小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期腦線(xiàn)粒體的保護(hù)作用研究

杜肖+路暢+賀曉麗+杜冠華

[摘要] 觀察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期腦線(xiàn)粒體的作用，研究其對(duì)腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。采取插線(xiàn)法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血模型，2 h后再灌注。應(yīng)用Zea-Longa′s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)價(jià)動(dòng)物腦缺血程度，將模型成功大鼠隨機(jī)分為模型組、小續(xù)命湯有效成分低、中、高劑量組和陽(yáng)性藥金納多組，以假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組。于給藥5 d后梯度離心提取大鼠腦組織缺血周邊區(qū)線(xiàn)粒體，通過(guò)Clark氧電極法檢測(cè)線(xiàn)粒體呼吸功能，熒光探針?lè)z測(cè)線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量及線(xiàn)粒體膜電位，分光光度法檢測(cè)線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶活性和腦組織ATP含量。結(jié)果顯示，小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著改善腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期腦線(xiàn)粒體的呼吸功能，提高線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶的活性，降低線(xiàn)粒體ROS的含量，提高腦線(xiàn)粒體膜電位，促進(jìn)腦組織ATP的合成。提示小續(xù)命湯有效成分組能夠明顯減輕腦缺血再灌注早期導(dǎo)致的腦組織能量代謝紊亂，改善腦線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，說(shuō)明小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦線(xiàn)粒體的保護(hù)作用可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 小續(xù)命湯有效成分組；腦缺血/再灌注；線(xiàn)粒體功能；氧化磷酸化；活性氧；膜電位

[Abstract] To observe the effect of active components group of Xiaoxuming decoction （XXMD） on brain mitochondria in cerebral ischemia/reperfusion rats during early recovery period，and study its protective mechanism for nerves in cerebral ischemia/reperfusion rats during early recovery period. Cerebral ischemia model of middle cerebral artery occlusion in rats was established by suture method，and reperfusion was conducted 2 h later. The degree of cerebral ischemia in rats was evaluated by using Zea-Longa′s standard grading method，and the model rats were randomly divided into model group，Xiaoxuming decoction active components low，medium and high dose groups and positive drug Ginaton group，with sham operated rats as control group. Gradient centrifugation was used to extract the mitochondria from rat brain after 5 days of drug administration. Then the mitochondrial respiratory function was measured by Clark oxygen electrode method；mitochondrial membrane potential and the mitochondrial reactive oxygen species（ROS） level were detected by fluorescence probe methods；and the activity of mitochondrial succinodehydrogenase （SDH） and the content of ATP in the ischemic region of MCAO rats were measured by spectrophotometric method. The results showed that as compared with the model group，XXMD could significantly improve mitochondrial respiratory activity，increase the activity of SDH，reduce the level of ROS，increase mitochondrial membrane potential and obviously promote the synthesis of ATP in brain tissues. The results indicated that XXMD active components group could alleviate the energy metabolism disorders，protect brain mitochondrial damage and improve mitochondrial function in MCAO rats，which may be the mechanism of its neuroprotection activity.

[Key words] active components group of Xiaoxuming decoction；cerebral ischemic/reperfusion；mitochondrial function；oxidative phosphorylation；reactive oxygen species；membrane potential

腦卒中是引起我國(guó)居民死亡的首要因素，包括缺血性腦卒中（腦梗死）和出血性腦卒中2種，其中缺血性腦卒中所占比例約為60%～80%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷與線(xiàn)粒體功能障礙密切相關(guān)，腦缺血后多種病理因素共同作用致使線(xiàn)粒體發(fā)生損傷[3-4]，而損壞的線(xiàn)粒體又會(huì)成為加劇缺血再灌注損傷的繼發(fā)性關(guān)鍵因素[5-6]。因此尋找干預(yù)手段，改善腦缺血再灌注后腦線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙，對(duì)于缺血性卒中的防治具有重要意義。

