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    四烯甲萘醌保護(hù)成骨細(xì)胞氧化損傷的作用研究

    2020-12-04 06:36:50蔣益忠林麗娟辛海量金玉娥蔣益萍薛黎明浙江省東陽(yáng)市中醫(yī)院浙江東陽(yáng)05海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室上海004上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所上海006
    藥學(xué)實(shí)踐雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:活性氧成骨細(xì)胞線粒體

    蔣益忠,林麗娟,辛海量,金玉娥,蔣益萍,薛黎明 (. 浙江省東陽(yáng)市中醫(yī)院,浙江 東陽(yáng) 05;. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室,上海 004;. 上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所,上海 006)

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是以骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量減少為特征的全身性骨代謝疾病,可導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加,多見于老年人。衰老是致骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要因素,隨著機(jī)體的衰老,骨骼中過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟,抑制成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)及骨基質(zhì)的礦化,同時(shí)促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。2018 年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布OP 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)65歲以上人群OP 患病率達(dá)32.0%,其中,男性為10.7%,女性為51.6%[1]。四烯甲萘醌(menatetrenone, MK4)在臨床上常單獨(dú)或協(xié)同用于防治老年性骨質(zhì)疏松癥,療效顯著[2-3],是我國(guó)現(xiàn)版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》和《骨質(zhì)疏松癥中西醫(yī)結(jié)合診療指南》的推薦藥物[1-2]。藥理研究發(fā)現(xiàn),MK4能促進(jìn)成骨增殖、分化和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性[3-4]。MK4能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白,在成骨細(xì)胞骨形成中發(fā)揮保護(hù)作用[5],且能阻止成骨細(xì)胞凋亡[6]。過(guò)氧化氫(H2O2)是ROS 在體內(nèi)存在的主要形式,會(huì)穿透成骨細(xì)胞造成細(xì)胞損傷,本研究擬探討MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用和調(diào)控機(jī)制,闡明MK4抗老年性骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

    1 材料

    成骨細(xì)胞系MC3T3-El(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究細(xì)胞資源中心);特級(jí)胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素和鏈霉素混合液)和PBS 緩沖液(pH=7.2)均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司;噻唑藍(lán)(MTT)、MK4(Sigma 公司)。過(guò)氧化氫 (H2O2,比利時(shí) Acros Organics 公司);丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、JC-1 線粒體膜電勢(shì)(MMP)試劑盒和活性氧(ROS)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒(均為Thermo Fisher 公司產(chǎn)品);叉頭框蛋白 (FoxO1 和FoxO3)、β 細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因 2(Bcl2)和凋亡基因(Bax)等引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    2 方法

    2.1 MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞活力

    復(fù)蘇MC3T3-El 小鼠成骨細(xì)胞系,置于5 ml含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中,放入 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱。以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng) 24 h 后,分別采用 0、10、20、50 和 100 μmol/L(n =10)的 H2O2處理,培養(yǎng) 4、12、24 h 后,采用碧云天MTT 試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

    以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后,并按空白、氧化應(yīng)激模型、藥物劑量分組:①對(duì)照組,②選擇合適濃度H2O2組,③H2O2+10 μmol/L MK4組,④H2O2+1 μmol/L MK4組,⑤H2O2+ 0.1 μmol/L MK4組。加入藥物培養(yǎng)24 h,采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。

    2.2 成骨細(xì)胞 ALP 活性

    以2×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,連續(xù)培養(yǎng)6 d,每3 d 換液1 次,采用硝基苯酚磷酸二鈉法檢測(cè)ALP 活性。給藥6 d 后,棄培養(yǎng)液,PBS 洗 3 次,依次加入 100 μl 二乙醇胺(50 mmol/L),50 μl 的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉(2.5 mmol/L),在 37 ℃孵育 30 min,再加入 50 μl 的 0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液終止反應(yīng),置405nm 處,測(cè)吸光度值(A)。以不同濃度的對(duì)硝基苯酚溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,ALP 活性由每孔釋放的對(duì)硝基苯酚的μmol 數(shù)表示。

