核酸適配體在質(zhì)譜中的應(yīng)用與展望

楊捷威 王晨鈺 羅黎 郭磊 謝劍煒

摘?要?核酸適配體（簡稱適配體）是一類重要的“化學(xué)抗體”型功能性生物分子，基于適配體的質(zhì)譜技術(shù)在提供分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)特征等基礎(chǔ)上，兼具了針對靶分子的高選擇性及親和富集特點(diǎn)，從而提供出高特異、高靈敏信息。本文綜述了近年來適配體在質(zhì)譜分析中的應(yīng)用進(jìn)展，重點(diǎn)評述了適配體在質(zhì)譜分子相互作用表征中的應(yīng)用、適配體作為離線型和在線親和材料用于質(zhì)譜分析測定等現(xiàn)狀，其中結(jié)合多種質(zhì)譜新技術(shù)， 通過創(chuàng)建或結(jié)合多種前處理或在線一體化信號增強(qiáng)方式，特別是適配體功能化納米材料的應(yīng)用，在相互作用表征、痕量靶分子選擇性提取和高靈敏檢測等質(zhì)譜分析測定方面是研究的重點(diǎn)。最后，本文對適配體在質(zhì)譜研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?適配體; 質(zhì)譜; 相互作用表征; 納米材料; 功能化; 評述

1?引 言

適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)體外篩選得到的單鏈寡核苷酸序列，如脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）序列，能特異性識別靶分子，如小分子、生物大分子（蛋白質(zhì)、酶、毒素、轉(zhuǎn)錄因子等）、病原體（病毒、細(xì)菌、細(xì)胞）、組織等，具有體積較小、結(jié)構(gòu)靈活、變性復(fù)性快速可逆、易功能化修飾與標(biāo)記、自身穩(wěn)定性強(qiáng)和無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[1]。適配體已在分析化學(xué)、藥學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用，例如生物傳感技術(shù)、DNA納米技術(shù)、即時(shí)診斷、藥物靶向遞送等[2]。近年來，適配體作為親和分子，已出現(xiàn)酶聯(lián)適配體吸附劑、適配體型固定相、陣列式芯片、酶微反應(yīng)器等多種形式，繼而結(jié)合生物傳感器、色譜、質(zhì)譜（MS）等進(jìn)行分析檢測。

核酸適配體在質(zhì)譜中的應(yīng)用研究可分為兩類模式： 一類是針對所形成靶分子-適配體復(fù)合物的天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)譜表征; 另一類是利用親和材料，由生物相容性載體（如磁珠、樹脂、納米粒子等，負(fù)載適配體親和分子）對分析物靶分子進(jìn)行特異性提取、富集和凈化，再對所捕獲到的分析物進(jìn)行質(zhì)譜分析。適配體可作為離線前處理式親和材料，需要采取合適的洗脫方式洗脫相對純凈的分析物，再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定或液相色譜-質(zhì)譜定量分析; 或直接用于在線親和捕獲富集和質(zhì)譜靶向鑒定/測定“一體化”分析。

2?適配體在質(zhì)譜分子相互作用表征中的應(yīng)用

盡管已產(chǎn)生了具有高親和力和選擇性的多種靶分子的適配體，但缺乏高分辨率的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)以及當(dāng)前各種生物物理表征方法的局限性等因素極大地阻礙了對適配體-靶分子相互作用機(jī)理的研究。質(zhì)譜技術(shù)，特別是高分辨質(zhì)譜技術(shù)，是靶分子-適配體相互作用表征的有力工具，可提供復(fù)合物分子量、結(jié)合比、選擇性以及相互作用位點(diǎn)解析等多種信息。但是， 當(dāng)適配體作為相互作用分子之一時(shí)，難點(diǎn)在于包括寡核苷酸在內(nèi)的生物大分子電離效率低、相互作用結(jié)合位點(diǎn)解析困難，相互作用結(jié)構(gòu)易受周圍環(huán)境影響等，優(yōu)點(diǎn)在于可以創(chuàng)造環(huán)境保持靶分子-適配體復(fù)合物的天然構(gòu)象、特異性強(qiáng)、免標(biāo)記、檢測快速、樣品量低、高通量等?；|(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）和液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-ESI-MS/MS）是其中的代表性技術(shù)，交聯(lián)結(jié)合質(zhì)譜（XL-MS）、非變性質(zhì)譜（Native MS）、氫/氘交換質(zhì)譜（HDX MS）、自上而下質(zhì)譜（Top-Down MS）、離子淌度聯(lián)用質(zhì)譜（IMS-MS）等工具則為之注入了新的活力。

