活性氧自由基在試驗(yàn)性乳腺炎大鼠發(fā)病機(jī)制中的作用

顧蓓蓓??+盧勁曄??+馬卉??+盧煒??+劉靜

摘要：為探討活性氧自由基在宿主抵抗乳腺感染中的作用，選取36只清潔級(jí)SD懷孕大鼠，于產(chǎn)后72 h經(jīng)乳頭管灌注10 μg/側(cè)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）至第4對(duì)乳腺（兩側(cè)）內(nèi)。分別于灌注前（定義為0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）頸靜脈放血處死動(dòng)物，采集樣品。結(jié)果顯示，LPS誘發(fā)乳腺炎引起白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)顯著升高，從而促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞（neutrophil，PMN）遷徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的釋放。乳腺組織N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）活力與ROS釋放變化結(jié)果一致，LPS灌注后各時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，并于灌注后8 h達(dá)到峰值。結(jié)果表明，PMN是宿主抵御乳腺感染的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)釋放ROS消滅病原菌，但大量釋放的ROS也是引起組織損傷的重要原因。

關(guān)鍵詞：活性氧；中性粒細(xì)胞；乳腺炎；大鼠

中圖分類(lèi)號(hào)： R979.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0294-03

乳腺炎是危害奶牛產(chǎn)業(yè)的一種重要疾病，誘發(fā)因素眾多，其中以病原菌感染最為嚴(yán)重。目前，臨床上分離的乳腺炎致病菌超過(guò)137種，根據(jù)病原來(lái)源和傳播方式可分為傳染性病原和環(huán)境性病原兩大類(lèi)。大腸桿菌是環(huán)境性病原的代表，也是臨床型乳腺炎中最常見(jiàn)的類(lèi)型。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是大腸桿菌細(xì)胞壁的組成成分，是大腸桿菌引起炎癥反應(yīng)的主要致病因子。研究表明，LPS誘發(fā)的試驗(yàn)性乳腺炎具有炎癥反應(yīng)一致、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，是研究大鼠乳腺炎發(fā)病機(jī)制的理想模型。

病原菌入侵宿主是復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的多因子作用過(guò)程，從病原與宿主互作的角度研究病原侵染后的致病機(jī)制，以及從分子水平了解宿主的免疫反應(yīng)是控制疾病的關(guān)鍵所在。已有研究證實(shí)，活化的PMN通過(guò)釋放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）殺滅病原微生物，ROS是分子氧在還原過(guò)程中的一系列代謝中間產(chǎn)物，主要包括 O-2[KG-2]· [KG-3]、H2O2、HOCl、·OH 等[1-2]。對(duì)胞內(nèi)感染菌的研究發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生對(duì)清除胞內(nèi)微生物是必需的，但持續(xù)過(guò)度激活產(chǎn)生過(guò)量氧化劑，超過(guò)局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí)會(huì)降解蛋白多糖，降低細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺上皮的黏附性，引起乳腺上皮細(xì)胞死亡、脫落及泌乳功能的損傷[3-4]。深入了解ROS在宿主抗乳腺感染過(guò)程中的作用具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

36只清潔級(jí)懷孕SD大鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于產(chǎn)后72 h誘發(fā)試驗(yàn)性乳腺炎，經(jīng)乳頭管注入10 μg/側(cè)LPS至大鼠第4對(duì)乳腺（兩側(cè)）內(nèi)。分別于灌注前（定義為0 h）及灌注后2、4、8、16、24 h（n=6）頸靜脈放血處死動(dòng)物，收集血清、肝素抗凝血、乳腺組織用于后續(xù)分析。

1.2主要試劑與儀器

LPS（O55：B5）、乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、雙氫羅丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）均購(gòu)自Sigma公司。TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、M-MLV、dNTPs均購(gòu)自Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自Toyobo公司。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）放免試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所。

FMJ-182型放射免疫γ計(jì)數(shù)器（中國(guó)科學(xué)院上海原子核研究所日環(huán)儀器廠(chǎng)），UV755B型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），BH2型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），組織勻漿器（瑞士Kinematica AG），核酸濃度測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf Biophotometer），7300型熒光定量PCR儀（ABI Prism），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences）。

