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    離心超濾結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中替考拉寧游離濃度

    2020-12-04 06:36:56付文倩張敏新姚囡囡張麗麗宋洪濤中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九醫(yī)院藥學(xué)科福建福州350025沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院遼寧沈陽006
    藥學(xué)實踐雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:拉寧濾液游離

    付文倩,張敏新,姚囡囡,張麗麗,宋洪濤 (. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科,福建 福州 350025;2. 沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,遼寧 沈陽 006)

    替考拉寧(teicoplanin)是一種糖肽類抗生素, 常用于治療包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在內(nèi)的G+菌引起的感染[1]。它包括5 個主要成分(TA 2-1、TA 2-2、TA 2-3、TA 2-4 和 TA 2-5)、1 個水解成分(TA 3-1)和 4 個次要成分(RS-1~RS-4)[2]。其中,TA 2-2 組分是活性最強的化合物,占各組分相對含量的40%以上[3-4],臨床上常常通過測定TA 2-2 的含量來監(jiān)測替考拉寧的濃度[5-6]。目前,替考拉寧治療藥物監(jiān)測主要以測定總濃度為主,但監(jiān)測結(jié)果存在較大的個體差異。主要因為替考拉寧蛋白結(jié)合率較高(90 %~95%),在血液循環(huán)中主要與白蛋白(Alb)結(jié)合并處于動態(tài)平衡,未結(jié)合的游離部分在體內(nèi)發(fā)揮藥效[7]。健康狀態(tài)下,人體白蛋白為正常水平(35~52 g/L),不同患者藥物的血漿蛋白結(jié)合率變化不大;但在低蛋白血癥(Alb<25 g/L)[8-10]、危重癥、酸血癥、腎衰竭、肝硬化、吸煙、多種藥物合用等特殊情況下,患者常伴有白蛋白水平下降,當(dāng)Alb<30 g/L 時,白蛋白就會對替考拉寧游離濃度產(chǎn)生顯著影響從而影響療效[7,10]。同時,游離藥物水平升高導(dǎo)致腎臟排泄增加,腎毒性風(fēng)險增加[11-12]。所以,針對上述白蛋白水平較低的患者,單純用總濃度去評價替考拉寧的療效和安全性是片面的,若同時測定替考拉寧游離濃度,將更加利于臨床精準(zhǔn)調(diào)整給藥方案,以獲得滿意的治療效果,減少或避免不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究旨在建立一種簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的離心超濾結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLCMS/MS)用來測定替考拉寧游離濃度,為臨床實現(xiàn)替考拉寧游離血藥濃度監(jiān)測提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗儀器

    QTRAP 5 500 型三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國 AB-SCIEX 有限公司);30AD 型超高效液相色譜儀(日本島津有限公司);AL204 型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);H1850R臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);Vortex-5 型渦旋混合機(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);超純水儀系統(tǒng)(默克密理博上海有限公司);Centrifree?超過濾裝置(截留分子量>30 000 的物質(zhì))(默克密理博上海有限公司);DK-S24 型電熱恒溫水浴器(上海精密試驗設(shè)備有限公司)。

    1.2 藥品和試劑

    替考拉寧對照品(中國食品藥品檢定研究院);甲酸、醋酸銨(色譜純,Dikma 科技有限公司);乙腈(色譜純,Sigma-Aldrich 公司)。

    1.3 UPLC-MS/MS 分析條件

    1.3.1 UPLC 分析條件

    色譜柱:EndeavorsilTMC18柱 (50 mm×2.1 mm,1.8 μm); 流 動 相 A:0.02 mol/L 醋 酸 銨 溶 液(含0.1%甲酸),流動相B:乙腈,梯度洗脫信息見表1;柱溫:35 ℃;進樣量:5 μl。