小續(xù)命湯有效成分組是根據(jù)中藥復(fù)方小續(xù)命湯適應(yīng)癥腦缺血的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)相關(guān)體外篩選模型優(yōu)化確定的小續(xù)命湯抗腦缺血的有效藥理活性組分[7]。近年來(lái)，隨著對(duì)小續(xù)命湯有效成分組化學(xué)成分研究工作的開(kāi)展，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)日益明確。運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)小續(xù)命湯有效成分組進(jìn)行分析，鑒定出了包括黃芩苷、芍藥苷、甘草素、升麻苷、黃芩素、白楊素等15種主要成分[8]，其中黃酮類(lèi)和色原酮類(lèi)化合物分別為其主要入血和入腦成分[9]。前期研究結(jié)果顯示，小續(xù)命湯有效成分組對(duì)慢性腦缺血（2VO）大鼠和急性腦缺血再灌注（MCAO）大鼠均具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]，抑制慢性腦缺血導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[11]，顯著改善急性腦缺血大鼠的神經(jīng)癥狀障礙[12]，但其是否通過(guò)保護(hù)腦線(xiàn)粒體途徑對(duì)MCAO大鼠起保護(hù)作用目前尚不明確。因此本研究將從改善腦線(xiàn)粒體功能的角度探討小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠的保護(hù)作用，進(jìn)一步深入了解小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠，雄性，體重230～250 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥物及試劑 小續(xù)命湯有效成分組（XXMD）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所篩選中心提供；金納多（銀杏葉提取物片EGb 761）由德國(guó)威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)（批號(hào)9420516）；羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na）購(gòu)于廣東汕頭市西隴化工廠；考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購(gòu)于普利萊基因技術(shù)有限公司；ATP測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；琥珀酸脫氫酶（SDH）測(cè)試盒和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 儀器 Sorvall ST-16R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）；Spectra Max M5酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；AL104電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Delta320 pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Infinite M1000Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組 大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，禁食給水12 h，采用插線(xiàn)法制備大鼠MCAO模型，假手術(shù)組大鼠術(shù)中不插入線(xiàn)栓。依據(jù)Zea-Longa′s級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法[13]對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，取評(píng)分介于1～3分視為造模成功，評(píng)分過(guò)高及評(píng)分為0的動(dòng)物棄之不用。給藥劑量和給藥時(shí)間參照前期研究的結(jié)果[12]，將造模成功大鼠按照體重隨機(jī)分為：模型組、小續(xù)命湯有效成分組低、中、高劑量組（XXMD-L，75 mg·kg^-1；XXMD-M，150 mg·kg^-1；XXMD-H，300 mg·kg^-1）以及陽(yáng)性藥金納多組（EGb 761，150 mg·kg^-1），以假手術(shù)組大鼠作為對(duì)照組。術(shù)后24 h時(shí)首次給藥，后每日1 次灌胃給藥，連續(xù)給藥5 d。小續(xù)命湯有效成分組和金納多均采用0.5%羧甲基纖維素鈉配制。假手術(shù)組與模型組大鼠灌胃給予等體積溶劑為對(duì)照。

2.2 腦線(xiàn)粒體的提取 腦線(xiàn)粒體的提取方法參照前期研究[14]。給藥5 d時(shí)，采用梯度離心法提取大鼠缺血周邊區(qū)腦組織線(xiàn)粒體。大鼠斷頭取腦，冰上分離缺血周邊腦組織，剪碎后移入玻璃勻漿器中，按照10 mL·g^-1腦組織加入預(yù)冷線(xiàn)粒體分離緩沖液（250 mmol·L^-1glucose，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，1 mmol·L^-1EDTA，0.2%BSA），手動(dòng)輕柔勻漿10次。勻漿液以700×g離心10 min，取上清以1萬(wàn)×g離心10 min，所得沉淀即為線(xiàn)粒體。將線(xiàn)粒體用分離緩沖液重懸洗滌1次，1萬(wàn)×g離心10 min，得到較純凈的線(xiàn)粒體。應(yīng)用分離緩沖液重懸制備線(xiàn)粒體懸液，Bradford法測(cè)定線(xiàn)粒體蛋白濃度。

