• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    四烯甲萘醌保護(hù)成骨細(xì)胞氧化損傷的作用研究

    2020-12-04 06:36:50蔣益忠林麗娟辛海量金玉娥蔣益萍薛黎明浙江省東陽(yáng)市中醫(yī)院浙江東陽(yáng)05海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室上海004上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所上海006
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:活性氧成骨細(xì)胞線粒體

    蔣益忠,林麗娟,辛海量,金玉娥,蔣益萍,薛黎明 (. 浙江省東陽(yáng)市中醫(yī)院,浙江 東陽(yáng) 05;. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 004;. 上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所,上海 006)

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是以骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病,可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加,多見于老年人。衰老是致骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要因素,隨著機(jī)體的衰老,骨骼中過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟,抑制成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)及骨基質(zhì)的礦化,同時(shí)促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。2018 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布OP 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)65歲以上人群OP 患病率達(dá)32.0%,其中,男性為10.7%,女性為51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在臨床上常單獨(dú)或協(xié)同用于防治老年性骨質(zhì)疏松癥,療效顯著[2-3],是我國(guó)現(xiàn)版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》和《骨質(zhì)疏松癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南》的推薦藥物[1-2]。藥理研究發(fā)現(xiàn),MK4能促進(jìn)成骨增殖、分化和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白,在成骨細(xì)胞骨形成中發(fā)揮保護(hù)作用[5],且能阻止成骨細(xì)胞凋亡[6]。過(guò)氧化氫(H2O2)是ROS 在體內(nèi)存在的主要形式,會(huì)穿透成骨細(xì)胞造成細(xì)胞損傷,本研究擬探討MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用和調(diào)控機(jī)制,闡明MK4抗老年性骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

    1 材料

    成骨細(xì)胞系MC3T3-El(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞資源中心);特級(jí)胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素和鏈霉素混合液)和PBS 緩沖液(pH=7.2)均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司;噻唑藍(lán)(MTT)、MK4(Sigma 公司)。過(guò)氧化氫 (H2O2,比利時(shí) Acros Organics 公司);丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、JC-1 線粒體膜電勢(shì)(MMP)試劑盒和活性氧(ROS)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒(均為Thermo Fisher 公司產(chǎn)品);叉頭框蛋白 (FoxO1 和FoxO3)、β 細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因 2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    2 方法

    2.1 MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞活力

    復(fù)蘇MC3T3-El 小鼠成骨細(xì)胞系,置于5 ml含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中,放入 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng) 24 h 后,分別采用 0、10、20、50 和 100 μmol/L(n =10)的 H2O2處理,培養(yǎng) 4、12、24 h 后,采用碧云天MTT 試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

    以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后,并按空白、氧化應(yīng)激模型、藥物劑量分組:①對(duì)照組,②選擇合適濃度H2O2組,③H2O2+10 μmol/L MK4組,④H2O2+1 μmol/L MK4組,⑤H2O2+ 0.1 μmol/L MK4組。加入藥物培養(yǎng)24 h,采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

    2.2 成骨細(xì)胞 ALP 活性

    以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,連續(xù)培養(yǎng)6 d,每3 d 換液1 次,采用硝基苯酚磷酸二鈉法檢測(cè)ALP 活性。給藥6 d 后,棄培養(yǎng)液,PBS 洗 3 次,依次加入 100 μl 二乙醇胺(50 mmol/L),50 μl 的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉(2.5 mmol/L),在 37 ℃孵育 30 min,再加入 50 μl 的 0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),置405nm 處,測(cè)吸光度值(A)。以不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,ALP 活性由每孔釋放的對(duì)硝基苯酚的μmol 數(shù)表示。

    2.3 成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)面積

    以5×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞將MC3T3-El 細(xì)胞接種于 12 孔板內(nèi),放入 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱,12 h 后換骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml 抗壞血酸以及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,每3 d 換液1 次,連續(xù)培養(yǎng)14 d,采用0.1%茜素紅-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色,37 ℃下染色30 min,采用倒置相差顯微鏡 (Leica DMI 3000)觀察,并隨機(jī)拍照10 張,用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨結(jié)節(jié)面積。

