高選擇性過氧化亞硝酰熒光探針的合成及性能研究

后際挺 王冰雅 鄭凌云

摘?要?過氧化亞硝酰（ONOO）是生物體系中重要活性氧之一，對(duì)其高效檢測(cè)一直備受關(guān)注。本研究以4-二乙基氨基水楊醛和6-甲氧基-1-萘滿酮為原料，經(jīng)一步有機(jī)反應(yīng)，合成了一種帶氧鎓正離子的熒光探針PFP，用于檢測(cè)ONOO。通過紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜系統(tǒng)考察了探針PFP對(duì)ONOO的光學(xué)響應(yīng)。結(jié)果表明，此探針具有選擇性好、靈敏度高（檢出限為15.5 nmol/L）、響應(yīng)快速（數(shù)秒內(nèi)）、Stokes位移較大（42 nm）、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，探針PFP具有良好的生物相容性，探針濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率>95%。激光掃描共聚焦顯微成像結(jié)果表明，此探針可用于活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO的熒光成像研究。

關(guān)鍵詞?熒光探針; 活性氧; 過氧化亞硝酰; 細(xì)胞成像

1?引 言

作為細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）之一，過氧化亞硝酰（ONOO）是由一氧化氮（NO）和超氧根自由基（O·2）以1∶1的化學(xué)計(jì)量比，通過擴(kuò)散控制的反應(yīng)方式生成（k = 0.4×1010～1.9 ×1010 L/（mol s））[1]。由于其強(qiáng)氧化性，ONOO具有抗微生物和抗菌活性[2]; 同時(shí)，ONOO在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著重要作用[3]。然而，細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)的ONOO可引起生物大分子損傷，如DNA和蛋白質(zhì)的硝化失活[4～6]; 另外，ONOO還可引起線粒體功能失調(diào)。近年的研究表明， ONOO參與多種病理生理過程，如心血管疾病、炎癥、癌癥、藥物引起的肝中毒等[7～10]，因此，ONOO被認(rèn)為是一種疾病診斷的生物標(biāo)志物[10]。

基于ONOO重要的生理功能，開發(fā)可靠有效的ONOO檢測(cè)手段具有十分重要的意義。目前，由于其高靈敏性、非侵入性成像、高時(shí)空分辨率等優(yōu)點(diǎn)[11～15]，熒光分析法已成為檢測(cè)生物體系中ONOO的最有效手段[16～18]。自2006年Yang等首次報(bào)道高選擇性O(shè)NOO熒光探針以來[19]，研究者合成了許多不同性能的熒光探針， 用于ONOO的檢測(cè)及生物成像研究[20～32]。這些探針與ONOO的作用模式主要有：硫?qū)倩衔锏难趸痆20，21]、硼酸或硼酸酯的氧化水解[22，23]、肼的氧化水解[24，25]、活性CC雙鍵的氧化裂解[26，27]和N-氧化去芳基化[28，29]。雖然這些探針對(duì)ONOO表現(xiàn)出良好的光學(xué)響應(yīng)，且已在生物體系中得到了較為廣泛的應(yīng)用，但都存在一些問題。例如，硼酸酯或硼酸類探針的水溶性較差并且易受HOCl和H2O2的干擾[18]; 含活性CC雙鍵的探針則易受親核性物質(zhì)（如SO23）的影響[33，34]。此外，目前報(bào)道的大多數(shù)ONOO熒光探針的最大發(fā)射波長(zhǎng)λmax<600 nm，易受細(xì)胞內(nèi)背景熒光信號(hào)干擾，不利于活體成像。因此，開發(fā)具有良好水溶性、高選擇性及長(zhǎng)波發(fā)射（λem>600 nm）的熒光探針用于ONOO的生物成像，仍然具有挑戰(zhàn)性。

自2014年以來，本研究組先后以香豆素-吡啶鹽和香豆素-喹啉鹽為探針平臺(tái)，通過活性CC雙鍵的氧化裂解途徑，實(shí)現(xiàn)了ONOO的熒光檢測(cè)[35，36]。該系列探針具有良好的水溶性和選擇性，但其λmax僅約為490 nm，不利于高信噪比熒光成像。最近，本研究組利用吩噻嗪衍生物構(gòu)建了一個(gè)比率熒光探針，與ONOO作用后，λmax可從630 nm藍(lán)移至480 nm，然而該探針?biāo)苄暂^差，需要使用表面活性劑Triton X-100作為助溶劑[37]。

