痛風(fēng)顆粒各有效部位群對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

徐 熠，劉 靜，黃 瑾，崔金剛，吳鐵軍 （. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，上海 00437；. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 00437）

痛風(fēng)顆粒是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院名老中醫(yī)夏涵教授的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)方，組方精良，僅由茵陳、連錢草和伸筋草三味中藥組成，具有清熱利濕、通絡(luò)的功效，臨床多用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。在前期研究中發(fā)現(xiàn)該方對(duì)于緩解患者患處的疼痛有顯著的效果[1]。疼痛是一種因組織損傷或潛在的組織損傷而產(chǎn)生的痛苦感覺，它既是機(jī)體的一種保護(hù)性機(jī)制，提醒機(jī)體避開或處理傷害，也是臨床許多疾病的常見癥狀。本方組成中單味藥的研究發(fā)現(xiàn)，茵陳[2]、連錢草和伸筋草[3]均有抗炎鎮(zhèn)痛的效果。本研究旨在通過痛風(fēng)顆粒各有效成分及總有效成分對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究，為中藥在鎮(zhèn)痛方面的研究提供一定的基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康 SD 大鼠 56 只，雄性，SPF 級(jí)，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2016-0010。

1.2 藥材與制劑

茵陳、連錢草、伸筋草按1∶1∶1 混合，提取總黃酮、總生物堿和總有機(jī)酸，所得各部位質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞50%（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥所）；茵陳（上海上藥華宇藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2017121503）；連錢草（批號(hào)：171201）、伸筋草（批號(hào)：180201）均購自上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司；痛風(fēng)顆粒（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院委托上海寶龍藥業(yè)有限公司配制，批號(hào)：181001）；苯溴馬?。⒓永?，50 mg/片，德國赫曼大藥廠，批號(hào)：190612）。

1.3 試劑

完全弗氏佐劑（CFA，BioFroxx 公司，批號(hào)：2203ML010）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批號(hào)：190920）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素10(IL-10）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒（批號(hào)：2019101803）購自武漢益承生物科技有限公司。

1.4 儀器

IX71 光學(xué)顯微鏡 (OLYMPUS)；DNM-9602 酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；AC8 洗板機(jī)（芬蘭 Thermo Lab systems）；TGL-16M 離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（蘇州江東精密儀器有限公司）；吉爾森P 型移液器(Pipetman)。

2 方法

2.1 關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立

模型組及對(duì)照組大鼠，采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型[4-5]。取弗氏佐劑（每支10 ml），在冰浴下與卡介苗混合，配制成含卡介苗10 mg/ml的水包油乳劑，對(duì)大鼠右后足趾皮下進(jìn)針至踝關(guān)節(jié)，注射弗氏佐劑0.1 ml 致炎，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎發(fā)生；空白組于相同位置注射0.1 ml 生理鹽水。

2.2 分組給藥

SD 大鼠 56 只，雄性，體重（180±20）g，隨機(jī)分為空白組、模型組、總黃酮組、總有機(jī)酸組、總生物堿組、痛風(fēng)顆粒組、陽性對(duì)照組(苯溴馬隆)等7 組，每組8 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，模型組和對(duì)照組進(jìn)行造模，于造模后第15 天開始給藥，空白組、模型組每日給予蒸餾水1 ml 灌胃；痛風(fēng)顆粒組給予相當(dāng)于生藥6.88 g/kg 的痛風(fēng)顆粒煎劑；總黃酮組給予相當(dāng)于生藥150 mg/kg 的總黃酮提取物；總有機(jī)酸組給予相當(dāng)于生藥110 mg/kg 的總有機(jī)酸提取物；總生物堿組給予相當(dāng)于生藥90 mg/kg 的總生物堿的提取物；陽性對(duì)照組給予5.25 mg/kg 苯溴馬隆。每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d。

2.3 觀察指標(biāo)與標(biāo)本采集

2.3.1 弗氏佐劑致炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)

在各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)上同一位置劃一標(biāo)記線，分別于造模前及造模后第15、25、35、45 d測(cè)量并記錄各組大鼠右后足的標(biāo)記線以下足容積(ml3)，記錄結(jié)果，計(jì)算足趾腫脹率，[ 足趾腫脹率=（致炎后足趾體積－致炎前足趾體積）/致炎前足趾體積]。

2.3.2 弗氏佐劑致炎大鼠炎性指標(biāo)的測(cè)定

造模后第44 天，禁食禁水12 h，末次給藥2 h后將大鼠用10% 水合氯醛0.3 ml/100 g 腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血2 ml 測(cè)定大鼠血常規(guī)。

