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    鎘脅迫對(duì)2個(gè)寧夏主栽水稻品種幼苗期抗氧化同工酶亞基及其活性的影響

    2016-10-20 01:48:18黃雪妮屈凡馬名立
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:同工酶細(xì)胞凋亡活性氧

    黃雪妮 屈凡 馬名立

    摘要:為探討2個(gè)寧夏主栽水稻品種萌發(fā)期、幼苗期對(duì)鎘(Cd)脅迫的形態(tài)、生理生化響應(yīng),明確Cd污染對(duì)水稻的傷害機(jī)理,并為早期檢測(cè)提供理論依據(jù),以富源4號(hào)、寧梗28號(hào)為研究對(duì)象,于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng),設(shè)置3個(gè)Cd處理濃度(0、50、100 μmol/L),研究不同處理對(duì)水稻發(fā)芽率、胚芽鞘長(zhǎng)度、胚根數(shù)、主根長(zhǎng)的影響以及根系中活性氧類(ROS)的累積和細(xì)胞凋亡情況;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)分析Cd對(duì)4種抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)]同工酶亞基的影響。結(jié)果顯示:(1)Cd毒害使根系產(chǎn)生大量活性氧類而誘導(dǎo)根尖伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞死亡,從而抑制了2個(gè)品種主根生長(zhǎng),但卻使根數(shù)增加;(2)100 μmol/L Cd抑制了富源4號(hào)SOD同工酶亞基,導(dǎo)致SOD總活性下降,CAT活卻顯著性增強(qiáng);(3)寧梗28比富源4號(hào)有較強(qiáng)的耐受Cd的能力。分析結(jié)果可知:胚根數(shù)的增加是寧夏水稻耐受Cd脅迫的重要措施;Cd脅迫下的SOD活性以及SOD同工酶亞基是可以用來(lái)鑒定水稻受重金屬脅迫的一個(gè)重要的生理傷害指標(biāo);CAT對(duì)Cd 脅迫下的水稻起重要的抗氧化保護(hù)作用。

    關(guān)鍵詞:Cd脅迫;水稻;同工酶;活性氧(ROS);細(xì)胞凋亡

    中圖分類號(hào): S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)07-0107-06

    水稻是寧夏平原引黃灌溉區(qū)的主要糧食作物之一,也是寧夏平原重要的經(jīng)濟(jì)作物,大面積種植的水稻品種有寧梗系列、富源4號(hào)等[1]。但是,隨著黃河沿岸經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展,含有重金屬污染物的工業(yè)廢水被排入黃河,導(dǎo)致黃河水質(zhì)不斷惡化,重金屬污染成為沿黃區(qū)水稻種植面臨的重要問(wèn)題,尤其是重金屬鎘(Cd)作為生物毒性極強(qiáng)的元素,不但在土壤中的化學(xué)活性大,而且移動(dòng)性強(qiáng)、毒性持久。水稻是一種極易富集Cd的農(nóng)作物,可以將Cd累積在籽粒部位,通過(guò)食物鏈的傳遞進(jìn)入人體。“鎘米”嚴(yán)重危及人體健康,能夠致病、致癌、致病變。因此,污染區(qū)稻米產(chǎn)品的安全性一直受到重視[2-3]。