考慮到上述工作的不足，本研究以水楊醛和萘酮為原料，通過一步縮合反應(yīng)制備了一種檢測(cè)ONOO的新型熒光探針PFP。此探針帶有一個(gè)正電荷，具有極佳的水溶性; 同時(shí)，D-A-D電子結(jié)構(gòu)使此探針在628 nm處具有較強(qiáng)熒光。此探針與ONOO反應(yīng)后得到無熒光的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ONOO的長(zhǎng)波檢測(cè)。此探針被成功用于活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO的熒光成像，在ONOO生理功能研究方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JEOL ECZ600R/S3 600 MHz核磁共振儀（日本Jeol Resonance公司，TMS為內(nèi)標(biāo)）; Xevo G2-XS QTof質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）; UV-3900型分光光度計(jì)（日本日立公司）; ?FLS 1000型熒光光譜儀（英國(guó)愛丁堡儀器公司）; Leica TCS SP8動(dòng)態(tài)超高分辨單雙光子激光共聚焦聯(lián)用系統(tǒng)（德國(guó)徠卡公司）。

4-二乙基氨基水楊醛（Ark試劑公司）; 6-甲氧基-1-萘滿酮（安耐吉試劑公司）; 5-氨基-3-（4-嗎啉基）-1，2，3-惡二唑鎓鹽酸鹽（3-Morpholinosydnonimine，SIN-1，阿拉丁試劑公司）; 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和干擾素（Interferon-γ， IFN-γ）（北京索萊寶科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2?探針PFP的合成

合成路線參照文獻(xiàn)[38]并稍作改動(dòng)。具體合成路線如圖1所示，將4-二乙基氨基水楊醛（1.93 g，10 mmol）和6-甲氧基-1-萘滿酮（1.76 g， 10 mmol）溶于20 mL濃H2SO4（98%），Ar保護(hù)下于90℃反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，然后倒入約200 g冰中。攪拌下緩慢加入HOCl4（70%，10 mL），將所得沉淀抽濾，并先后用大量水和少量丙酮洗滌濾渣。干燥后，得2.8 g深紅色固體PFP，產(chǎn)率為65%。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 8.58 （s， 1H）， 8.30 （s， 1H）， 7.87 （d， J=9.3 Hz， 1H）， 7.39 （d， J=9.1 Hz， 1H）， 7.32 （s， 1H）， 6.88 （s， 1H）， 3.67 （q， J=6.7 Hz， 4H）， 3.40 （s， 3H）， 2.97 （s， 4H）， 1.20 （t， J=6.9 Hz， 6H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 163.47， 159.73， 158.62， 155.75， 148.66， 146.44， 132.32， 131.55， 126.34， 120.94， 118.37， 118.18， 118.03， 117.45， 96.37， 45.89， 26.81， 25.06， 16.76， 12.98。TOF MS： calcd.?for C22H24NO+2 334.1802， found 334.1811。

2.3?ROS溶液配制

O·2：用CaH2預(yù)干燥二甲亞砜（DMSO）過夜，然后將其離心（3000 r/min， 20 min），得到無水DMSO后，加入KO2，超聲溶解。

羥基自由基（·OH）：利用FeCl2和過量的H2O2現(xiàn)配現(xiàn)用。

ONOO：將20 mL HCl（0.6 mol/L）和H2O2（0.7 mol/L）的混合溶液與20 mL NaNO2溶液（0.6 mol/L）迅速倒入到冰塊上，1 s內(nèi)倒入20 mL冷的NaOH溶液（1.2 mol/L）。溶液顏色由無色變?yōu)辄S色，然后加入30 mg MnO2除去多余的H2O2，密封，置于20℃保存。利用紫外-可見吸收光譜標(biāo)定其最終濃度（ε302=1670 L/（mol cm））。

