和體液因素的影響下發(fā)生改變。由于各器官血流量重新分配，使活動器官特別是肌肉的血流量增多，腎血流量急劇下降，并伴隨運動過程的持續(xù)和強度遞增表現(xiàn)的更加明顯[1]。腎臟的這種不完全缺血狀態(tài)形成了“運動性腎缺血”。運動停止后，腎血供應恢復形成運動性腎缺血后的“再灌注”[2]。缺血再灌注損傷過程中，自由基的產(chǎn)生異常增多起著重要作用。研究表明，肉蓯蓉具有提高過氧化物岐化酶活性、降低脂質(zhì)過氧化物的藥理作用，可以清除體內(nèi)過量生成的自由基對機體細胞的損傷[3]；維生素C作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，也可以有效地清除自由基[4]。本文研究肉蓯蓉配伍維生素C對大鼠缺血再灌注腎臟的影響，并探討二者在缺血再灌注損傷中的作用及其機制，旨在為其臨床應用提供理論依據(jù)。

1材料

1.1動物

清潔級雄性Wistar大鼠100只，42 d齡，平均體重（201.8±14.1）g，北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證號SCXK（京）2006-0008。在整個試驗過程中，實驗室內(nèi)溫度保持在（22±2）℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。所有試驗大鼠均以基礎(chǔ)飼料（北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供）和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。實驗時間為63 d，正式訓練時間為56 d。

1.2實驗用藥肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma），產(chǎn)自內(nèi)蒙，北京同仁堂藥店購得，批號：120224536并經(jīng)天津中瑞藥業(yè)有限公司高占友高級工程師鑒定。將干燥帶鱗葉的肉蓯蓉粉碎成粗粉，用10， 6， 6倍量60%乙醇水浴提取3次，每次2 h，合并提取液冷藏24 h，過濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮成浸膏（相當于2.0g生藥/g浸膏），備用[3]。維生素C注射液（批號20120406），北京雙鶴藥業(yè)提供。

1.3試劑血清肌酐（serum creatinine， Scr）采用Jaffe苦味酸法測定，血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）采用二乙酰-肟法測定，丙二醛（malondialdehyde， MDA）采用比色法測定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），采用黃嘌呤氧化酶法測定，均采用南京建成生物工程研究所提供試劑盒，試劑盒編號20120511，并嚴格按照使用說明操作。

1.4儀器BS224S型電子分析天平（德國賽多利斯）、光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、ALCYON300全自動生化分析儀（美國雅培）、756MC型紫外-可見分光光度計（上海精密儀器廠）及GL-20G高速冷凍離心機（上海安亭）。

2方法

2.1動物分組

實驗大鼠適應性飼養(yǎng)4 d后，以20 min/d的運動量對其進行為期3 d的篩選，淘汰個別不適應游泳訓練者，將剩余大鼠以數(shù)字隨機分組法分6組：對照組（C組）12只，一般訓練組（M組）12只，過度訓練組（OM組）24只，肉蓯蓉+過度訓練組（COM組）16只，維生素C+過度訓練組（VCOM組）16只， 肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（CVCOM組）16只進行56 d的游泳訓練。訓練期間，COM組、CVCOM組采用專業(yè)灌胃器灌胃（ig），每天一次，劑量為6.01 g/kg，ig體積為5 mL/kg；VCOM組、CVCOM組采用腹腔注射（ip），劑量為100 mg/kg ，每天一次，注射體積為0.5 mL（通過預實驗獲得最佳劑量），其他各組ig等量生理鹽水。

2.2實驗方法

2.2.1訓練及測試方案

C組常規(guī)飼養(yǎng)，不加任何干預，平時不運動。M組進行中等強度游泳訓練，正式游泳訓練8周。每周訓練6 d，每天訓練1次，第一次下水游20 min，此后逐漸增加，至第1周末時每天游60 min，第2周末時加至每天游90 min，第3周末時加至每天游120 min，此后5周均保持此運動量。其他各組前3周訓練安排同M組，第4周起開始安排高強度訓練。大鼠進行負重游泳，每次訓練至力竭。力竭標準以大鼠下沉后10 s不露出水面為度。第1～3周負0.5%體重，第4周負1%體重，第5周負2%體重，每天訓練1次。第6周每天上、下午各訓練1次，第7～8周，每天上、下午、夜間各訓練1次，均負5%體重。至第8周末，C、M組大鼠，均正常生長，無意外死亡發(fā)生。其他各組大鼠因尾部負重，疲勞衰竭不能恢復及訓練意外死亡等原因，死亡率較高。OM組、COM組、VCOM組、CVCOM組分別剩余14、13、11、13只。各組分別取10只用于實驗取材，其他隨機剔除。