2.3.3 弗氏佐劑致炎大鼠血清中IL-6、IL-10 和TNF-α 的測(cè)定

將“2.3.2”項(xiàng)下大鼠腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置0.5 h 后，4 ℃ 保存，以 3 000 r/min，離心 10 min，取血清保存于-20 ℃條件下備用。采用ELISA 試劑盒測(cè)定并計(jì)算 IL-6、IL-10 和 TNF-α 水平。

2.3.4 弗氏佐劑致炎大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)

取大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于10% 甲醛溶液固定48 h，置于5%稀硝酸溶液，脫鈣48 h；在室溫下進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，踝關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量和多變量過程分析,計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差別（LSD）法，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

由表1 所示，與空白組相比，模型組大鼠在造模后第 15、25、35、45 天時(shí)均有顯著性差異 (P＜0. 01)，提示造模成功。與模型組相比，痛風(fēng)顆粒各有效部位群、痛風(fēng)顆粒、陽性對(duì)照組在第25、35、45 天均具有顯著性差異(P＜0.01)，提示各治療組能不同程度減輕弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度。造模后第25 天，與痛風(fēng)顆粒組比較，總生物堿組無顯著性差異(P＞0. 05)，提示造模后第25 天總生物堿組與痛風(fēng)顆粒全方組在緩解弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度的療效上相近。造模后第35 天，與陽性對(duì)照組比較，痛風(fēng)顆粒組無顯著性差異(P＞0.05)，提示造模后第35 天痛風(fēng)顆粒組與陽性對(duì)照組在緩解弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度的療效上相近。

表1 痛風(fēng)顆粒及其各有效部位群對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響(n=8，)

3.2 對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠血液中炎性指標(biāo)的影響

由表2 所示，痛風(fēng)顆粒各有效部位群對(duì)致炎大鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）影響結(jié)果提示，總有機(jī)酸組、總生物堿組、痛風(fēng)顆粒組及陽性對(duì)照組大鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)有下降的趨勢(shì)，但與模型組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。痛風(fēng)顆粒各有效部位群對(duì)致炎大鼠血液中中性粒細(xì)胞百分比（N%）的影響結(jié)果提示，總黃酮組、痛風(fēng)顆粒組和陽性對(duì)照組大鼠血液中中性粒細(xì)胞百分比含量有下降的趨勢(shì)，但與模型組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 痛風(fēng)顆粒及其各有效部位群對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比的影響(n=8，)

3.3 對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的影響

由表3 所示，與空白組比較，模型組對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠血清中IL-6、IL-10 和TNF-α 的含量有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。與模型組比較，各組均有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），提示痛風(fēng)顆粒各有效部位群能顯著降低模型大鼠的血清 IL-6、TNF-α 水平，升高 IL-10 水平。大鼠血清IL-6、TNF-α 水平與陽性對(duì)照組比較，總黃酮組、總有機(jī)酸組和總生物堿組有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），痛風(fēng)顆粒組無顯著性差異(P＞0.05)，提示痛風(fēng)顆粒組降低大鼠血清IL-6、TNF-α 水平與陽性對(duì)照組相似。大鼠血清IL-10水平，與陽性對(duì)照組比較，總黃酮組、總有機(jī)酸組有顯著性差異（P＜0.01），總生物堿組和痛風(fēng)顆粒組無顯著性差異(P＞0.05)，提示總生物堿組和痛風(fēng)顆粒組在升高IL-10 水平上與陽性對(duì)照組療效相似。

3.4 對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)改變

由圖1 所示，正常組大鼠骨、骨關(guān)節(jié)、滑膜組織未見明顯病理性改變，滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組骨關(guān)節(jié)表面軟骨破壞，大量纖維組織增生、滑膜增生，炎細(xì)胞浸潤。與模型組比較，總黃酮組骨關(guān)節(jié)表面軟骨破壞、纖維組織增生減輕、滑膜水腫；總有機(jī)酸組骨關(guān)節(jié)表面軟骨破壞和纖維組織增生減輕；總生物堿組骨關(guān)節(jié)表面軟骨破壞，纖維組織增生減輕；痛風(fēng)顆粒組骨關(guān)節(jié)軟骨無異常，滑膜細(xì)胞增生和周圍軟組織炎癥減輕；陽性對(duì)照組骨關(guān)節(jié)表面軟骨破壞和纖維組織增生減輕，滑膜僅有輕度增生。

表3 痛風(fēng)顆粒及其各有效部位群對(duì)弗氏佐劑致炎大鼠血清中 IL-6、IL-10 和 TNF-α 的影響 (n=8，)