    2.4 細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、ROS 和氧化應(yīng)激酶MDA、GSH、SOD 測(cè)定

    以 2×105/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 24 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,用熒光酶標(biāo)儀法分別測(cè)定JC-1 單體和復(fù)合物的熒光,DCFH-DA 探針法測(cè)活性氧水平,ELISA 法測(cè)定 GSH、SOD 和 MDA 水平。

    2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 12 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,依據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書,采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)。

    2.6 RT-PCR

    以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 12 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄后,分別 對(duì)GAPDH 、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2 和bax 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增,引物序列見表 1,PCR 反應(yīng)條件:采用預(yù)變性 95 ℃、10 min,變性 95 ℃、45 s,退火 60 ℃、45 s,延伸 72 ℃、50 s,循環(huán) 40 次,總反應(yīng)體系為 10 μl。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SPSS 軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05),再采用Student's t test 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 小鼠引物序列

    3 結(jié)果

    3.1 H2O2 處理 MC3T3-El 成骨細(xì)胞

    MC3T3-E1 經(jīng) 0~100 μmol/L H2O2分別處理4、12、24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0~100 μmol/L H2O2處理4 h 對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)顯著性影響(P>0.05),處理12 h 后,在 50 和 100 μmol/L H2O2下的細(xì)胞活力顯著降低,分別降低19.4%和33.4%。H2O2干預(yù)24 h后,在 20、50、100 μmol/L 均具有顯著性差異,分別降低13.2%,47.4%和57.9%(表2)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇 20 μmol/L處理 24 h。

    3.2 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞增殖、ALP 活性和骨結(jié)節(jié)形成的影響

    MC3T3-E1 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理 24 h 后,結(jié)果顯示,顯著抑制了成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力(P<0.05),ALP 活性 (P<0.05) 和骨結(jié)節(jié)形成面積 (P<0.05),與空白組比較,分別降低13%、16%和85%,見表 3 和圖 1。與模型組比較,MK4在 1~10 μmol/L可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞增殖(P<0.05)。同樣,MK4在 1~10 μmol/L 能顯著改善 ALP 活性 (P<0.05)和提高骨結(jié)節(jié)形成面積(P<0.05),分別增加50.7%和 44.5% (表 3 和圖 1)。

    3.3 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、活性氧和抗氧化酶的影響

    MC3T3-E1 成骨細(xì)胞 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理24 h 后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著降低成骨細(xì)胞膜電勢(shì)和增高活性氧含量 (P<0.05)。與模型組比較,MK4在10 μmol/L 可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞膜電勢(shì)升高和降低活性氧含量(P<0.05)。與空白組比較,20 μmol/L H2O2能顯著降低 FoxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA 表達(dá) (P<0.05)。與 H2O2組比較,給予10 μmol/L MK4后,F(xiàn)oxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA表達(dá)均顯著增高(P<0.01)。

    3.4 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

    在通道1 和通道2 觀察單個(gè)細(xì)胞分布區(qū)域,選定99.9%的細(xì)胞區(qū)域用于后續(xù)分析,在通道3 和通道4 觀察凋亡細(xì)胞分布,Q4 為正常細(xì)胞,Q1 為壞死細(xì)胞;Q2 為晚期凋亡細(xì)胞,Q3 為早期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組比較,20 μmol/L H2O2處理 24 h 后,細(xì)胞的凋亡率顯著增高(P<0.05)。經(jīng)0.1~10 μmol/L 濃度 MK4干預(yù) 24 h 后發(fā)現(xiàn),1~10 μmol/L濃度MK4能顯著降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05),與對(duì)照組相近,見表3 和圖2。與空白組比較,20 μmol/L H2O2能顯著降低 Bcl-2 的 mRNA 表達(dá) (P<0.001),bax 表達(dá)無(wú)顯著差異,給予 10 μmol/L MK4后,Bcl-2和bax 的mRNA 表達(dá)均顯著增高(P<0.01),見圖3。H2O2組的bax/Bcl-2 比值為對(duì)照組的22.5 倍,而MK4處理后降低至對(duì)照組的7.6 倍。