    目前,關(guān)于水稻對(duì)Cd的吸收積累途徑、Cd在水稻中的分布規(guī)律,及Cd對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的毒害機(jī)理等方面已有大量的報(bào)道[4-7],Cd對(duì)水稻的生態(tài)生理效應(yīng)趨于成熟。而有研究表明,不同品種的水稻對(duì)Cd的耐受性及累積性有顯著差異[4],種子萌發(fā)期既是水稻生活周期的起點(diǎn),也是水稻感知外界環(huán)境的最初生命階段,水稻種子萌發(fā)時(shí)期的生長(zhǎng)狀況直接影響水稻后期的發(fā)育和產(chǎn)量。目前,關(guān)于Cd在水稻生活周期不同發(fā)育階段的效應(yīng),尤其是寧夏主栽水稻品種對(duì)重金屬Cd響應(yīng)方面的研究鮮有報(bào)道。筆者以寧夏主栽水稻品種寧梗28號(hào)、富源4號(hào)為研究對(duì)象,研究Cd脅迫對(duì)這2個(gè)品種的萌發(fā)率、胚芽鞘長(zhǎng)度、主根數(shù)、根系中活性氧類(ROS)累積、根系凋亡以及超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)同工酶的影響,旨在探討重金屬脅迫對(duì)寧夏主栽水稻抗氧化同工酶基因表達(dá)的影響以及水稻在重金屬脅迫下的抗性差異,為揭示Cd對(duì)寧夏主栽水稻品種毒害的生理機(jī)理及保障糧食安全和監(jiān)測(cè)重金屬污染提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以寧夏主栽水稻品種富源4號(hào)、寧梗28號(hào)為試驗(yàn)材料,種子購(gòu)于寧夏賀蘭縣種子公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 水稻的萌發(fā)與處理 挑選大小一致、顆粒飽滿的當(dāng)年產(chǎn)水稻種子,先用蒸餾水沖洗干凈,后用10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min,再用蒸餾水沖洗5次,于25 ℃蒸餾水中浸種4 h,讓種子充分吸脹。取直徑12 cm、鋪有2層消毒濾紙的培養(yǎng)皿,將種子鋪于其中,每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻擺放30粒種子。對(duì)照組(CK)即非脅迫處理,每天加入10 mL滅菌水;Cd處理1每天加入10 mL 50 μmol/L Cd,處理2每天加入10 mL 100 μmol/L Cd,每個(gè)處理重復(fù)3次。將對(duì)照與各處理放置于人工氣候箱中黑暗培養(yǎng),溫度28 ℃,濕度40%,注意通風(fēng)。

    1.2.2 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)量 發(fā)芽期間,每天定時(shí)記錄萌發(fā)數(shù)(以種子露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)),萌發(fā)2 d開(kāi)始測(cè)量胚芽鞘長(zhǎng)度(mm),每次隨機(jī)挑選15粒進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算平均值。發(fā)芽率(GR)即培養(yǎng)3 d時(shí)發(fā)芽種子數(shù)占種子總數(shù)的比例(%),萌發(fā)5 d后移栽至1/2 Hoagland培養(yǎng)液中,處理濃度不變。

    1.2.3 可溶性總蛋白的提取及同工酶電泳 待幼苗生長(zhǎng)至10 cm時(shí),各稱取0.5 g幼苗樣品,在冰浴條件下在樣品中加入 2 mL 酶提取液[0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液,pH值8.0(每100 mL含0.073 g半胱氨酸、0.105 g維生素C、20.075 g EDTA-Na、10 mL甘油、5.84 mL 1 mol/L HCl)],研磨至勻漿,于4 ℃、13 000 r/min離心20 min,上清液即為酶粗提取液,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量[8]。

    同工酶電泳采用北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)的垂直板凝膠電泳儀。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶電泳時(shí)采用10%分離膠、5%濃縮膠??箟难徇^(guò)氧化物酶采用7.5%分離膠、5%濃縮膠。上樣量45 μL,預(yù)電泳10 min,濃縮膠中穩(wěn)定電壓為80 V,進(jìn)入分離膠后穩(wěn)定電壓為120 V,電流200 mA。于冰浴中電泳3~4 h后,當(dāng)指示染料下行至距膠板末端1~2 cm 時(shí)停止電泳[9]。

    1.2.3.1 同工酶染色及拍照 SOD同工酶的染色采用氮藍(lán)四唑同工酶法[10],POD同工酶染色采用乙酸-聯(lián)苯胺法[10],CAT同工酶染色采用淀粉法[11],APX同工酶染色參照邵巍等的方法[12],根據(jù)染色的酶譜計(jì)算相對(duì)遷移率Rf:

    Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離。

    1.2.3.2 酶活性的測(cè)定 SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[13],POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[14],CAT、APX活性的測(cè)定采用吳倩的方法[15]。每個(gè)處理重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)用GraphPadprism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