引入化學(xué)交聯(lián)方法，可精確繪制相互作用位點(diǎn)圖譜。1999年，Golden等[3]首次利用ESI-MS鑒定了堿性成纖維生長因子155（bFGF155）與其內(nèi)嵌5-溴-2-脫氧尿嘧啶（BrdU）的61 mer 適配體復(fù)合物，分別使用胰蛋白酶酶解、蛇毒磷酸二酯酶/堿性磷酸酶酶解，結(jié)合碰撞誘導(dǎo)電離（CID），確定出結(jié)合位點(diǎn)為bFGF155的一條九肽TGQY133KLGSK與61 mer適配體中的一個(gè)二聚核苷酸等。2017年，Lu等[4]結(jié)合XL-MS，設(shè)計(jì)了一種新穎的多功能化學(xué)探針，其結(jié)構(gòu)中含有組蛋白H4的適配體序列、生物素標(biāo)簽、用于光交聯(lián)的芳基疊氮光敏基團(tuán)，以及使適配體與組蛋白易于解離的二硫鍵，實(shí)現(xiàn)了組蛋白H4的選擇性標(biāo)記和高效富集，并首次揭示出組蛋白H4與其適配體的結(jié)合區(qū)域處于N-末端尾部。

對非共價(jià)復(fù)合物可以直接進(jìn)行質(zhì)譜表征，無需化學(xué)交聯(lián)。2005年，Keller等[5]報(bào)道了小分子（如妥布霉素、三磷酸腺苷（ATP）和核黃素等）與各自適配體在ESI-MS中的識別行為，發(fā)現(xiàn)氫鍵、π-π堆積對相互作用起到主要作用，但某些高親和性適配體在氣態(tài)電離時(shí)因?yàn)楦邘靵龀饬Χ鴮?dǎo)致穩(wěn)定性下降。2018年， Gulbakan等[6]首次使用非變性ESI-IMS-MS，提供了大量關(guān)于小分子（如腺苷、L-精氨酰胺、可卡因等）與適配體相互作用的基礎(chǔ)信息（圖1），發(fā)現(xiàn)電荷狀態(tài)與適配體寡陰離子構(gòu)象間的相關(guān)性，提示適配體-小分子相互作用在較低電荷態(tài)的復(fù)合物離子中得到更好保留，而較高電荷態(tài)的復(fù)合物離子在氣相中更易解離，并揭示了化學(xué)計(jì)量結(jié)合比、結(jié)合特異性、小分子選擇性以及適配體-小分子結(jié)合中的協(xié)同作用等。

2013年，Chen等[7]首次報(bào)道了蛋白質(zhì)-適配體復(fù)合物在MALDI-MS中的成功表征，僅需低樣品量（1 pmol）和小體積（1～10 μL），使用非酸性基質(zhì)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶（ATT），可觀察到凝血酶-凝血酶適配體（TBA）15/TBA29、血小板衍生生長因子-AB/BB及其適配體的非共價(jià)復(fù)合物峰，并可用于親和力高低排序。2014年，Trelle等[8]利用HDX-MS研究了RNA適配體對靶蛋白-纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1）的構(gòu)象影響。PAI-1存在從活性構(gòu)象到無活性構(gòu)象（潛在狀態(tài)）的過渡，此種過渡是折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域未被共價(jià)修飾時(shí)可發(fā)生的最大的構(gòu)象變化之一。研究發(fā)現(xiàn)，加入RNA適配體使RAI-1攝取氘的速率明顯下降，活性構(gòu)象得以穩(wěn)定，進(jìn)一步證實(shí)了適配體結(jié)合區(qū)域?qū)儆谶^渡態(tài)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定區(qū)域（圖2）。

非變性質(zhì)譜是揭示結(jié)合比和推測結(jié)合位點(diǎn)的有力工具。2017年，Zhang等[9]通過高分辨傅立葉變換離子回旋共振（FTICR-MS）及四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-MS/MS）表征了凝血酶-TBA復(fù)合物。凝血酶和TBA15結(jié)合比受溶液離子強(qiáng)度影響，20～200 mmol/L NH4Ac存在時(shí)，凝血酶-TBA復(fù)合物呈1∶2型到1∶1型的變化，反映了該相互作用受靜電作用調(diào)控的特性，進(jìn)一步根據(jù)電子捕獲電離（ECD）-MS推斷出凝血酶和TBA間的可能結(jié)合位點(diǎn)為其纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)，與晶體學(xué)數(shù)據(jù)一致。

3?適配體作為離線型親和材料

目前， 以適配體作為離線型親和材料的研究主要集中于適配體在不同類型支撐材料上的多種偶聯(lián)策略研究，如金納米粒子（AuNPs）、微（納）磁性材料、氧化石墨烯（GO）、金屬有機(jī)框架（MOF）[10]、微流控系統(tǒng)[11]、微陣列[12]、固相微萃取纖維[13]、紙基底[14]等，從而實(shí)現(xiàn)高偶聯(lián)效率、適當(dāng)密度和高捕獲效率，這為適配體親和質(zhì)譜離線應(yīng)用提供了靈活選擇。相較于免疫捕獲-質(zhì)譜解析這一生物功能分子發(fā)現(xiàn)鑒定主要思路，適配體的應(yīng)用在很大程度上克服了抗體的交叉反應(yīng)活性問題。對于適配體自身的抗核酸酶穩(wěn)定性、耐用性等，一般通過體外篩選過程或篩選后的化學(xué)修飾得到克服。