H2O2： 將30% H2O2稀釋，通過紫外-可見吸收光譜標(biāo)定其最終濃度（ε240=43.6 L/（mol·cm））。

ClO： 將5% NaOCl稀釋，通過紫外-可見吸收光譜標(biāo)定其最終濃度（ε292=350 L/（mol·cm））。

TBHP（tBuOOH）： 將70% TBHP溶液稀釋至最終濃度為20 mmol/L。

2.4?探針PFP的合成

熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定在PBS溶液中進(jìn)行。使用羅丹明B（ΦS=0.69，甲醇作為溶劑）作為參比。熒光量子產(chǎn)率通過公式（1）計(jì)算：

其中， Φ為熒光量子產(chǎn)率，A為在激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度; F為激發(fā)波長(zhǎng)處激發(fā)后的積分熒光面積; n是溶劑的折射率; 下標(biāo)S和X分別代表參比和未知樣品。

2.5?光譜測(cè)定

配制探針的DMSO母液（5 mmol/L），在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4，10 mmol/L）中進(jìn)行光譜測(cè)試。探針濃度為10 μmol/L，激發(fā)波長(zhǎng)為568 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為1 nm。選擇性實(shí)驗(yàn)中，所需各種底物濃度均為100 μmol/L。

2.6?細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

外源性：將人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)之前，細(xì)胞用PBS清洗3次，然后加入10 μmol/L PFP培養(yǎng)30 min。用PBS清洗3次后，加入100 μmol/L SIN-1繼續(xù)培養(yǎng)30 min，用PBS清洗3次后，在激光共聚焦熒光成像儀下成像。

內(nèi)源性：將MCF-7細(xì)胞置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)之前，在細(xì)胞中加入LPS（1 μg/mL）以及IFN-γ（50 ng/mL）培養(yǎng) 24 h。加入10 μmol/L PFP繼續(xù)培養(yǎng)30 min后， 細(xì)胞用PBS清洗3次，在激光共聚焦熒光成像儀下成像。

成像所用激發(fā)波長(zhǎng)為559 nm，收光窗口為600～660 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?探針的選擇性

考察了探針PFP對(duì)活性物質(zhì)的選擇性。當(dāng)探針濃度為10 μmol/L時(shí)，PFP在PBS緩沖液中溶解性良好，最大吸收波長(zhǎng)位于586 nm（ε=29500 L/（mol·cm））。如圖2所示，向探針溶液加入10倍摩爾比常見的細(xì)胞內(nèi)ROS時(shí)，包括O·2、·OH、ONOO、H2O2、ClO及TBHP，發(fā)現(xiàn)在ONOO存在下，探針在586 nm處的吸收幾乎完全消失; ClO可以引起探針吸收部分減弱，其它ROS則對(duì)探針的吸收光譜不產(chǎn)生影響。由于探針分子中存在氧鎓正離子，因此考察了親核性物質(zhì)（包括S2、SO23、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH））對(duì)探針結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，這些親核性物質(zhì)與探針分子不發(fā)生反應(yīng)。熒光發(fā)射光譜（圖2B）顯示，PFP在628 nm具有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射峰，Stokes位移為42 nm。傳統(tǒng)的長(zhǎng)波熒光染料（如花菁、甲基藍(lán)）通常具有較短Stokes位移（～20 nm），這導(dǎo)致其用于生物熒光成像實(shí)驗(yàn)時(shí)常出現(xiàn)竄光干擾。相比之下，PFP具有更大的Stokes位移，有利于熒光成像應(yīng)用。類似于吸收光譜中的現(xiàn)象，在ONOO作用下，PFP的熒光完全被猝滅（圖3A）; ?ClO引起探針熒光強(qiáng)度略微增強(qiáng)，而其它活性物質(zhì)對(duì)探針發(fā)射光譜的影響很小，可忽略不計(jì)。另外，向ONOO及其它物質(zhì)的混合溶液中加入探針分子，依然可觀察到明顯的熒光猝滅現(xiàn)象（圖3B），說明探針對(duì)ONOO的檢測(cè)能力基本不受其它物質(zhì)的影響。綜上，探針對(duì)ONOO具有良好的選擇性和抗干擾檢測(cè)能力。