    1.2.4 根系中ROS的累積及根系凋亡檢測(cè) 為了檢測(cè)Cd脅迫下水稻根系中ROS的累積隨時(shí)間的變化情況,以富源4號(hào)的根系為材料?;钚匝醯臋z測(cè):ROS Assay Kit,購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成母液后保存于-20 ℃,工作液按1 ∶ 1 000的比例稀釋。以用100 μmol Cd處理0、24、48、72 h的主根根尖為材料,經(jīng)大量純凈水沖洗干凈后,浸泡于ROS染色液中,于37 ℃溫育20 min;用滅菌去離子水沖洗干凈,裝載于載玻片上,在熒光顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm的條件下觀察活性氧的累積情況,每個(gè)處理重復(fù)8次。

    Cd脅迫下根系細(xì)胞凋亡情況用碘化丙錠(PI)檢測(cè):碘化丙啶購(gòu)自Sigma公司,是一種細(xì)胞核染料,能特異穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜而不能穿過(guò)活性細(xì)胞的細(xì)胞膜,從而達(dá)到鑒別活細(xì)胞的作用。先將PI粉末溶于滅菌水中,配制成濃度為 10 μg/mL 的母液,然后將母液用0.9% NaCl按1 ∶ 100的比例稀釋成工作液。根系處理方法同ROS染色處理,步驟、時(shí)間一樣,選取均勻一致的主根,浸泡在工作液中染色大約 3 min,然后用0.9% NaCl溶液沖洗干凈、壓片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照,整個(gè)過(guò)程要求在暗條件下操作,以防熒光猝滅。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 結(jié)果與分析

    2.1.1 水稻種子的萌發(fā)率和胚芽鞘長(zhǎng)度 表1結(jié)果顯示:與CK相比,隨著Cd脅迫濃度的增加,2個(gè)品種水稻在處理3 d的發(fā)芽率沒(méi)有被明顯抑制,甚至Cd處理能在一定程度上促進(jìn)種子的萌發(fā),寧28的萌發(fā)率比富源4號(hào)高。培養(yǎng)7 d的主根長(zhǎng)、胚根數(shù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),2個(gè)梯度的Cd處理能增加2個(gè)品種的胚根數(shù),50 μmol/L Cd能極顯著增加寧梗28根數(shù)(P<0.01),富源4號(hào)的根數(shù)也極顯著增加(P 圖1結(jié)果顯示,在非脅迫處理下,寧梗28的胚芽鞘長(zhǎng)度比富源4號(hào)長(zhǎng),50 μmol/L Cd在一定程度上能促進(jìn)種子萌發(fā)、胚芽鞘生長(zhǎng),但是100 μmol/L Cd卻能夠抑制胚芽鞘生長(zhǎng)。寧梗28的胚芽鞘長(zhǎng)度比富源4號(hào)長(zhǎng),而胚芽鞘長(zhǎng)度可以作為抗逆性的形態(tài)指標(biāo)之一[16],可見(jiàn)與富源4號(hào)相比,寧梗28對(duì)Cd脅迫有較強(qiáng)的抗逆性。

    2.1.2 根系中ROS的累積及細(xì)胞凋亡檢測(cè) 圖2結(jié)果顯示,與對(duì)照(CK)相比,100 μmol/L Cd脅迫24 h之后,根尖出現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光,說(shuō)明水稻根系中累積了較多ROS;48 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),根尖中的ROS仍然沒(méi)有及時(shí)被清除;而72 h之后熒光明顯減弱。同樣,PⅠ染色檢測(cè)根尖細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,隨著Cd暴露時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),在72 h時(shí)熒光強(qiáng)度最大。檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞凋亡部位主要發(fā)生在根尖分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)部位,這可能是導(dǎo)致主根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)被抑制的主要原因。

    2.1.3 水稻同工酶電泳及酶活性測(cè)定結(jié)果

    2.1.3.1 Cd對(duì)2個(gè)品種SOD同工酶及酶活的影響 圖3-a 富源4號(hào)同工酶電泳結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,50 μmol/L Cd使SOD亞基出現(xiàn)了8條帶,Rf值分別為0.12、0.23、0.32、0.45、0.57、0.71、0.78、0.84,并且S3、S4、S5亞基的亮度明顯增強(qiáng)。圖3-b酶活測(cè)定結(jié)果顯示,低濃度Cd能夠使SOD活性極顯著上升(P