2.3 腦線(xiàn)粒體呼吸功能的測(cè)定 取新鮮制備的線(xiàn)粒體懸液，采用Clark氧電極法檢測(cè)大鼠腦線(xiàn)粒體的呼吸功能[15]。將線(xiàn)粒體呼吸介質(zhì)（225 mmol·L^-1glucose，5 mmol·L^-1KH₂PO₄，10 mmol·L^-1Tris，10 mmol·L^-1KCl，0.2 mmol·L^-1EDTA，100 mg·L^-1BSA）加入1 mL反應(yīng)池中孵育2 min，以空氣飽和，加入新鮮線(xiàn)粒體蛋白1 mg，1～2 min后，測(cè)定NADH呼吸鏈或FADH₂呼吸鏈活性，依次加入10 μL外源反應(yīng)底物（10 mmol·L^-1谷氨酸鈉和5 mmol·L^-1蘋(píng)果酸1∶1的混合物或10 mmol·L^-1琥珀酸鈉）和5 μL 250 mmol·L^-1ADP。根據(jù)氧耗曲線(xiàn)計(jì)算線(xiàn)粒體各項(xiàng)氧化磷酸化參數(shù)：磷氧比值（P/O），3態(tài)呼吸速率（V3），4態(tài)呼吸速率（V4），呼吸控制指數(shù)（RCR）及氧化磷酸化效率（OPR）。

2.4 腦線(xiàn)粒體活性氧（ROS）含量的測(cè)定 采用熒光探針2，7-二氯乙酰熒光素（DCFH-DA）檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織線(xiàn)粒體內(nèi)的ROS含量。ROS能夠?qū)CFH氧化成二氯熒光素（DCF），且DCF的生成速率與ROS含量呈正相關(guān)[16]。將線(xiàn)粒體懸液與10 μmol·L^-1的DCFH-DA混勻于37 ℃條件下孵育60 min，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 腦線(xiàn)粒體膜電位的測(cè)定 采用線(xiàn)粒體選擇特異性熒光探針Rhodamine 123檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位[17]。在膜電位反應(yīng)緩沖液（150 mmol·L^-1glucose，5 mmol·L^-1MgCl₂，5 mmol·L^-1succinate，2.7 mmol·L^-1rotenone，5 mmol·L^-1KH₂PO₄，20 mmol·L^-1hepes，pH 7.4）中加入終濃度為1 μmol·L^-1的Rhodamine 123，在37 ℃，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，530 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下測(cè)定基礎(chǔ)熒光值。加入50 μL（0.2 mg）線(xiàn)粒體蛋白混勻后，測(cè)定10 min內(nèi)Rhodamine 123被線(xiàn)粒體俘獲后的熒光值，根據(jù)Nernst方程計(jì)算線(xiàn)粒體膜電位。

2.6 腦線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶活性的測(cè)定 琥珀酸脫氫酶屬于細(xì)胞色素氧化酶，是反映線(xiàn)粒體功能的標(biāo)志酶之一，其活性能夠反映線(xiàn)粒體三羧酸循環(huán)的程度。于-80 ℃取出凍存的腦線(xiàn)粒體懸液，置于冰水浴中融化。采用超聲法破碎線(xiàn)粒體。應(yīng)用分光光度法檢測(cè)缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦線(xiàn)粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 腦組織ATP含量的測(cè)定 按文獻(xiàn)方法[18]，借助大鼠模具，取缺血側(cè)大腦在距額葉前端3～9 mm處進(jìn)行冠狀切片，中間腦組織在距離矢狀縫2 mm處做矢狀切片并棄去，剩余腦組織即為缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)。稱(chēng)取腦組織，按質(zhì)量-體積=1∶9（g·L^-1）比例加入相應(yīng)預(yù)冷生理鹽水，冰浴研磨制備10%腦勻漿，3 000 r·min^-1離心10 min，取上清液于沸水浴中煮沸10 min，混勻抽提1 min，3 500 r·min^-1離心10 min，取上清液用磷鉬酸比色法測(cè)定ATP含量。具體操作按照ATP含量測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。組間均值比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間數(shù)據(jù)的多重比較采用LSD法，并結(jié)合Dunnett′s T檢驗(yàn)，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦線(xiàn)粒體呼吸功能的影響 線(xiàn)粒體呼吸功能反映線(xiàn)粒體氧化速率和線(xiàn)粒體氧化磷酸化效率，線(xiàn)粒體P/O越接近理論值，表明其氧化磷酸化效率越高，生成ATP的能力也越強(qiáng)；RCR比值越大，表明線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)越完整。與假手術(shù)組相比，在NADH呼吸鏈啟動(dòng)的條件下，模型組大鼠腦線(xiàn)粒體P/O，V3，RCR和OPR均顯著降低（P<0.05，P<0.01），說(shuō)明腦缺血再灌注后大鼠腦線(xiàn)粒體呼吸效率下降，氧化磷酸化功能降低；與模型組相比，XXMD組和陽(yáng)性藥EGb 761組可明顯改善線(xiàn)粒體呼吸功能各項(xiàng)指標(biāo)，顯著提高P/O，RCR和OPR值 （P<0.05，P<0.01），見(jiàn)圖1。