2.2.2指標測定

各組大鼠于末次游泳訓練24 h后，乙醚適度麻醉，從頸總動脈處取血加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37℃水浴中30 min后，4℃ 3 000 rpm離心10 min，分離制備血清，置-20℃冰箱中保存待查。迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，肉眼觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地。分離左腎，取腎上極組織0.5 g，用1.5 mL生理鹽水在1℃下以12 000 rpm研磨制成10%腎組織勻漿；10%甲醛固定腎組織標本，石蠟包埋，制成4 um厚切片，HE染色，觀察組織病理學變化。

2.2.3腎臟病理變化評價

參照Pallers標準[5]，在400倍光鏡下隨機選5個視野，每個視野選10個腎小管評分。1）腎小管明顯擴張，細胞扁平為1分；2）刷狀緣損傷為1分，脫落為2分；3）細胞膜大泡1分，細胞漿空泡1分；4）間質(zhì)水腫1分；5）腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細胞未形成管型或碎片為1分，形成管型或碎片為2分。腎小管評分由兩名技術(shù)員雙盲計算，取其平均值。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行處理，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）表示，資料進行正態(tài)性檢驗；多組計量資料采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett's T3法。P<0.05有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1運動及肉蓯蓉、維生素C對大鼠腎組織的病理改變

Scr和BUN測定后取各組腎組織制作石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。光鏡下靜止對照組、一般訓練組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，無淤血、變性和水腫，腎小管管腔內(nèi)無管型。過度訓練組大鼠腎小球有淤血現(xiàn)象，小管上皮細胞水腫、空泡變性、管腔擴張，管腔中有少量的脫落絨毛和上皮細胞，以及各種管型。其他各組組織病理學改變較過度訓練組輕，有輕微的小管上皮細胞水腫、空泡變性、管腔擴張現(xiàn)象，無蛋白管型和細胞管型。各組大鼠腎小管Paller [5]評分，靜止對照組、一般訓練組組間無顯著差異（P>0.05），靜止對照組明顯低于其他組（P<0.01），治療組顯著低于過度訓練組大鼠（P<0.05），且均未見腎小球明顯病理改變。

由表2可知，血尿素氮和血清肌酐各組較對照組明顯上升，與OM組相比COM組、VCOM組、CVCOM組明顯下降（分別為P<0.05、P<0.05、P<0.01）；與VCOM組相比，COM組、CVCOM組明顯下降（分別為P<0.05，P<0.01）。

3.3運動及肉蓯蓉、維生素C對大鼠腎組織勻漿中SOD活性和MDA含量的影響

由表3可知，SOD活性各組較對照組明顯降低，與OM組相比COM組、VCOM組、CVCOM組明顯上升（分別為P<0.05、P<0.05、P<0.01）；與VCOM組相比，COM組、CVCOM組明顯上升 （分別為P<0.05，P<0.01）。MDA含量各組較對照組明顯升高，與OM組相比COM組、VCOM組、CVCOM組明顯下降，（分別為P<0.05、P<0.05、P<0.01）；與VCOM組相比，COM組、CVCOM組明顯降低（分別為P<0.05、P<0.01）。

4討論

腎缺血再灌注（Ischemic reperfusion，I/R）損傷是一個復雜的病理生理變化過程，其具體機制尚未完全闡明。但氧自由基（Oxygen free radicals，OFR）在I/R發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。正常情況下，體內(nèi)可產(chǎn)生少量自由基，但由于體內(nèi)具有滅活自由基酶系統(tǒng)，自由基被迅速清除，不產(chǎn)生損傷作用。運動時由于I/R使自由基產(chǎn)生增加，可引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應，導致膜的液態(tài)性、流動性及通透性改變，進而造成膜功能障礙，尤其是線粒體膜的破壞將影響細胞的代謝和機能，并干擾整個器官的生理功能。機體內(nèi)存在清除自由基、減輕其危害的主要物質(zhì)是抗氧化酶。SOD是需氧生物體內(nèi)數(shù)千種酶中以氧自由基為底物的唯一酶。其通過催化超氧陰離子形成過氧化氫而清除超氧陰離子，保護機體免受損傷，同時在一定范圍內(nèi)，自由基代謝增強時，SOD會代償性增加。因此SOD活性的高低是機體抗氧化能力強弱的標志。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化的一種主產(chǎn)物。組織線粒體MDA含量是目前公認的衡量機體自由基代謝的敏感指標[7]。肌酐和尿素氮分別是肌肉和蛋白質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)血循環(huán)從腎臟排除體外，其血中的濃度取決于腎小球濾過能力，當腎臟實質(zhì)受到損傷，腎小球濾過率降到臨界點后，二者的濃度就會明顯上升[8]。