    2.1.3.2 不同處理對(duì)POD的影響 由圖4-a可知,富源4號(hào)POD同工酶電泳結(jié)果出現(xiàn)7條Rf值分別為0.07、0.21、0.39、0.58、0.61、0.85、0.91的酶帶,隨著Cd2+濃度的增加,富源4號(hào)POD亞基條帶數(shù)沒(méi)有變化,P4亞基的亮度稍有增加。同步酶活測(cè)定結(jié)果顯示,Cd濃度的增加并沒(méi)有顯著性引起POD活性的變化(圖4-b)。圖4-c寧28的POD同工酶電泳結(jié)果也顯示有7條酶帶,P4亞基隨著Cd2+濃度的增大而逐漸加深;POD活性沒(méi)有顯著性的變化(圖4-d)。

    這一結(jié)果表明,在Cd脅迫早期,POD并沒(méi)有起到明顯的抗氧化保護(hù)作用,有研究認(rèn)為,POD很有可能是植物受到傷害的一個(gè)重要的生理傷害指標(biāo),是植物體內(nèi)H2O2過(guò)度累積的一個(gè)重要標(biāo)志。因此推測(cè),可能水稻體內(nèi)的H2O2暫時(shí)沒(méi)有過(guò)度累積,因此POD活性沒(méi)有顯著上升。

    2.1.3.3 Cd處理對(duì)水稻CAT的影響 不同濃度的Cd脅迫處理后,富源4號(hào)CAT同工酶圖譜顯示3條酶譜帶,Rf值分別為0.12、0.18、0.29,C1、C3的亮度逐漸加大、條帶加寬(圖5-a);由圖5-c可知,寧梗28同工酶電泳結(jié)果也顯示3條帶,C2、C3亞基的亮度隨著Cd濃度的增大而增強(qiáng)。酶活測(cè)定結(jié)果顯示,100 μmol/L Cd脅迫都能使CAT活性極顯著上升(P<0.01)(圖5-b、圖5-d)。這一結(jié)果表明,CAT在Cd脅迫下并沒(méi)有被抑制,可能在抗氧化保護(hù)系統(tǒng)中起到比較重要的作用。

    2.1.3.4 不同Cd濃度對(duì)水稻APX的影響 由圖6-a、圖6-b可見(jiàn),富源4號(hào)的APX活性無(wú)明顯變化,100 μmol/L Cd使A7亞基亮度降低。由圖6-c、圖6-d可見(jiàn),寧梗28的APX在100 μmol/L Cd脅迫下條帶亮度稍有增強(qiáng), 但是在酶

    活性上沒(méi)有明顯差異。這些結(jié)果說(shuō)明,在脅迫早期,APX對(duì)Cd的響應(yīng)不明顯。

    3 討論

    關(guān)于Cd對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)方面的影響已經(jīng)有大量報(bào)道,楊穎麗等研究發(fā)現(xiàn),低濃度Cd對(duì)種子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用[17],本研究結(jié)果與之相似,這可能是由于萌發(fā)初期Cd對(duì)淀粉酶活力略有提高作用,從而促進(jìn)了細(xì)胞分裂[18]。而高濃度Cd對(duì)主根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的顯著抑制作用可能與Cd進(jìn)入細(xì)胞之后導(dǎo)致細(xì)胞分裂出現(xiàn)障礙或不正常分裂[19-20]、根系中ROS的過(guò)量累積而導(dǎo)致根尖細(xì)胞死亡有重要關(guān)系,說(shuō)明Cd脅迫對(duì)水稻根系發(fā)育及胚芽生長(zhǎng)有明顯抑制作用,而寧梗