    表2 H2O2 處理的時(shí)間與濃度對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

    表3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞的影響

    圖1 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)的影響 (×200)

    圖2 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

    圖3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞氧化和凋亡相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響

    4 結(jié)論與討論

    骨代謝中,機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)FoxOs 轉(zhuǎn)錄因子的活性,產(chǎn)生抗氧化物酶,對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)骨骼的損傷,包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6 等,其中,F(xiàn)oxO1 和FoxO3 是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化還原平衡和成骨功能的主要分子[7]?;钚匝蹩杉せ頕oxO1 的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)線粒體抗氧化酶Mn-SOD 的活性[8]。隨著活性氧的升高,F(xiàn)oxO3 下調(diào),成骨細(xì)胞分化受損,抑制骨形成作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn),MK4對(duì)H2O2引起的氧化應(yīng)激具有顯著的改善作用,降低活性氧和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 水平,上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1、FoxO3 和抗氧化酶SOD 的mRNA 表達(dá)。

    Bcl-2 蛋白可減少氧化應(yīng)激水平,而bax 基因可與Bcl-2 形成異源二聚體,抑制Bcl-2 的作用,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MK4可上調(diào)Bcl-2/bax 比值,抑制了成骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2能顯著提高成骨細(xì)胞凋亡率,同時(shí)增加bax 的表達(dá),降低Bcl-2 蛋白表達(dá)。MK4處理組對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的拮抗作用明顯,隨著劑量濃度增加而增加。MK4在在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,可顯著上調(diào)Bcl-2,下調(diào)bax 的基因表達(dá),bax/Bcl-2 比值顯著降低,抑制了成骨細(xì)胞凋亡。

    FoxOs 激活促進(jìn)Bcl-2 相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)蛋白(Bim)轉(zhuǎn)錄,Bim 是線粒體凋亡通路的核心調(diào)控者,引起成骨細(xì)胞線粒體膜電位降低[10]。線粒體跨膜電位降低說(shuō)明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP) 過(guò)度開放。若MPTP 過(guò)度開放,易引起呼吸鏈解偶聯(lián),線粒體基質(zhì)滲透壓增高,使得促凋亡活性物質(zhì)從線粒體釋放入細(xì)胞基質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MK4顯著改善了H2O2刺激的成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)降低,表明MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。

    綜上所述,MK4能顯著抑制H2O2刺激的成骨細(xì)胞氧化損傷,機(jī)制與FoxO 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。同時(shí),MK4對(duì)H2O2引起的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用,其機(jī)制為上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)bax 的基因表達(dá)。