3.2?探針對(duì)ONOO的識(shí)別性能研究

考察了探針的吸收光譜和發(fā)射光譜隨ONOO濃度的變化趨勢(shì)。如圖4所示，隨著ONOO濃度從0 μmol/L逐漸增加到200 μmol/L，探針在586 nm處的吸收峰逐漸消失，顏色從紫紅色逐漸變?yōu)闇\紫色。另一方面，探針在628 nm處的熒光強(qiáng)度也逐漸減弱，熒光量子產(chǎn)率從0.13降至0.03。

由圖5A中的熒光滴定曲線可見，在ONOO作用下，探針熒光的猝滅速率由快到慢; 當(dāng)ONOO濃度高于50 μmol/L時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度基本不再變化，此時(shí)猝滅效率達(dá)到98%，說明探針已與ONOO完全反應(yīng)。如圖5B所示，當(dāng)ONOO濃度在0.1～5.0 μmol/L之間時(shí)，探針在628 nm處的熒光強(qiáng)度與ONOO濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y=86.5-24.9x（R2=0.999），檢出限（3σ/k， 其中，σ為掃描探針溶液10次得到的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為探針熒光強(qiáng)度與底物濃度呈線性作用區(qū)間的斜率）為15.5 nmol/L， 與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)值相當(dāng)（表1），說明此探針對(duì)ONOO具有較高靈敏度。

3.3?探針對(duì)ONOO的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

將此探針用于活細(xì)胞內(nèi)ONOO的熒光成像研究。利用四唑鹽（3-（4，5）-Dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）比色法，對(duì)PFP的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將不同濃度探針與MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)探針濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率依然大于95%，表明此探針具有良好的生物相容性（圖7）。

考慮到細(xì)胞內(nèi)pH范圍在4～8之間，為了探究細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域pH值對(duì)探針熒光是否產(chǎn)生影響，在進(jìn)行細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)之前，測(cè)試了探針在pH=4和pH=8條件下的穩(wěn)定性。如圖7B所示，探針在pH值不同的兩種溶液中持續(xù)光照1 h后，其熒光強(qiáng)度基本不變，表明PFP適用于細(xì)胞內(nèi)成像。隨后，檢測(cè)了探針對(duì)細(xì)胞外源性O(shè)NOO的熒光成像能力。如圖8所示，將MCF-7細(xì)胞與10 μmol/L探針培養(yǎng)30 min后，可觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光，且熒光主要分布在細(xì)胞核外，說明PFP具有良好的細(xì)胞膜滲透性。SIN-1在水溶液中易緩慢分解，在O2存在下生成NO和O·2，進(jìn)而生成ONOO[40]。將細(xì)胞與探針預(yù)孵育30 min后，再與SIN-1培養(yǎng)30 min，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光明顯減弱，說明SIN-1促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)ONOO濃度升高，從而導(dǎo)致探針被消耗，熒光消失。

由于ONOO是一種細(xì)胞內(nèi)源性ROS，因此考察了探針對(duì)LPS和IFN-γ刺激下細(xì)胞內(nèi)ONOO濃度變化的成像能力。LPS和IFN-γ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)一氧化氮合成酶（NOS2），從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ONOO水平的升高[20]。如圖9所示，將細(xì)胞與LPS和IFN-γ孵育24 h后，再與探針培養(yǎng)30 min，紅色熒光幾乎消失，說明探針可以對(duì)細(xì)胞受刺激下產(chǎn)生的ONOO進(jìn)行靈敏的熒光成像。

4?結(jié) 論

合成了一種帶氧鎓正離子的熒光染料。此染料可發(fā)射628 nm強(qiáng)烈紅色熒光，與ONOO反應(yīng)后， 熒光被猝滅。此探針具有響應(yīng)快速、選擇性好、靈敏度高、水溶性好、Stokes位移較大、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)?？赡苡捎谔结樑cONOO反應(yīng)較為復(fù)雜，本研究未能成功鑒定氧化產(chǎn)物，反應(yīng)機(jī)制有待深入探究。與熒光增強(qiáng)型探針相比，此探針由于本身具有強(qiáng)熒光，可以直觀地觀察其細(xì)胞膜滲透性及細(xì)胞內(nèi)分布等。本研究將此探針成功應(yīng)用于活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO的熒光成像研究。此探針在細(xì)胞及活體層面上的相關(guān)病理生理過程中ONOO的熒光示蹤方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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