其中，適配體功能化微（納）磁性材料得到了廣泛關(guān)注，其用于富集提取時(shí)可方便實(shí)現(xiàn)磁性分離，可單獨(dú)使用，也可與其它納米材料復(fù)合使用。例如，對于金屬離子和小分子，Shamsipur等[15]發(fā)展了適配體功能化的復(fù)合型磁性納米粒子-GO材料（MNPs/GO），捕獲全血和尿液中的痕量Pb2+后進(jìn)行電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定，檢出限（LOD）低至50 ng/L。Lin等[16]以聚多巴胺（PDA）為單層吸附介質(zhì)，通過戊二醛共價(jià)偶聯(lián)制備了適配體功能化磁性MOF的新型分散固相萃取吸附劑M@PDA@UiO-66-Apt，可從土壤樣品中高效選擇性富集提取痕量多氯聯(lián)苯（PCB）72和PCB106，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）分析，LOD為10～15 ng/L，該吸附劑還可經(jīng)洗脫后重復(fù)使用。該研究組隨后還報(bào)道了新型的適配體功能化攪拌棒吸附萃取方法，GC-MS/MS對PCB72和PCB106的LOD可達(dá)3～4 ng/L，并成功用于PCB富集系數(shù)高的魚類樣品測定[17]。

2020年，Zeng等[18]構(gòu)建了基于超支化適配體（HB-Apt）的核殼型金磁粒子（M@AuNPs），進(jìn)而吸附到磁力攪拌子上形成生物活性涂層，所提取富集的PCB72和PCB106可在乙醇中攪拌脫附后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分離及定量分析，獲得了極高靈敏度（3～5 pg/g），該涂層可以循環(huán)使用至少60次。Zhang等[19]開發(fā)了一種適配體功能化的Mg/Al層狀雙氫氧化物磁性介孔碳（2～50 nm）型磁性固相萃取吸附劑，具備良好的化學(xué)穩(wěn)定性，可特異性捕獲痕量氯霉素，再經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析，LOD低至0.30 ng/L（0.94 pmol/L），并成功用于復(fù)雜血清、奶粉、魚和雞肉樣品中的氯霉素測定。

靶蛋白鑒定與檢測方面，多經(jīng)不同材料（磁珠[20]、親和柱、MNPs、復(fù)合磁性GO-AuNPs材料[21]、AuNPs/共價(jià)有機(jī)框架（COFs）等[22]）或模塊（微流控芯片[23]、微陣列等）提取富集洗脫后，或繼續(xù)經(jīng)胰蛋白酶酶解，再提交至MALDI-MS或LC-MS/MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定或定量測定，提供了快速、靈敏的（多重）生物標(biāo)志物分析新途徑。Xiong等[24]首次合成了適配體功能化磁性介孔SiO2/ Au納米復(fù)合材料，用于胰島素檢測，介孔材料的SiO2殼具有窄孔徑分布（約2.9 nm），賦予其出色的尺寸排阻效應(yīng)，7種不同尺寸的高豐度蛋白不造成任何干擾，LOD為 2 μg/L。 Wang等[25]構(gòu)建了適配體功能化磁性MOF@Au，實(shí)現(xiàn)了人血清中胰島素的快速靈敏檢測， 其LOD為2 μg/L。

2019年， Chen等[26]制備了適配體功能化的層層自組裝GO-AuNPs納米復(fù)合材料，適配體的負(fù)載密度高達(dá)33.1 nmol/mg。該復(fù)合材料中，多支化聚乙烯亞胺有效吸附到AuNPs表面且顯著增強(qiáng)了該載體的親水性，有利于去除非特異性吸附。與傳統(tǒng)酸提取法不能特異富集組蛋白相比，該材料可從核蛋白中高效特異捕獲組蛋白，并快速有效發(fā)現(xiàn)其翻譯后修飾的甲基化位點(diǎn)。2020年，Lupu等[27]針對人肝細(xì)胞生長因子的糖基化受體酪氨酸激酶C-Met及其兩株DNA適配體，通過蛋白酶解表位提取質(zhì)譜結(jié)合表面等離子體共振技術(shù)（PROTEX-SPR-MS），鑒定了相互作用位點(diǎn)和親和力。適配體共價(jià)偶聯(lián)的瓊脂糖微型親和柱與胰蛋白酶酶解后的C-Met肽段孵育后洗脫，再進(jìn)行MALDI-MS鑒定，發(fā)現(xiàn)了不同相互作用位點(diǎn)，方法簡捷高效。