實驗結(jié)果顯示，8周的過度訓練導致大鼠腎組織組織病理學發(fā)生明顯改變；血尿素氮、血清肌酐增高（過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.01）、維生素C+過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.05）高于靜止對照組）；SOD活性降低（過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.01）、維生素C+過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.05）低于靜止對照組）；MDA含量升高（一般訓練組（P<0.05）、過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.01）、維生素C+過度訓練組（P<0.01）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.05）高于靜止對照組）。這說明過度訓練已造成大鼠腎臟運動性缺血“再灌注”損傷，腎功能受到嚴重損壞。但腎組織組織病理學改變?nèi)馍惾?過度訓練組、維生素C+過度訓練組、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.05）較過度訓練組明顯減輕。血尿素氮和血清肌酐含量肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.05）、維生素C+過度訓練組（P<0.05）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.01）低于過度訓練組；SOD活性，肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.05）、維生素C+過度訓練組（P<0.05）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.01）高于過度訓練組；MDA含量，肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.05）、維生素C+過度訓練組（P<0.05）、肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.01）低于過度訓練組。表明，肉蓯蓉及維生素C可以有效清除自由基，減輕腎臟的缺血缺氧，抑制脂質(zhì)過氧化作用，提高SOD活性。有效減輕腎臟缺血再灌注損傷，起到保護作用。其機制可能為：1）肉蓯蓉可以提高抗氧化酶活性，加快自由基的消除，同時所含的多種多酚類、苷類、黃酮類物質(zhì)，對清除機體自由基、減輕自由基對線粒體膜和肌漿網(wǎng)膜造成損傷，以及減輕對酶蛋白的氧化損傷起到積極作用[3]。2）維生素C是重要的抗氧化維生素，作為強抗氧化劑可有效清除氧自由基、抑制凋亡級聯(lián)的啟動而減輕細胞、器官的缺血再灌注損傷[9]。此外，3個治療組間比較，血尿素氮、血清肌酐、MDA含量，肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.05），肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.01）低于維生素C+過度訓練組；SOD活性，肉蓯蓉+過度訓練組（P<0.05），肉蓯蓉+維生素C+過度訓練組（P<0.01）高于維生素C+過度訓練組。提示肉蓯蓉對運動性腎臟缺血再灌注損傷的療效可能優(yōu)于維生素C；而二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注損傷腎臟的保護。

綜上所述，大負荷游泳訓練造成了大鼠腎臟缺血再灌注的損傷，肉蓯蓉和維生素C均對腎臟缺血再灌注損傷具有明顯保護作用，可能是通過增強超氧化物歧化酶活性，清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，進而改善腎臟功能。就療效而言，二者配伍使用優(yōu)于二者單獨應用，而肉蓯蓉又優(yōu)于維生素C，但也可能和二者在應用中的劑量大小有關(guān)，其劑量和療效之間的關(guān)系，還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Barclar WF. Review of Medical Physiology[M].California： lange Medical Publication，1995：577-580.

[2] Heifets M， Davis T A， Tegtmeyer E，et al.Exercise training ameliorates progressive renal disease in rats with subtotal nephrectomy[J].Kidney Int，1987，32（6）：815-820.

[3] ZHOU H T（周海濤），CAO J M（曹建民），LIN Q（林強）. Effect of Cistanches Herba on the Swimming Ability and Oxidation Resistance of Mitochondrial in Rats[J].Chin J Exp Tradit Med Form（中國實驗方劑學雜志），2012，18（6）：229-233.

[4] Palazzetti S， Rousseau A S， Richard M J，et al.Antioxidant supplementation preserves antioxidant response in physical training and low antioxidant intake[J].Br J Nutr，2004，91（1）：91-100.

[5]Paller M S， Hoidal J R， Ferris T F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J].J Clin Invest，1984，74（4）：1156-1164.

[6]Wang L（王麗）， Mei C L（梅長林）. Hypoxia-inducible factor-1α and oxygen free radicals in renal ischemia-reperfusion injury in rats[J].Chin J Nephrol（中華腎臟病雜志），2006， 22（7）：371-373.

[7]Chen PJ， Hirata F. The effects of long-term training at various loads on immunity and neuroendocrine responses in rats[J].J. NIFS-KJ，1998，20（1）：19-26.

[8]Hong P（洪平）， Chen G（陳耿）， Li Q Z（李清正），et al.Influence of Rapid Weight Loss by Different Temperature on Certain Biochemical Indexes[J].Chin sport sci（體育科學），2010，30（4）：44-48.

[9]Korkmaz A， Kolankaya D. The protective effects of ascorbic acid against renal ischemia-reperfusion injury in male rats[J].Ren Fail，2009，31（1）：36-43.