    28、富源4號(hào)對(duì)Cd脅迫的一個(gè)重要形態(tài)響應(yīng)就是增加胚根數(shù)。

    抗氧化同工酶是植物體內(nèi)最活躍的酶系之一,逆境脅迫可以調(diào)節(jié)同工酶基因在不同水平上表達(dá),不良的環(huán)境因素常常引起基因的變異而導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變,這種改變反映在同工酶的酶譜上出現(xiàn)了不同數(shù)量、不同遷移率的譜帶,因此同工酶的表達(dá)是遺傳因子與環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。通過(guò)對(duì)抗氧化同工酶的分析,可以初步了解寧夏水稻品種對(duì)不良環(huán)境的響應(yīng)。當(dāng)Cd被吸收進(jìn)入水稻體內(nèi)之后,刺激產(chǎn)生有害的過(guò)氧化物,當(dāng)脅迫發(fā)生后,水稻體內(nèi)的過(guò)氧化物酶系統(tǒng)會(huì)被激活起到保護(hù)作用;但當(dāng)脅迫發(fā)生超過(guò)水稻忍受極限時(shí),其防御措施也就相應(yīng)減弱,乃至死亡。SOD第1個(gè)參與 O-2 · 的清除反應(yīng),生成H2O2、O2,在抗氧化酶類中處于重要地位。SOD活性的高低可以在一定程度上反映植物抗逆本領(lǐng)的強(qiáng)弱[21-22],Liu等研究表明,日本忍冬具有較強(qiáng)的富集重金屬Cd的能力,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在重金屬脅迫下忍冬體內(nèi)具有較高的SOD活性[23]。而本試驗(yàn)結(jié)果表明,2個(gè)寧夏水稻在遭受Cd脅迫后,SOD同工酶基因在譜帶數(shù)、表達(dá)量上都發(fā)生了明顯的變化,SOD同工酶S3、S4亞基基因的被抑制效應(yīng),導(dǎo)致SOD活性在高濃度Cd脅迫下極顯著地被抑制,因此推測(cè)SOD在Cd脅迫下不能起關(guān)鍵的抗氧化保護(hù)作用,活性氧代謝系統(tǒng)失調(diào)的主要產(chǎn)物可能為H2O2,而非 O-2 · 。

    CAT在重金屬抗性方面起到重要作用,能夠高效地分解H2O2為H2O、O2而不需要消耗任何物質(zhì),因此能積極地響應(yīng)體內(nèi)H2O2累積,從而避免H2O2從過(guò)氧化物酶體擴(kuò)散至細(xì)胞而造成氧化毒害。在煙草中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CAT基因編碼的3種蛋白質(zhì)用來(lái)清除體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2[24]。筆者研究發(fā)現(xiàn),在SOD被抑制的情況下,CAT活性卻在顯著上升,CAT同工酶隨著Cd濃度的升高,出現(xiàn)新的酶條帶亞基,可能在后期將 O-2 · 、H2O2清除,從而最大限度地減少HO-的形成。

    由于ROS的累積與POD的活性呈顯著線性關(guān)系,MacFarlane等將POD活性的上升認(rèn)為是遭受重金屬脅迫的一個(gè)重要的指標(biāo)[25]。本研究表明,在Cd脅迫早期,無(wú)論是同工酶電泳還是酶活檢測(cè),結(jié)果都顯示POD沒(méi)有明顯改變,因此推測(cè)水稻幼苗中的H2O2物質(zhì)未累積的較多,導(dǎo)致酶活基本未變。在本試驗(yàn)中,早期POD沒(méi)有明顯變化,可能與脅迫程度和CAT對(duì)ROS的積極清除有關(guān)。

    4 結(jié)論

    (1)Cd對(duì)水稻根系毒害主要表現(xiàn)在根系中ROS的累積、根尖伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的凋亡以及根系生長(zhǎng)被抑制,而寧夏水稻根系適應(yīng)Cd脅迫的一個(gè)重要措施就是增加胚根數(shù)。(2)SOD亞基S3、S4的被抑制效應(yīng),是導(dǎo)致SOD活性下降的主要原因,因此Cd脅迫下SOD活性以及SOD同工酶是可以用來(lái)鑒定水稻受重金屬脅迫的一個(gè)重要的生理傷害指標(biāo)。(3)CAT在寧夏水稻清除Cd誘導(dǎo)的過(guò)氧化損傷中起到重要的作用。

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