近年來，出現(xiàn)了大規(guī)模適配體聯(lián)用進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的臨床樣本應(yīng)用研究報(bào)道。早在2008年，Berezovski等[28]已報(bào)道了適配體促進(jìn)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)（AptaBiD）技術(shù)，用于區(qū)分成熟和未成熟的活樹突細(xì)胞的表面生物標(biāo)志物，AptaBiD使用無偏向的適配體池，不需要適配體序列鑒定; 存在對不同靶蛋白的累積作用，在細(xì)胞分離中作用更強(qiáng)、更有效，從而結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)解釋全面的生物標(biāo)志物。2010年，SELEX技術(shù)發(fā)明者之一Gold等[29]發(fā)布了旨在分析臨床樣品的基于適配體的新型多重蛋白質(zhì)組學(xué)平臺SOMAscan（圖3）， 針對70 μL血漿或20 μg蛋白質(zhì)樣品，可通過1129種獨(dú)特的慢解離型適配體SOMAmers同時(shí)定量測定1095種蛋白質(zhì)，動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)8個(gè)數(shù)量級，具備高靈敏度（40 fmol/L）和高特異性。已應(yīng)用于血清、血漿、腦脊液、細(xì)胞提取物、腹水和外泌體[30～32]等。2018年，Jacob等[33]拓展使用SOMAscan，同時(shí)分析了4783種人類蛋白質(zhì)，驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)了多種心肌損傷的早期生物標(biāo)志物，樣品通量遠(yuǎn)高于其它現(xiàn)有的蛋白組組學(xué)方法。2020年，SOMAscan方法所鑒定出的血清蛋白變化還用于區(qū)分?jǐn)⊙Y和非感染性全身性炎癥[34]。

除利用適配體或適配體功能化支撐材料直接捕獲分析外，還出現(xiàn)了其它新穎思路和方法。2017年，Ahmad等[35]報(bào)道了一種條形碼DNA介導(dǎo)的信號放大策略，首先使用TBA15功能化的磁珠捕獲凝血酶，并與TBA29和條形碼DNA分子共同修飾的AuNPs一起形成夾心結(jié)構(gòu); 磁分離收集復(fù)雜基質(zhì)（如人血清中的夾心復(fù)合物）后，用KCN溶解AuNPs，釋放出的條形碼DNA分子用于MALDI-MS檢測。該策略展示了寬達(dá)7個(gè)數(shù)量級的線性范圍和極佳的靈敏度，LOD為33 fg/L（0.89 amol/L）。最近，適配體功能化AuNPs標(biāo)記技術(shù)結(jié)合ICP-MS還被用于靈敏、特異的細(xì)胞計(jì)數(shù)，例如，結(jié)合磁珠富集，對血清中的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的靈敏度為100cell/mL[36]; 結(jié)合熒光和AuNPs雙標(biāo)記適配體探針，對于全血中的MCF-7細(xì)胞，靈敏度為81cell/mL，同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)熒光成像[37]。適配體功能化離線型新材料及應(yīng)用見電子版文后支持信息表S1。

4?適配體用于在線親和捕獲富集和質(zhì)譜鑒定/測定 “一體化”分析

適配體分子與MALD-MS結(jié)合使用時(shí)，可實(shí)現(xiàn)在線親和捕獲富集和質(zhì)譜原位靶向鑒定/測定（“On-target”）的“一體化”分析，將適配體的特異性親和捕獲富集凈化特性與MALDI-MS的原位解吸附電離能力完美契合，從而具備從復(fù)雜基質(zhì)中直接提取鑒定痕量分析物的能力。2004年，Dick等[38]發(fā)表了首篇適配體親和分子在質(zhì)譜中的應(yīng)用報(bào)道，即在線捕獲-MALDI-MS方面的成功應(yīng)用。將TBA共價(jià)結(jié)合在MALDI靶板載玻片表面，從血漿中捕獲了凝血酶和凝血酶原。經(jīng)洗滌有效去除大量非特異蛋白后，加入常用的小分子有機(jī)弱酸基質(zhì)使得TBA的GQ結(jié)構(gòu)打開，將靶蛋白從載玻片上解離下來后，直接進(jìn)行MALDI-MS檢測。這種捕獲/釋放/分析過程還可以循環(huán)實(shí)現(xiàn)。類似方法還用于從血清中2個(gè)重復(fù)長度的胰島素連接多態(tài)性區(qū)域（ILPR2）特異性捕獲胰島素[39]和pmol/L水平的免疫球蛋白E等[40]。

從早期直接共價(jià)偶聯(lián)適配體檢測完整蛋白質(zhì)的思路擴(kuò)展，近年來多將適配體交聯(lián)在支撐材料表面捕獲多肽、靶蛋白， 并進(jìn)行原位快速酶解，再加入α-氰基-4-羥基肉桂酸、2，5-二羥基苯甲酸、芥子酸等有機(jī)基質(zhì)進(jìn)行MALDI-MS鑒定或測定，克服了免疫親和型MALDI-MS原位酶解時(shí)抗體分子本身發(fā)生酶解而產(chǎn)生高背景，嚴(yán)重干擾鑒定結(jié)果的缺陷。如Zhang等[41]將適配體共價(jià)交聯(lián)到MALDI靶板金膜表面，成功地選擇性檢出了復(fù)雜基質(zhì)（如人血清）中濃度低至20 μg/L的胰島素，還可從未稀釋的人體尿液中高靈敏地檢出低至66 μg/L的溶菌酶[42]。