    猜你喜歡
    活性氧成骨細(xì)胞線粒體
    棘皮動(dòng)物線粒體基因組研究進(jìn)展
    線粒體自噬與帕金森病的研究進(jìn)展
    淫羊藿次苷Ⅱ通過(guò)p38MAPK調(diào)控成骨細(xì)胞護(hù)骨素表達(dá)的體外研究
    土家傳統(tǒng)藥刺老苞總皂苷對(duì)2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷改善
    TLR3活化對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)活性氧簇表達(dá)的影響
    Bim在激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及意義
    硅酸鈉處理對(duì)杏果實(shí)活性氧和苯丙烷代謝的影響
    NF-κB介導(dǎo)線粒體依賴的神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑
    O2聯(lián)合CO2氣調(diào)對(duì)西蘭花活性氧代謝及保鮮效果的影響
    活性氧調(diào)節(jié)單核細(xì)胞增生李斯特菌菌膜形成
    97超视频在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 99久久中文字幕三级久久日本| 舔av片在线| videossex国产| 又爽又黄无遮挡网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲在久久综合| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区 | av免费观看日本| 变态另类丝袜制服| 国产淫片久久久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 不卡视频在线观看欧美| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久末码| 级片在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 免费看av在线观看网站| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 国产成年人精品一区二区| 97热精品久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 欧美日韩国产亚洲二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲国产精品成人久久小说 | 黄色视频,在线免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品人妻少妇| 久久久精品欧美日韩精品| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 乱系列少妇在线播放| 精品久久久噜噜| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产成人a区在线观看| 在线a可以看的网站| 一区福利在线观看| av卡一久久| 晚上一个人看的免费电影| 欧美人与善性xxx| 日韩欧美精品v在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费观看a级毛片全部| 超碰av人人做人人爽久久| 人妻系列 视频| 少妇的逼水好多| 国产乱人视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 51国产日韩欧美| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费看a级黄色片| 色哟哟·www| 简卡轻食公司| 尾随美女入室| 国产不卡一卡二| 岛国在线免费视频观看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲国产精品合色在线| 精品一区二区免费观看| 99久国产av精品国产电影| 国产成人a区在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久久午夜电影| 国产69精品久久久久777片| 国产亚洲精品av在线| 国产三级在线视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | АⅤ资源中文在线天堂| 99热全是精品| www.av在线官网国产| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产成人影院久久av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日本黄色视频三级网站网址| 国产一区二区在线av高清观看| 老司机影院成人| 99热这里只有是精品50| av在线蜜桃| 久久久久久久久久黄片| 精品一区二区三区视频在线| 麻豆一二三区av精品| 久久热精品热| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩一区二区三区影片| 国产午夜精品论理片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲最大成人av| 久久精品夜色国产| 麻豆一二三区av精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一级二级三级毛片免费看| 又爽又黄无遮挡网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 久99久视频精品免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91av网一区二区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品色激情综合| 亚洲国产色片| 搞女人的毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 成人特级av手机在线观看| 国产真实乱freesex| 久久人妻av系列| 国产午夜福利久久久久久| 天堂√8在线中文| 美女 人体艺术 gogo| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 插阴视频在线观看视频| 联通29元200g的流量卡| 婷婷色综合大香蕉| 日本欧美国产在线视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产色爽女视频免费观看| 两个人的视频大全免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产亚洲av天美| 在线天堂最新版资源| 国产成人精品婷婷| 国产精品久久久久久久久免| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲无线在线观看| 精品久久久久久成人av| 不卡一级毛片| 国产高清有码在线观看视频| 国产日韩欧美在线精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩欧美在线乱码| www日本黄色视频网| 日韩av在线大香蕉| 久久久精品大字幕| 久久国产乱子免费精品| 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美日韩东京热| av国产免费在线观看| 丝袜美腿在线中文| 国内精品久久久久精免费| 国产亚洲5aaaaa淫片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 少妇熟女欧美另类| 国产熟女欧美一区二区| av在线天堂中文字幕| 99热这里只有精品一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 综合色丁香网| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 精品人妻视频免费看| 成人无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 国产高清激情床上av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| www.