1.3測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1組織勻漿及蛋白濃度的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g乳腺組織加入生理鹽水6 mL，冰浴勻漿后于10 000 g 4 ℃離心 30 min，上清液于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前采?Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2乳腺組織與血清中NAGase、MPO、IL-8的測(cè)定

乳腺組織與血清中NAGase、MPO、IL-8的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3定量PCR檢測(cè)乳腺組織細(xì)胞間黏附分子-1 mRNA表達(dá)

采用TRIzol試劑盒提取總RNA，用隨機(jī)引物同時(shí)對(duì)所有樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立各樣品的cDNA。采用所有待測(cè)RT產(chǎn)物的混合樣對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。ICAM-1、β-actin基因引物參考已發(fā)表的文獻(xiàn)，ICAM-1基因編號(hào)為NM_012967，上游：5′-GAACTGGACCTG GCAAGA G-3′；下游：T法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血PMN活性氧釋放

將100 μL 全血加入終濃度為100 ng/mL的PMA刺激PMN，同時(shí)設(shè)無(wú)PMA刺激對(duì)照（等量PBS代替PMA）；于37 ℃靜置15 min后加入DHR123工作液，終濃度為5 μmol/L，于37 ℃下孵育 10 min；裂解紅細(xì)胞，以0.01 mol/L、pH值7.2的PBS洗滌2次并重懸于PBS中，混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

檢測(cè)前采用陰性對(duì)照樣品優(yōu)化儀器條件。首先在FSC/SSC二維散點(diǎn)圖上調(diào)節(jié)FSC放大器增益、SSC電壓、FSC閾值使PMN細(xì)胞群在圖中清晰可見(jiàn)，確定PMN細(xì)胞的位置，設(shè)門(mén)于R1；FL1通道（波長(zhǎng)530 nm）檢測(cè)熒光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)光電倍增管增益使陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度在FL1直方圖上介于0～101；依次檢測(cè)無(wú)刺激對(duì)照和PMA刺激樣品，每個(gè)樣品獲取10 000個(gè)細(xì)胞。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0方差分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（x[TX-5]±s）表示。

2結(jié)果與分析

2.1灌注LPS后乳腺組織與血清中IL-8的活性變化

由圖1可見(jiàn)，與0 h相比，LPS灌注后8、16 h乳腺組織 IL-8 含量顯著升高（P<0.05），LPS灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清中IL-8含量均顯著升高（P<0.05）。

2.2灌注LPS后乳腺組織與血清中MPO的活性變化

由圖2可見(jiàn)，灌注LPS后，乳腺組織中MPO活性迅速上升，與0 h相比差異顯著（P<0.05），峰值出現(xiàn)于灌注后8 h（P<0.05）。血清中MPO活性的變化規(guī)律與組織中相反，與0 h相比MPO活性先下降后上升，最低點(diǎn)出現(xiàn)于LPS灌注后4 h（P<0.05），至24 h有所恢復(fù)。

2.3乳腺組織[WTBX][STBX]ICAM-1[WTBZ][STBZ] mRNA表達(dá)的變化

試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，在乳腺灌注LPS后的各時(shí)間點(diǎn)，乳腺組織中[WTBX][STBX]ICAM-1[WTBZ][STBZ] mRNA相對(duì)表達(dá)均顯著升高（P<0.05）；灌注后24 h表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但仍顯著高于0 h。

2.4外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

[JP3]試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，灌注LPS后的各時(shí)間點(diǎn)，外周血PMN活性氧釋放均顯著升高（P<0.05），峰值出現(xiàn)于灌注后8 h。

2.5灌注LPS后乳腺組織與血清中NAGase的活性變化

灌注LPS后的不同時(shí)間點(diǎn)，乳腺組織中NAGase活性均顯著升高（P<0.05），于灌注后8 h達(dá)到峰值。血清中NAGase活性的變化規(guī)律與組織中一致，灌注后8 h NAGase活性顯著升高（P<0.05），灌注后16 h已恢復(fù)至正常水平（圖5）。