在FADH₂呼吸鏈啟動(dòng)的條件下，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦線(xiàn)粒體的P/O，V3，RCR和OPR均顯著降低（P<0.05，P<0.01），說(shuō)明腦缺血再灌注后大鼠腦線(xiàn)粒體呼吸效率下降，氧化磷酸化功能

降低；與模型組相比，XXMD組和陽(yáng)性藥EGb 761組大鼠腦線(xiàn)粒體P/O和OPR均顯著提高（P<0.05，P<0.01），從而改善線(xiàn)粒體的氧化磷酸化功能，見(jiàn)圖2。以上結(jié)果說(shuō)明線(xiàn)粒體的功能損傷不僅涉及復(fù)合酶體I，而且涉及整個(gè)呼吸鏈，見(jiàn)圖2。

3.2 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦組織線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量的影響 DCF的熒光強(qiáng)度與ROS的水平呈正相關(guān)，可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)腦組織線(xiàn)粒體內(nèi)DCF熒光值明顯增加，證實(shí)線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，XXMD組和陽(yáng)性藥EGb 761組相應(yīng)腦組織線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)圖3。

3.3 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦線(xiàn)粒體膜電位的影響 線(xiàn)粒體膜電位是反映線(xiàn)粒體功能的重要指標(biāo)，膜電位改變影響質(zhì)子泵功能，進(jìn)而影響ATP的生成。Rhodamine 123的線(xiàn)粒體俘獲率與膜電位呈正比。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織線(xiàn)粒體膜電位顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，XXMD低、中劑量組和陽(yáng)性藥EGb 761組均能明顯提高大鼠腦組織線(xiàn)粒體膜電位（P<0.05），見(jiàn)圖4。

3.4 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶活力的影響 SDH是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，在氧化磷酸化和電子傳遞過(guò)程中起著樞紐作用，其活性能夠反映線(xiàn)粒體功能完整性。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織線(xiàn)粒體中SDH活力發(fā)生了一定程度的降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義；與模型組相比，XXMD中劑量組和陽(yáng)性藥EGb 761組相應(yīng)腦線(xiàn)粒體中SDH活力顯著提高（P<0.05），見(jiàn)圖5。

與假手術(shù)組相比1）P<0.05，2）P<0.01；與模型組相比3）P<0.05，4）P<0.01（圖4～6同）。

3.5 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)MCAO大鼠腦組織ATP含量的影響 ATP含量可以直觀反映細(xì)胞能量代謝水平和能量系統(tǒng)功能恢復(fù)情況。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血核心區(qū)和半暗帶區(qū)腦組織ATP含量顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，XXMD中、高劑量組和陽(yáng)性藥EGb 761組相應(yīng)腦組織中ATP含量明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖6。