色视频.com| 国产人妻一区二区三区在| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产亚洲91精品色在线| 精品日产1卡2卡| 久久精品91蜜桃| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | av在线蜜桃| 亚洲av一区综合| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩人妻高清精品专区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲av成人精品一区久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品电影一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国语自产精品视频在线第100页| 长腿黑丝高跟| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久午夜欧美精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文字幕久久专区| 亚洲美女视频黄频| 性欧美人与动物交配| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区在线av高清观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成人久久性| 69人妻影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 婷婷亚洲欧美| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲国产色片| 欧美区成人在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲欧美精品综合久久99| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人漫画全彩无遮挡| 乱码一卡2卡4卡精品| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲av免费高清在线观看| 特级一级黄色大片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日本一本二区三区精品| 亚洲美女视频黄频| 免费看日本二区| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩乱码在线| 国产午夜精品一二区理论片| 国产私拍福利视频在线观看| 精品久久久久久成人av| 黄片无遮挡物在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av二区三区四区| 久久久精品94久久精品| 国产av一区在线观看免费| 在线观看av片永久免费下载| videossex国产| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲电影在线观看av| 久久综合国产亚洲精品| 看黄色毛片网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 欧美三级亚洲精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人a区在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久国产网址| av在线天堂中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜激情欧美在线| 男的添女的下面高潮视频| 一区二区三区免费毛片| 久久亚洲国产成人精品v| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产亚洲av嫩草精品影院| 特大巨黑吊av在线直播| 午夜激情欧美在线| 青春草视频在线免费观看| 特级一级黄色大片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 日韩av在线大香蕉| 免费人成在线观看视频色| 女同久久另类99精品国产91| 边亲边吃奶的免费视频| 精品久久久久久久久av| 日韩高清综合在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 看非洲黑人一级黄片| 欧美一区二区亚洲| 九九爱精品视频在线观看| av福利片在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产精品合色在线| av免费观看日本| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 99久国产av精品| 三级经典国产精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 禁无遮挡网站| 国产精品电影一区二区三区| 只有这里有精品99| 嫩草影院新地址| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人精品婷婷| 日本黄色片子视频| 国产黄片美女视频| 亚洲av免费在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲性久久影院| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品成人久久小说 | 色噜噜av男人的天堂激情| 国产成人影院久久av| 国内精品一区二区在线观看| 两个人视频免费观看高清| 日韩成人伦理影院| 亚洲最大成人av| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产高清激情床上av| 国产一级毛片在线| 国产 一区精品| 亚洲国产色片| 国产成人一区二区在线| 成人三级黄色视频| 中文字幕熟女人妻在线| 一级黄片播放器| 九草在线视频观看| a级毛片a级免费在线| 久久99热6这里只有精品| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲成人久久性| 91久久精品国产一区二区三区| 成人二区视频| 伦理电影大哥的女人| 久久精品国产清高在天天线| 国产精华一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 国产亚洲5aaaaa淫片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美三级亚洲精品| or卡值多少钱| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 精品久久久久久久久av| 干丝袜人妻中文字幕| 国产三级中文精品| 51国产日韩欧美| 22中文网久久字幕| 日韩亚洲欧美综合| 一进一出抽搐gif免费好疼| videossex国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久成人免费电影| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美日韩在线观看h| 免费在线观看成人毛片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产中年淑女户外野战色| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久网色| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久网色| 久久热精品热| 久久久久性生活片| 久久99蜜桃精品久久| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美精品v在线| 国产69精品久久久久777片| 国产三级在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美成人精品欧美一级黄| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产69精品久久久久777片| 久久人人精品亚洲av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本五十路高清| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产成人aa在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品一区www在线观看| 91久久精品电影网| 免费在线观看成人毛片| 美女大奶头视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| www.