    2.3 成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)面積

    以5×104/ml 濃度的成骨細(xì)胞將MC3T3-El 細(xì)胞接種于 12 孔板內(nèi),放入 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱,12 h 后換骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.1%牛血清白蛋白、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml 抗壞血酸以及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,每3 d 換液1 次,連續(xù)培養(yǎng)14 d,采用0.1%茜素紅-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色,37 ℃下染色30 min,采用倒置相差顯微鏡 (Leica DMI 3000)觀察,并隨機(jī)拍照10 張,用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析骨結(jié)節(jié)面積。

    2.4 細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、ROS 和氧化應(yīng)激酶MDA、GSH、SOD 測(cè)定

    以 2×105/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 24 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,用熒光酶標(biāo)儀法分別測(cè)定JC-1 單體和復(fù)合物的熒光,DCFH-DA 探針法測(cè)活性氧水平,ELISA 法測(cè)定 GSH、SOD 和 MDA 水平。

    2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 12 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,依據(jù)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書,采用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)。

    2.6 RT-PCR

    以 1×106/ml 細(xì)胞濃度鋪 6 孔板,培養(yǎng) 12 h 后,按照方法“2.1”項(xiàng)下設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組,干預(yù)24 h 后,依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄后,分別 對(duì)GAPDH 、SOD2、FoxO1、FoxO3、Bcl-2 和bax 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增,引物序列見表 1,PCR 反應(yīng)條件:采用預(yù)變性 95 ℃、10 min,變性 95 ℃、45 s,退火 60 ℃、45 s,延伸 72 ℃、50 s,循環(huán) 40 次,總反應(yīng)體系為 10 μl。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SPSS 軟件經(jīng)ANOVA方差分析檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(α=0.05),再采用Student's t test 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 小鼠引物序列

    3 結(jié)果

    3.1 H2O2 處理 MC3T3-El 成骨細(xì)胞

    MC3T3-E1 經(jīng) 0~100 μmol/L H2O2分別處理4、12、24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0~100 μmol/L H2O2處理4 h 對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)顯著性影響(P>0.05),處理12 h 后,在 50 和 100 μmol/L H2O2下的細(xì)胞活力顯著降低,分別降低19.4%和33.4%。H2O2干預(yù)24 h后,在 20、50、100 μmol/L 均具有顯著性差異,分別降低13.2%,47.4%和57.9%(表2)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇 20 μmol/L處理 24 h。

    3.2 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞增殖、ALP 活性和骨結(jié)節(jié)形成的影響

    MC3T3-E1 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理 24 h 后,結(jié)果顯示,顯著抑制了成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力(P<0.05),ALP 活性 (P<0.05) 和骨結(jié)節(jié)形成面積 (P<0.05),與空白組比較,分別降低13%、16%和85%,見表 3 和圖 1。與模型組比較,MK4在 1~10 μmol/L可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞增殖(P<0.05)。同樣,MK4在 1~10 μmol/L 能顯著改善 ALP 活性 (P<0.05)和提高骨結(jié)節(jié)形成面積(P<0.05),分別增加50.7%和 44.5% (表 3 和圖 1)。

    3.3 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)、活性氧和抗氧化酶的影響

    MC3T3-E1 成骨細(xì)胞 經(jīng) 20 μmol/L H2O2處理24 h 后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著降低成骨細(xì)胞膜電勢(shì)和增高活性氧含量 (P<0.05)。與模型組比較,MK4在10 μmol/L 可促進(jìn)H2O2損傷成骨細(xì)胞膜電勢(shì)升高和降低活性氧含量(P<0.05)。與空白組比較,20 μmol/L H2O2能顯著降低 FoxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA 表達(dá) (P<0.05)。與 H2O2組比較,給予10 μmol/L MK4后,F(xiàn)oxO1, FoxO3 和 SOD2的 mRNA表達(dá)均顯著增高(P<0.01)。