4 討論

腦組織僅能通過(guò)葡萄糖供能的能量供應(yīng)特點(diǎn)，使其成為了最易產(chǎn)生能量耗竭進(jìn)而發(fā)生缺血/再灌注損傷的器官[6，19-20]。腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血、缺氧可以造成線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的破壞，并通過(guò)影響線(xiàn)粒體代謝關(guān)鍵酶，包括氧化磷酸化相關(guān)酶：NADH脫氫酶和COX；三羧酸循環(huán)相關(guān)酶：丙酮酸脫氫酶β和二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；讣爸舅岷桶被岽x相關(guān)酶的表達(dá)影響線(xiàn)粒體的能量供應(yīng)，造成ATP合成下降[14，21]。腦缺血和腦缺血/再灌注還可以降低線(xiàn)粒體的呼吸功能，使線(xiàn)粒體P/O減低，3態(tài)呼吸下降，無(wú)效4態(tài)呼吸增加并減弱線(xiàn)粒體OPR，降低氧利用速度[22-23]。本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注5 d時(shí)，線(xiàn)粒體氧化磷酸功能仍嚴(yán)重受損，表現(xiàn)為MCAO大鼠腦線(xiàn)粒體的P/O，V3，RCR和OPR顯著降低，ATP合成明顯減少，而XXMD和EGb 761可以通過(guò)提高M(jìn)CAO大鼠腦線(xiàn)粒體P/O，RCR，OPR和SDH的活力改善MCAO大鼠恢復(fù)早期腦線(xiàn)粒體的氧化磷酸化效率，提高線(xiàn)粒體呼吸酶的活性，增加ATP的合成，從而緩解缺血腦組織能量耗竭，減輕能量耗竭對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，起到腦缺血保護(hù)作用。

腦再灌注時(shí)期，由恢復(fù)供氧引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)再灌注損傷的核心環(huán)節(jié)，而線(xiàn)粒體則是其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[24]。氧化應(yīng)激對(duì)線(xiàn)粒體的損傷是腦缺血再灌注損傷病理進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)，腦缺血/再灌注在極短時(shí)間內(nèi)即可損傷線(xiàn)粒體，并對(duì)線(xiàn)粒體存在長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)性氧化應(yīng)激損傷，最終造成線(xiàn)粒體的永久性破壞[25-26]。氧化應(yīng)激由ROS所介導(dǎo)，伴隨有氧化-抗氧化物質(zhì)失衡，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用。腦缺血/再灌注后ROS大量生成，ROS損傷線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)和 mtDNA 等生物大分子，并通過(guò)直接和間接途徑調(diào)控MPTP開(kāi)放，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性增加，引起線(xiàn)粒體膜電位下降，釋放凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)線(xiàn)粒體凋亡通路[25]。而腦缺血/再灌注后，過(guò)高的氧化應(yīng)激水平和鈣超載可以引起MPTP持續(xù)性開(kāi)放，導(dǎo)致大量水分子進(jìn)入線(xiàn)粒體，引起線(xiàn)粒體腫脹并造成線(xiàn)粒體崩解，并進(jìn)一步觸發(fā)線(xiàn)粒體凋亡，最終引起細(xì)胞死亡[27]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，XXMD治療給藥可以顯著改善MCAO大鼠的神經(jīng)癥狀障礙，降低給藥5 d時(shí)MCAO大鼠腦梗死體積百分比，其腦保護(hù)作用機(jī)制與改善MCAO大鼠氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)缺血腦組織氧化-抗氧化平衡有關(guān)[12]。本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注5 d時(shí)MCAO大鼠缺血腦組織線(xiàn)粒體內(nèi)ROS含量仍顯著高于假手術(shù)組、膜電位也存在顯著下降，而XXMD和EGb 761則可顯著降低MCAO大鼠腦線(xiàn)粒體ROS含量，提高線(xiàn)粒體的膜電位，從線(xiàn)粒體角度確證了XXMD對(duì)MCAO大鼠氧化應(yīng)激水平的改善作用，并對(duì)其機(jī)制做出了進(jìn)一步的補(bǔ)充。

綜上所述，本研究證實(shí)了XXMD可以減輕MCAO大鼠恢復(fù)早期的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能異常，表現(xiàn)為改善線(xiàn)粒體氧化磷酸化水平，提高線(xiàn)粒體呼吸酶活性，減少ROS的生成，抑制線(xiàn)粒體膜電位的下降，促進(jìn)ATP的生成。提示XXMD能夠明顯改善腦缺血/再灌注大鼠恢復(fù)早期的線(xiàn)粒體功能紊亂，說(shuō)明XXMD對(duì)MCAO大鼠恢復(fù)早期發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制與其對(duì)線(xiàn)粒體的改善作用相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，將從線(xiàn)粒體凋亡和線(xiàn)粒體自噬等調(diào)控線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)平衡的角度，進(jìn)一步探討XXMD對(duì)MCAO大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

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