色视频.com| 一本精品99久久精品77| 波多野结衣高清作品| 国产探花在线观看一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久久久久久久中文| 中国国产av一级| 日韩成人伦理影院| 成人午夜高清在线视频| 免费av不卡在线播放| 成人无遮挡网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 天堂网av新在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 久久精品国产清高在天天线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 有码 亚洲区| 久久久久久久久中文| av在线天堂中文字幕| 久久久久久久久久成人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲经典国产精华液单| 毛片女人毛片| ponron亚洲| 久久精品夜色国产| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产一级毛片在线| 丰满的人妻完整版| 青春草视频在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品99久久久久久久久| 国产成人a∨麻豆精品| 天天一区二区日本电影三级| 欧美zozozo另类| 波野结衣二区三区在线| 毛片女人毛片| 男人舔奶头视频| 国产人妻一区二区三区在| 日日啪夜夜撸| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一区二区三区免费毛片| 两个人的视频大全免费| 成年免费大片在线观看| 少妇丰满av| av黄色大香蕉| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精品不卡国产一区二区三区| 简卡轻食公司| 欧美日韩在线观看h| 亚洲人成网站在线播| 丰满的人妻完整版| 成人欧美大片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 看免费成人av毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 青春草国产在线视频 | 人妻系列 视频| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久久久久丰满| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 岛国在线免费视频观看| 欧美三级亚洲精品| 日韩一区二区三区影片| 久久亚洲精品不卡| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲高清免费不卡视频| 成年版毛片免费区| 日韩亚洲欧美综合| 久久99蜜桃精品久久| 高清毛片免费看| 日韩欧美三级三区| 亚洲成av人片在线播放无| 99国产精品一区二区蜜桃av| 永久网站在线| 麻豆乱淫一区二区| 午夜a级毛片| 精品久久久久久久久久免费视频| 我要看日韩黄色一级片| 伦理电影大哥的女人| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 如何舔出高潮| 深夜精品福利| 亚洲性久久影院| 好男人视频免费观看在线| 身体一侧抽搐| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品久久久久久精品电影| 联通29元200g的流量卡| 一个人免费在线观看电影| 在线a可以看的网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 2021天堂中文幕一二区在线观| 九九爱精品视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 看黄色毛片网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品一二三区在线看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产成人a区在线观看| 舔av片在线| .国产精品久久| 国产人妻一区二区三区在| 美女大奶头视频| av黄色大香蕉| 在线免费观看的www视频| 久久人妻av系列| 国产在视频线在精品| 日日啪夜夜撸| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品自拍成人| 能在线免费观看的黄片| 边亲边吃奶的免费视频| 1024手机看黄色片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产亚洲精品久久久com| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男人的好看免费观看在线视频| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| 在线天堂最新版资源| 成人无遮挡网站| 熟女电影av网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费人成视频x8x8入口观看| 一个人看视频在线观看www免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 黄色配什么色好看| av卡一久久| 国产熟女欧美一区二区| 99久久精品国产国产毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲人与动物交配视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品伦人一区二区| 2022亚洲国产成人精品| 色视频www国产| 在线观看一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 在线免费观看的www视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 男女边吃奶边做爰视频| 精品国内亚洲2022精品成人| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲精品456在线播放app| www日本黄色视频网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 免费av毛片视频| 久久人妻av系列| 久久精品影院6| 日韩一区二区视频免费看| 国产视频首页在线观看| 麻豆成人av视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品国产av成人精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产av在哪里看| 91精品国产九色| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产 一区 欧美 日韩| 精品午夜福利在线看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久久网色| 亚洲真实伦在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲最大成人中文| 成人无遮挡网站| 国产极品精品免费视频能看的| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品自拍成人| 成人二区视频| 热99在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 变态另类丝袜制服| 欧美日本视频| 日本av手机在线免费观看| 色综合色国产| 中国美女看黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 三级毛片av免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲综合色惰| 美女被艹到高潮喷水动态| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲国产精品合色在线| 性色avwww在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美日韩精品成人综合77777| 级片在线观看| 精品久久久久久久久av| 91狼人影院| 日日摸夜夜添夜夜爱| 九九在线视频观看精品| 久久草成人影院| 97在线视频观看| av福利片在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产一区二区激情短视频| 国产精品1区2区在线观看.| 美女高潮的动态| 亚洲精品粉嫩美女一区| 波野结衣二区三区在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产一区二区在线av高清观看| 女同久久另类99精品国产91| 嘟嘟电影网在线观看| 国产一区二区激情短视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人美女网站在线观看视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美最黄视频在线播放免费| 能在线免费看毛片的网站| 婷婷色综合大香蕉| 欧美高清成人免费视频www| 高清毛片免费观看视频网站|