    3.4 MK4 對(duì)H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

    在通道1 和通道2 觀察單個(gè)細(xì)胞分布區(qū)域,選定99.9%的細(xì)胞區(qū)域用于后續(xù)分析,在通道3 和通道4 觀察凋亡細(xì)胞分布,Q4 為正常細(xì)胞,Q1 為壞死細(xì)胞;Q2 為晚期凋亡細(xì)胞,Q3 為早期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組比較,20 μmol/L H2O2處理 24 h 后,細(xì)胞的凋亡率顯著增高(P<0.05)。經(jīng)0.1~10 μmol/L 濃度 MK4干預(yù) 24 h 后發(fā)現(xiàn),1~10 μmol/L濃度MK4能顯著降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05),與對(duì)照組相近,見表3 和圖2。與空白組比較,20 μmol/L H2O2能顯著降低 Bcl-2 的 mRNA 表達(dá) (P<0.001),bax 表達(dá)無(wú)顯著差異,給予 10 μmol/L MK4后,Bcl-2和bax 的mRNA 表達(dá)均顯著增高(P<0.01),見圖3。H2O2組的bax/Bcl-2 比值為對(duì)照組的22.5 倍,而MK4處理后降低至對(duì)照組的7.6 倍。

    表2 H2O2 處理的時(shí)間與濃度對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

    表3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞的影響

    圖1 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞骨結(jié)節(jié)的影響 (×200)

    圖2 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響

    圖3 MK4 對(duì) H2O2 損傷成骨細(xì)胞氧化和凋亡相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響

    4 結(jié)論與討論

    骨代謝中,機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)FoxOs 轉(zhuǎn)錄因子的活性,產(chǎn)生抗氧化物酶,對(duì)抗氧化應(yīng)激對(duì)骨骼的損傷,包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4 和 FoxO6 等,其中,F(xiàn)oxO1 和FoxO3 是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化還原平衡和成骨功能的主要分子[7]?;钚匝蹩杉せ頕oxO1 的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)線粒體抗氧化酶Mn-SOD 的活性[8]。隨著活性氧的升高,F(xiàn)oxO3 下調(diào),成骨細(xì)胞分化受損,抑制骨形成作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn),MK4對(duì)H2O2引起的氧化應(yīng)激具有顯著的改善作用,降低活性氧和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 水平,上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FoxO1、FoxO3 和抗氧化酶SOD 的mRNA 表達(dá)。

    Bcl-2 蛋白可減少氧化應(yīng)激水平,而bax 基因可與Bcl-2 形成異源二聚體,抑制Bcl-2 的作用,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MK4可上調(diào)Bcl-2/bax 比值,抑制了成骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2能顯著提高成骨細(xì)胞凋亡率,同時(shí)增加bax 的表達(dá),降低Bcl-2 蛋白表達(dá)。MK4處理組對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的拮抗作用明顯,隨著劑量濃度增加而增加。MK4在在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,可顯著上調(diào)Bcl-2,下調(diào)bax 的基因表達(dá),bax/Bcl-2 比值顯著降低,抑制了成骨細(xì)胞凋亡。

    FoxOs 激活促進(jìn)Bcl-2 相關(guān)凋亡調(diào)節(jié)蛋白(Bim)轉(zhuǎn)錄,Bim 是線粒體凋亡通路的核心調(diào)控者,引起成骨細(xì)胞線粒體膜電位降低[10]。線粒體跨膜電位降低說(shuō)明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP) 過(guò)度開放。若MPTP 過(guò)度開放,易引起呼吸鏈解偶聯(lián),線粒體基質(zhì)滲透壓增高,使得促凋亡活性物質(zhì)從線粒體釋放入細(xì)胞基質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MK4顯著改善了H2O2刺激的成骨細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)降低,表明MK4對(duì)H2O2刺激成骨細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。

    綜上所述,MK4能顯著抑制H2O2刺激的成骨細(xì)胞氧化損傷,機(jī)制與FoxO 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。同時(shí),MK4對(duì)H2O2引起的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用,其機(jī)制為上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)bax 的基因表達(dá)。

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