2014年，Lee等[43]首次將適配體親和分子與整合選擇性富集靶標(biāo)（ISET）策略結(jié)合使用（圖4）。通過適配體功能化微珠，可從血清樣品中特異性捕獲低至0.37 ng/L（10 fmol/L）的凝血酶。ISET芯片既是樣品制備平臺，也是MALDI靶板，內(nèi)含96個(gè)納米孔道，每個(gè)納米孔道底端含有多個(gè)出口通道以容納微珠; 所有操作均在一孔中進(jìn)行，不產(chǎn)生樣品轉(zhuǎn)移，樣品損失和污染風(fēng)險(xiǎn)均非常低。使用時(shí)適配體功能化微珠首先捕獲靶蛋白，然后加入到納米孔中，酶解后加入有機(jī)基質(zhì)，低真空度下在ISET靶板背面緩慢形成均勻結(jié)晶，反轉(zhuǎn)ISET靶板即可高效、便捷地進(jìn)行MALDI-MS分析，較之基于抗體的ISET，靈敏度顯著增加。

適配體型納米器件還可在免有機(jī)基質(zhì)模式下進(jìn)行MALDI-MS分析鑒定，克服了該技術(shù)在低質(zhì)量段（<700 Da）眾多基質(zhì)峰的干擾。此模式被稱為激光解吸電離-質(zhì)譜（LDI-MS）或表面輔助激光解吸電離質(zhì)譜（SALDI-MS）。2007年，Huang等[44]基于適配體偶聯(lián)AuNPs首次直接實(shí)現(xiàn)ATP的LDI-MS，LOD為0.24 mg/L（0.48 μmol/L）。2012年， Guobakan等[45]首次報(bào)道了適配體共價(jià)偶聯(lián)GO雙功能平臺，在復(fù)雜基質(zhì)中成功選擇性富集并實(shí)現(xiàn)了靶分子（如可卡因、腺苷等）的高效電離，較之單用GO作為表面輔助基質(zhì)時(shí)的背景干擾大為降低。2015年，Gan等[46]開發(fā)了適配體功能化的SiO2@AuNPs，用于復(fù)雜生物樣本中同時(shí)靶向富集和檢測卡那霉素，牛奶基質(zhì)中的LOD為0.58 μg/L（1 nmol/L）。目前所報(bào)道的適配體型納米器件及應(yīng)用還包括單壁碳納米角檢測ATP[47]、金錳氧化物（Au@MnO）雜化納米花靶向腫瘤細(xì)胞并檢測裂解液中的ATP[48]等。

納米材料在LDI-MS中除作為表面輔助基質(zhì)外，還可形成特征性的質(zhì)量標(biāo)記型探針，結(jié)合適配體的特異結(jié)合能力，可使探針的MS信號強(qiáng)度與分析物濃度成比例關(guān)系。Liu等[49]將TBA29選擇性捕獲凝血酶后的復(fù)合物濃縮沉積到硝酸纖維素膜（NCM）上，AuNPs/NCM形成高效無背景干擾的表面輔助基質(zhì)，有效消除了僅AuNPs作為基質(zhì)時(shí)諸多背景峰的干擾。凝血酶的結(jié)合降低了AuNPs表面上金簇原子的解吸和電離效率，引起MS中金簇信號強(qiáng)度的下降，以金簇信號作為高增強(qiáng)的靶蛋白標(biāo)記探針，對凝血酶具有高靈敏度（LOD 1.8 ng/L，即50 fmol/L）和高選擇性（其它1000倍蛋白質(zhì)無干擾）。2015年，Chiu等發(fā)展了靶向粘蛋白1（MUC1）適配體修飾的二維金納米膜，首次將LDI-MS用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，可檢測到每毫升血液樣本中低達(dá)10個(gè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[50]。納米材料輔助LDI-MS也可用于實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的高靈敏質(zhì)譜成像標(biāo)記，例如 MUC1適配體修飾的AuNPs/GO[51]、核仁素適配體高密度功能化核殼型衛(wèi)星狀A(yù)uNPs[52]，最低可檢測到100個(gè)腫瘤細(xì)胞。2018年Han等[53]報(bào)告了一種基于單鏈DNA與AuNPs的質(zhì)量標(biāo)簽間的競爭性非共價(jià)相互作用平臺，可使用MALDI-MS靈敏檢測生物標(biāo)志物前列腺特異性抗原，LOD達(dá)到57 ng/L，較之傳統(tǒng)光譜法提高了約兩個(gè)數(shù)量級。2019年， Zhu等[54]向LDI-MS引入可與適配體形成競爭性吸附的小分子質(zhì)量標(biāo)簽三聚氰胺，適用于臨床和疫苗樣品中的人乳頭瘤病毒HPV 16 L1蛋白定量，LOD為58.8 ng/L。