3結(jié)論與討論

病原菌入侵宿主是復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的多因子作用過(guò)程，從病原與宿主互作的角度研究病原侵染后的致病機(jī)制，以及從分子水平了解宿主的免疫反應(yīng)是控制疾病的關(guān)鍵所在[8]。作為機(jī)體最大的外分泌腺，乳腺在進(jìn)化、發(fā)育、泌乳再構(gòu)建的過(guò)程中[CM（25]時(shí)刻面臨著病原微生物的侵襲。億萬(wàn)年來(lái)， 在與病原微生[CM）]

物的斗爭(zhēng)過(guò)程中，乳腺進(jìn)化出了復(fù)雜而精細(xì)的自主防御機(jī)制。目前對(duì)宿主抗乳房感染的研究尚不深入，這是無(wú)法有效控制乳腺炎的原因之一。

循環(huán)血液中大量的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙，這是發(fā)生乳腺炎的重要特征。已有研究表明，細(xì)菌入侵后通過(guò)激活NF-κB/AP-1刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子，從而促進(jìn)PMN等吞噬細(xì)胞的趨化[9-10]。IL-8是炎癥發(fā)生時(shí)一種重要的趨化因子，對(duì)PMN具有激活作用，可誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類(lèi)、整合素上調(diào)、呼吸爆發(fā)等[11-12]。LPS灌注后的各時(shí)間點(diǎn)，血清中IL-8均顯著升高，乳腺組織中IL-8在灌注后8、16 h顯著升高，提示細(xì)菌入侵后促進(jìn)機(jī)體分泌 IL-8，促進(jìn)PMN趨化進(jìn)入病灶發(fā)揮吞噬活性。此結(jié)果被MPO的活性變化規(guī)律證實(shí)。MPO是PMN的標(biāo)志酶，MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度[5]。灌注LPS后，乳腺組織中MPO活性升高，同樣于灌注后8 h達(dá)到峰值；血清中MPO活性的變化則與組織中相反，呈先降低后升高的趨勢(shì)，動(dòng)態(tài)反映了循環(huán)血液中PMN向乳腺組織遷徙的過(guò)程。

PMN是機(jī)體抵抗感染的主要非特異性防御細(xì)胞，任何PMN的功能障礙均會(huì)影響乳用家畜的生產(chǎn)性能。ICAM-1廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞表面，對(duì)細(xì)胞間的相互作用及PMN的黏附聚集具有重要作用[13]。已有研究表明，ICAM-1在感染性疾病中發(fā)揮著重要作用[14-15]，但其在乳腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用報(bào)道較少。本研究表明，在LPS誘發(fā)的大鼠試驗(yàn)性乳腺炎模型中，乳腺組織中ICAM-1 mRNA表達(dá)顯著升高，提示LPS刺激乳腺后通過(guò)上調(diào)ICAM-1表達(dá)，促進(jìn)PMN黏附至乳腺組織。PMN進(jìn)入宿主乳腺組織，主要通過(guò)釋放ROS實(shí)現(xiàn)吞噬病原微生物[5]。在對(duì)一些胞內(nèi)感染菌的研究中發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生對(duì)清除胞內(nèi)微生物是必需的。本研究結(jié)果顯示，LPS灌注乳腺后的各時(shí)間點(diǎn)，ROS均顯著升高，ROS是宿主抵御乳腺感染的主要效應(yīng)分子。然而，ROS的產(chǎn)生在殺滅病原微生物的同時(shí)，對(duì)宿主細(xì)胞和吞噬細(xì)胞本身也會(huì)造成損傷。ROS釋放的峰值伴隨著NAGase活性的顯著增加，NAGase是一種酸性水解酶，乳汁中的NAGase主要來(lái)源于乳腺上皮細(xì)胞與白細(xì)胞，NAGase活性的高低是細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)[7，16]。LPS灌注后4、8、16 h，NAGase活性急劇升高，并于8 h 達(dá)到峰值，于24 h恢復(fù)至正常水平。