4 討論

痛風(fēng)是一組嘌呤代謝異常的疾病，其臨床特征多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫，疼痛難忍，且多反復(fù)性發(fā)作[6]。在中醫(yī)學(xué)中類似于“痹證”“歷節(jié)”等病癥，多為因內(nèi)傷氣血虧虛，外感風(fēng)寒濕邪，以致痰瘀流注筋脈，久病入絡(luò)，痹阻關(guān)節(jié)所致[7]。痛風(fēng)顆粒中以茵陳作為君藥，有通利關(guān)節(jié)、清利濕熱的功效；臣藥連錢草，具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫的功效，取其消石之功，防止痛風(fēng)性尿路結(jié)石的產(chǎn)生；伸筋草有除濕消腫、舒筋活絡(luò)的功效。三藥配伍可以增強(qiáng)清利濕熱、通絡(luò)的作用。

本研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)顆粒及其各有效部位群能明顯抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹，用藥25 d 后，總生物堿組對(duì)大鼠腫脹率的抑制率與痛風(fēng)顆粒全組方組接近，研究表明伸筋草中的生物堿類主要有石松堿(lycopodine)型、石松定堿(lycodine)型和法氏石松堿(fawcettimine)型三種[8]，可通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用[9]，這與課題組對(duì)伸筋草中生物堿的研究結(jié)果相一致[10]。用藥第35 天，痛風(fēng)顆粒組與陽性對(duì)照組在緩解弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹程度的作用上相似，這與痛風(fēng)顆粒在臨床使用的結(jié)果相一致[11]。用藥45 d 后，痛風(fēng)顆粒及其有效部位群均能不同程度降低弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，關(guān)節(jié)炎的病理變化表現(xiàn)在滑膜細(xì)胞的炎性浸潤，各治療組病理形態(tài)學(xué)結(jié)果提示痛風(fēng)顆粒組和陽性對(duì)照組能減輕滑膜細(xì)胞增生，總黃酮組、總有機(jī)酸組和總生物堿組能減輕纖維組織增生，這與關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示痛風(fēng)顆粒及其有效部位群對(duì)弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用。

各組關(guān)節(jié)炎大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比無顯著性差異，但經(jīng)痛風(fēng)顆粒及其各有效部位群干預(yù)后，均有不同程度的下降趨勢(shì)。這可能是由于WBC 和N% 的測(cè)定在造模后第45 天進(jìn)行，大鼠的炎癥反應(yīng)有所降低，而致該炎性指標(biāo)不敏感，在今后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中宜進(jìn)一步進(jìn)行分時(shí)檢測(cè)。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué) (HE×200)

當(dāng)痛風(fēng)由急性期轉(zhuǎn)變?yōu)槁云跁r(shí)，會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)損害[12]。其機(jī)制可能與破骨細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)[13]，核轉(zhuǎn)錄因子-κB 受體（RANK）與核因子 κB 活化因子配體（RANKL）結(jié)合情況對(duì)破骨細(xì)胞的生成具有密切的聯(lián)系[14]。促炎細(xì)胞因子如IL-6 有致痛和痛覺增敏的作用，在痛風(fēng)時(shí)和間質(zhì)浸潤中表達(dá)增高，可導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的加重；促炎因子TNF-α 是關(guān)節(jié)炎早期的關(guān)鍵調(diào)控因子，其水平升高能引起滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞[15]；抗炎因子IL-10 具有抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]及下調(diào)促炎因子受體表達(dá)的作用。因此，降低血清TNF-α、IL-6[17]，升高IL-10含量能減弱對(duì)疼痛傳入神經(jīng)系統(tǒng)的刺激，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。本研究采用ELISA 法測(cè)定血清TNF-α、IL-6和IL-10分泌水平，模型組大鼠的TNF-α、IL-6 水平顯著升高、IL-10 水平顯著降低，各治療組能抑制TNF-α、IL-6 的分泌，促進(jìn)IL-10 的生成，從而減少關(guān)節(jié)的炎癥產(chǎn)生和減輕關(guān)節(jié)組織的破壞。結(jié)果表明痛風(fēng)顆粒及其有效部位群可能通過促炎因子及上調(diào)抗炎因子達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)的作用。其中痛風(fēng)顆粒組和陽性對(duì)照組在抑制TNF-α、IL-6 分泌的程度相當(dāng)，表明痛風(fēng)顆粒全方組的抑制促炎因子作用優(yōu)于各有效部位群。生物堿組和痛風(fēng)顆粒組在上調(diào)IL-10 的作用程度相當(dāng)，說明生物堿的上調(diào)抗炎因子作用與全方組相當(dāng)。有研究表明，生物堿類成分能夠激活NF-κB 信號(hào)通路，促使其進(jìn)入調(diào)控下游靶基因如IL-10 發(fā)揮抗炎作用[18]。

綜上所述，痛風(fēng)顆粒及其有效部位群能通過調(diào)控 IL-6、TNF-α 和 IL-10 水平來降低炎性因子，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛，緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。痛風(fēng)顆粒的調(diào)控要優(yōu)于各有效部位群，其中總生物堿在調(diào)控IL-10 水平上不劣于痛風(fēng)顆粒，但其作用機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步探究。