近年來，適配體親和分子也在飛速發(fā)展的常壓原位電離技術(shù)和質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF-MS）中得到了成功應(yīng)用，2017年，Zargar等[55]在紙噴霧電離-離子遷移譜（PSI-IMS）中，引入適配體固定化的纖維素紙，紙基底不僅作為電離源，而且還用于固定適配體以選擇性提取分析物; 連續(xù)溶劑流同時(shí)作為洗脫和噴霧溶劑，可待因等分析物經(jīng)基于適配體的選擇性薄膜微萃取后洗脫、解吸和電離，靈敏度在μg/L水平。類似的還有碳點(diǎn)或碳納米管修飾適配體改性纖維素紙噴霧檢測血漿或唾液中甲基安非他明的報(bào)道，LOD為0.45～0.60 μg/L[56]。CyTOF-MS使用元素標(biāo)簽代替熒光團(tuán)，利用ICP-MS技術(shù)對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，多使用穩(wěn)定稀土金屬同位素標(biāo)記抗體，檢測特定的細(xì)胞特征。2018年，Mironov等[57]基于人酪氨酸激酶7受體的生物素化適配體，與165Ho標(biāo)記的親和素結(jié)合，通過CyTOF-MS鑒定陽性（人急性淋巴細(xì)胞白血?。┖完幮裕ㄈ薆urkitt淋巴瘤）細(xì)胞，顯示了良好的抗體替代性及與流式細(xì)胞術(shù)的可比性。

LC-MS、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS）的在線富集方面，Gan等[58]制備了磁固相萃?。∕SPE）適用的適配體磁性吸附劑（M@PDA@Apt），并開發(fā)了在線MSPE-LC-MS方法，用于測定尿液中同時(shí)存在的8-羥基-2′-脫氧鳥苷和單羥基化多環(huán)芳烴。與離線MSPE相比，在線方法的靈敏度提高了30～400倍，LOD為28～114 ng/L[59]。2020年， Pero-Gascon等[60]報(bào)道了一種在線適配體親和固相萃?。⊿PE）CE-MS方法，預(yù)濃縮、分離和測定了血液中的α-突觸核蛋白，LOD為0.2 mg/L，較之未耦合在線富集方法的靈敏度提高100倍。適配體功能化在線型新材料及用途見電子版文后支持信息表S2。

5?展 望

未來，核酸適配體將繼續(xù)以其高親和性、高特異性特點(diǎn)，結(jié)合適配體自身作為核酸分子的可擴(kuò)增性、互補(bǔ)競爭特性，及在納米材料上的多種復(fù)合功能化特性，在質(zhì)譜分析測定方面得到廣泛應(yīng)用。（1）開發(fā)特異性更強(qiáng)、親和力更高、穩(wěn)定性更好的適配體，例如引入化學(xué)修飾堿基，增強(qiáng)與靶分子的相互作用力; 通過生物信息學(xué)方法改善適配體性能，包括模擬適配體選擇、基于片段的適配體設(shè)計(jì)、高通量測序等; （2）拓展適配體更多的識別模式，從堿基修飾、GQ高級結(jié)構(gòu)的形成與促進(jìn)、多價(jià)適配體、適配體互補(bǔ)序列引導(dǎo)精確“投放”等多種途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)改造。例如，酶聯(lián)信號分子以及互補(bǔ)序列引導(dǎo)原位酶增強(qiáng)酶解等，從而實(shí)現(xiàn)靶蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定與區(qū)分，并提高選擇性和靈敏度，降低假陽性率; （3）結(jié)合更高效的載體，如新型納米材料、新型聚合物、主體分子等，優(yōu)化不同親和元件的核心路徑，特別是深入揭示適配體功能化載體的表面識別特性，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中低豐度靶分子、靶分子-適配體復(fù)合物的高靈敏高特異檢測，以及提高質(zhì)譜成像的質(zhì)量; （4）與高通量篩選評價(jià)、蛋白質(zhì)組學(xué)等結(jié)合，在蛋白質(zhì)功能調(diào)控、新藥發(fā)現(xiàn)、臨床診療領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

References

1?Rthlisberger P， Hollenstein M. Adv. Drug Deliv. Rev.， ?2018， 134： 3-21

2?Dunn M R， Jimenez R M， Chaput J C. Nat. Rev. Chem.， ?2017， ?1（10）： 0076

3?Golden M C， Resing K A， Collins B D， Willis M C， Koch T H. Protein Sci.， ?1999， ?8（12）： 2806-2812

4?Lu C， Tian S， Zhai G， Yuan Z， Li Y， He X， Zhang Y， Zhang K. ACS Chem. Biol.， ?2017， ?12（1）： 57-62

5?Keller K M， Breeden M M， Zhang J M， Ellington A D， Brodbelt J S. J. Mass Spectrom.， ?2005， ?40（10）： 1327-1337

6?Gulbakan B， Barylyuk K， Schneider P， Pillong M， Schneider G， Zenobi R. J. Am. Chem. Soc.， ?2018， ?140（24）： 7486-7497