在病原微生物或其他活性分子的作用下，大量循環(huán)血液中的PMN向乳腺組織遷徙，釋放活性氧消滅病原微生物，但高毒性的活性氧也會(huì)引起乳腺組織的損傷。如何迅速啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)PMN等效應(yīng)細(xì)胞第一時(shí)間遷徙至乳腺組織發(fā)揮吞噬效應(yīng)，以及大量被激活的PMN能否迅速?gòu)娜橄傧倥萸宄鶝Q定了乳腺炎癥的轉(zhuǎn)歸。本研究深入探討了宿主識(shí)別和清除乳房致病因子感染的天然免疫機(jī)制，對(duì)臨床上乳腺炎的免疫調(diào)控及防治具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]West A P，Shadel G S，Ghosh S. Mitochondria in innate immune responses[J]. Nature Reviews Immunology，2011，11（6）：389-402.

[2]Arnoult D，Carneiro L，Tattoli I，et al. The role of mitochondria in cellular defense against microbial infection[J]. Seminars in Immunology，2009，21（4）：223-232.

[3]Lauzon K，Zhao X，Bouetard A，et al. Antioxidants to prevent bovine neutrophil-induced mammary epithelial cell damage[J]. Journal of Dairy Science，2005，88（12）：4295-4303.

[4]Zhao X，Lacasse P. Mammary tissue damage during bovine mastitis：causes and control[J]. Journal of Animal Science，2008，86（Suppl 13）：57-65.

[5]Teixeira A S，Araújo F A，F(xiàn)erreira M A，et al. Angiogenesis and inflammation in skeletal muscle in response to ascites tumor in mice[J]. Life Sciences，2006，78（14）：1637-1645.

〖FQ（20。54，ZX，DY-W〗[KH4D]

[6]Lam T J G M，Old R R G M，Sampimo O C. Mastitis diagnostics and performance monitoring：a practical approach[J]. Irish Vet J，2009，62：34-39.

[7]Urech E，Puhan Z，Schllibaum M. Changes in milk protein fraction as affected by subclinical mastitis[J]. Journal of Dairy Science，1999，82（11）：2402-2411.

[8]Naeem A，Zhong K，Moisá S J，et al. Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected with Streptococcus uberis[J]. Journal of Dairy Science，2012，95（11）：6397-6408.

[9]Fu H，Gao R，Gao Y，et al. Curcumin attenuates inflammatory responses by suppressing TLR4-mediated NF-κB signaling pathway in lipopolysaccharide-induced mastitis in mice[J]. Int Immunopharmacol，2014，20：54-58.[ZK）]

[10]Li F，Liang D，Yang Z，et al. Astragalin suppresses inflammatory responses via down-regulation of NF-κB signaling pathway in lipopolysaccharide-induced mastitis in a murine model[J]. International Immunopharmacology，2013，17（2）：478-482.

[11]Fu Y，Zhou E，Liu Z，et al. Staphylococcus aureus and Escherichia coli elicit different innate immune responses from bovine mammary epithelial cells[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2013，155（4）：245-252.

[12]Liu S，Shi X，Bauer I，et al. Lingual antimicrobial peptide and IL-8 expression are oppositely regulated by the antagonistic effects of NF-κB p65 and C/EBPβ in mammary epithelial cells[J]. Molecular Immunology，2011，48（6/7）：895-908.

[13]Bowen Y M B，Bennett C F，Nation N，et al. Amelioration of chronic and spontaneous intestinal inflammation with an antisense oligonucleotide （Isis 9125） to intracellular adhesion molecule-1 in the HLA-B27/β2 microglobulin transgenic rat model[J]. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2002，302（3）：908-917.

[14]羅成，沈娜. 黃芪多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肝損傷MDA、caspase-3和ICAM-1的影響研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（11）：203-208.

[15]施穎琦，于成功. 姜黃素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC表達(dá) ICAM-1 的調(diào)節(jié)作用[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，34（11）：1476-1480.

[16]Lam T，Olde R R，Sampimon O，et al. Mastitis diagnostics and performance monitoring：a practical approach[J]. Irish Veterinary Journal，2009，62（Suppl 4）：S34-S39.