7?Chen F， Gulbakan B， Zenobi R. Chem. Sci.， ?2013， ?4（10）： 4071-4078

8?Trelle M B， Dupont D M， Madsen J B， Andreasen P A， Jorgensen T J. ACS Chem. Biol.， ?2014， ?9（1）： 174-182

9?Zhang J， Loo R R O， Loo J A. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， ?2017， ?28（9）： 1815-1822

10?Zhang Q， Yang Y， Zhi Y， Wang X， Wu Y， Zheng Y. J. Sep. Sci.， ?2019， ?42（3）： 716-724

11?Nguyen T H， Pei R J， Qiu C M， Ju J Y， Stojanovic M， Lin Q. J. Microelectromech. Syst.， ?2009， ?18（6）： 1198-1207

12?Ahn J Y， Lee S W， Kang H S， Jo M， Lee D K， Laurell T， Kim S. J. Proteome Res.， ?2010， ?9（11）： 5568-5573

13?Mu L， Hu X， Wen J， Zhou Q. J. Chromatogr. A， ?2013， ?1279： 7-12

14?Hashemian Z， Khayamian T， Saraji M. Anal. Bioanal. Chem.， ?2015， ?407（6）： 1615-1623

15?Shamsipur M， Farzin L， Amouzadeh Tabrizi M， Sheibani S. Mater. Sci. Eng. C， ?2017， ?77： 459-469

16?Lin S， Gan N， Cao Y， Chen Y， Jiang Q. J. Chromatogr. A， ?2016， ?1446： 34-40

17?Lin S， Gan N， Zhang J， Qiao L， Chen Y， Cao Y. Talanta， ?2016， ?149： 266-274

18?Zeng J， Wang Q， Gao J， Wang W， Shen H， Cao Y， Hu M， Bi W， Gan N. J. Chromatogr. A， ?2020： ?1614： 460715

19?Zhang Q， Zhou Q， Yang L， Wang X， Zheng Y， Bao L. J. Sep. Sci.， ?2020， ?43（13）： 2610-2618

20?Cho S， Lee S H， Chung W J， Kim Y K， Lee Y S， Kim B G. Electrophoresis， ?2004， ?25（21-22）： 3730-3739

21?Xiong Y， Deng C， Zhang X. Talanta， ?2014， ?129： 282-289

22?Ge K， Peng Y， Lu Z， Hu Y， Li G. J. Chromatogr. A， ?2020， ?1615： 460741

23?Yang J， Zhu J， Pei R， Oliver J A， Landry D W， Stojanovic M N， Lin Q. Anal. Methods， ?2016， ?8（26）： 5190-5196

24?Xiong Y， Deng C， Zhang X， Yang P. ACS Appl. Mater. Interfaces， ?2015， ?7（16）： 8451-8456

25?Wang Z， Hu X， Sun N， Deng C. Anal. Chim. Acta， ?2019， ?1087： 69-75

26?Chen Y， Jiang B， Hu Y， Deng N， Zhao B， Li X， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Electrophoresis， ?2019， ?40（16-17）： 2135-2141

27?Lupu L， Wiegand P， Huettmann N， Rawer S， Kleinekofort W， Shugureva I， Kichkailo A S， Tomilin F N， Lazarev A， Berezovski M V， Przybylski M. ChemMedChem， ?2020， ?15（4）： 363-369

28?Berezovski M V， Lechmann M， Musheev M U， Mak T W， Krylov S N. J. Am. Chem. Soc.， ?2008， ?130（28）： 9137-9143

29?Gold L， Ayers D， Bertino J， Bock C， Bock A， Brody E N， Carter J， Dalby A B， Eaton B E， Fitzwater T， Flather D， Forbes A， Foreman T， Fowler C， Gawande B， Goss M， Gunn M， Gupta S， Halladay D， Heil J， Heilig J， Hicke B， Husar G， Janjic N， Jarvis T， Jennings S， Katilius E， Keeney T R， Kim N， Koch T H， Kraemer S， Kroiss L， Le N， Levine D， Lindsey W， Lollo B， Mayfield W， Mehan M， Mehler R， Nelson S K， Nelson M， Nieuwlandt D， Nikrad M， Ochsner U， Ostroff R M， Otis M， Parker T， Pietrasiewicz S， Resnicow D I， Rohloff J， Sanders G， Sattin S， Schneider D， Singer B， Stanton M， Sterkel A， Stewart A， Stratford S， Vaught J D， Vrkljan M， Walker J J， Watrobka M， Waugh S， Weiss A， Wilcox S K， WolfsonA， Wolk S K， Zhang C， Zichi D. PLoS One， ?2010， ?5（12）： e15004

30?Hathout Y， Brody E， Clemens P R， Cripe L， Delisle R K， Furlong P， Gordish-Dressman H， Hache L， Henricson E， Hoffman E P， Kobayashi Y M， Lorts A， Mah J K， Mcdonald C， Mehler B， Nelson S， Nikrad M， Singer B， Steele F， Sterling D， Sweeney H L， Williams S， Gold L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2015， ?112（23）： 7153-7158

31?Billing A M， Ben Hamidane H， Bhagwat A M， Cotton R J， Dib S S， Kumar P， Hayat S， Goswami N， Suhre K， Rafii A， Graumann J. J. Proteomics， ?2017， ?150： 86-97

32?Finkernagel F， Reinartz S， Schuldner M， Malz A， Jansen J M， Wagner U， Worzfeld T， Graumann J， Von Strandmann E P， Mueller R. Theranostics， ?2019， ?9（22）： 6601-6617

33?Jacob J， Ngo D， Finkel N， Pitts R， Gleim S， Benson M D， Keyes M J， Farrell L A， Morgan T， Jennings L L， Gerszten R E. Circulation， ?2018， ?137（12）： 1270-1277

34?Shubin N J， Navalkar K， Sampson D， Yager T D， Cermelli S， Seldon T， Sullivan E， Zimmerman J J， Permut L C， Piliponsky A M. Crit. Care Med.， ?2020， ?48（1）： E48-E57

35?Ahmad R， Jang H， Batule B S， Park H G. Anal. Chem.， ?2017， ?89（17）： 8966-8973

36?Yang W J， Xi Z M， Zeng X X， Fang L， Jiang W J， Wu Y N， Xu L J， Fu F F. J. Anal. At. Spectrom.， ?2016， ?31（3）： 679-685

37?Yang B， Chen B， He M， Yin X， Xu C， Hu B. Anal. Chem.， ?2018， ?90（3）： 2355-2361

38?Dick L W， Mcgown L B. Anal. Chem.， ?2004， ?76（11）： 3037-3041

39?Connor A C， Frederick K A， Morgan E J， Mcgown L B. J. Am. Chem. Soc.， ?2006， ?128（15）： 4986-4991

40?Cole J R， Dick L W， Morgan E J， Mcgown L B. Anal. Chem.， ?2007， 79（1）： 273-279

41?Zhang X Y， Zhu S C， Deng C H， Zhang X M. Chem. Commun. （Camb.）， ?2012， ?48（21）： 2689-2691

42?Zhang X， Zhu S， Xiong Y， Deng C， Zhang X. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2013， ?52（23）： 6055-6058

43?Lee S J， Adler B， Ekstrom S， Rezeli M， Vegvari A， Park J W， Malm J， Laurell T. Anal. Chem.， ?2014， ?86（15）： 7627-7634

44?Huang Y F， Chang H T. Anal. Chem.， ?2007， ?79（13）： 4852-4859

45?Gulbakan B， Yasun E， Shukoor M I， Zhu Z， You M， Tan X， Sanchez H， Powell D H， Dai H， Tan W. J. Am. Chem. Soc.， ?2010， ?132（49）： 17408-17410

46?Gan J， Wei X， Li Y， Wu J， Qian K， Liu B. Nanomedicine， ?2015， ?11（7）： 1715-1723

47?Ma R， Lu M， Ding L， Ju H， Cai Z. Chem. Eur. J.， ?2013， ?19（1）： 102-108

48?Ocsoy I， Gulbakan B， Shukoor M I， Xiong X， Chen T， Powell D H， Tan W. ACS Nano， ?2013， ?7（1）： 417-427

49?Liu Y C， Chang H T， Chiang C K， Huang C C. ACS Appl. Mater. Interfaces， ?2012， ?4（10）： 5241-5248

50?Chiu W J， Ling T K， Chiang H P， Lin H J， Huang C C. ACS Appl. Mater. Interfaces， ?2015， ?7（16）： 8622-8630

51?Huang R C， Chiu W J， Lai P J， Huang C C. Sci. Rep.， ?2015， ?5： 10292

52?Tseng Y T， Harroun S G， Wu C W， Mao J Y， Chang H T， Huang C C. Nanotheranostics， ?2017， ?1（2）： 141-153

53?Han J， Li Y， Zhan L， Xue J， Sun J， Xiong C， Nie Z. Chem. Commun. （Camb.）， ?2018， ?54（76）： 10726-10729

54?Zhu L， Han J， Wang Z， Yin L， Zhang W， Peng Y， Nie Z. Analyst， ?2019， ?144（22）： 6641-6646

55?Zargar T， Khayamian T， Jafari M T. J. Pharm. Biomed. Anal.， ?2017， ?132： 232-237

56?Zargar T， Khayamian T， Jafari M T. Microchim. Acta， ?2018， ?185（2）： 103

57?Mironov G G， Bouzekri A， Watson J， Loboda O， Ornatsky O， Berezovski M V. Anal. Bioanal. Chem.， ?2018， ?410（13）： 3047-3051

58?Gan H， Xu H. Anal. Chim. Acta， ?2018， ?1008： 48-56

59?Gan H， Xu H. Talanta， ?2019， ?201： 271-279

60?Pero-Gascon R， Benavente F， Minic Z， Berezovski M V， Sanz-Nebot V. Anal. Chem.， ?2020， ?92（1）： 1525-1533