    1.3.2 MS 檢測條件離子源參數(shù):

    噴霧針電壓(ISV):5 500 V;碰撞氣(CAD):medium;氣簾氣(CUR):20 psi;入口電壓(EP):10 V;去簇電壓(DP):78 V;碰撞能量(CE):20.74 V;碰撞池出口電壓(CXP):13 V;離子源氣體 1(GS1):55 psi;離子源氣體 2(GS2):60 psi;離子源溫度(TEM):550 ℃。檢測模式:電噴霧離子化(ESI),選擇性離子檢測(SIM),正離子。多離子反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)離子對:替考拉寧TA2-2 m/z 940.7→316.2。掃描時間:200 ms。

    表1 梯度洗脫信息

    1.4 工作液的配制

    精密稱取替考拉寧對照品2.0 mg 置于100 ml容量瓶中,用超純水溶解并稀釋至刻度,得到濃度為20.0 μg/ml 的儲備液。分別取不同體積的替考拉寧儲備液,用超純水稀釋成濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.0、16.0 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液,以及 0.50、3.00、12.0 μg/ml 的質(zhì)控工作液。

    1.5 血漿樣品的處理

    取1 ml 血漿樣品置于Centrifree?超濾裝置(截留分子量>30 000 的物質(zhì))中,在37 ℃水浴中平衡30 min,然后在 37 ℃,1 500×g 下離心 30 min,取樣品超濾液直接進樣。

    1.6 血漿超濾液樣品的配制

    分別取“1.4”項下各濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液以及質(zhì)控工作液 100 μl,加入 100 μl 空白血漿超濾液,稀釋成濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿超濾液樣品,以及濃度為 0.25、1.50、6.00 μg/ml 的質(zhì)控點血漿超濾液樣品。

    2 結(jié)果

    2.1 專屬性

    取空白血漿超濾液,直接進樣,得到色譜圖A;空白血漿超濾液加替考拉寧對照品溶液配制成一定濃度(1.00 μg/ml),混合均勻后進樣,得色譜圖B;取使用替考拉寧的患者血漿,按“1.5”項下處理,進樣后得色譜圖C,考察方法的專屬性。根據(jù)色譜圖1 中A、B、C,可以看出血漿中內(nèi)源性物質(zhì)沒有干擾替考拉寧的檢測,同時TA 2-2 與TA 2-3 完全分開,TA 2-2 保留時間為11.57 min,可以準(zhǔn)確定量TA 2-2。

    圖1 替考拉寧色譜圖

    2.2 線性關(guān)系考察

    分別取“1.6”項下各濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿超濾液樣品5 μl 直接進樣分析,以替考拉寧游離濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),得線性回歸方程為Y=51 708.90X+1 397.10(r=0.999,n=8),結(jié)果表明,替考拉寧游離濃度在0.10~8.00 μg/ml 范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線性關(guān)系,定量下限為0.10 μg/ml。

    2.3 精密度與準(zhǔn)確度

    按照“1.6”項下質(zhì)控點血漿超濾液樣品配制方法,配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品各6 份,直接進樣分析,計算批內(nèi)精密度。按照相同的方法重復(fù)測定3 次,計算批間精密度。結(jié)果見表2。如表2 所示,在低、中、高濃度水平,樣品的批內(nèi)和批間RSD (%)均不超過7.00%,實測值與理論值相對誤差在-5.00%~7.00%之間,精密度與準(zhǔn)確度均符合生物樣品測定要求。

    表2 批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度 (n=6,s)

    表2 批內(nèi)和批間精密度與準(zhǔn)確度 (n=6,s)

    理論濃度(μg/ml)精密度(%)批內(nèi) 批間0.25 0.25±0.02 1.56 6.91 6.77 1.50 1.43±0.05 -4.52 2.53 3.83 6.00 5.95±0.20 -0.88 2.99 3.44實測濃度(μg/ml)準(zhǔn)確度(%)

    2.4 方法回收率

    按照“1.6”項下質(zhì)控點血漿超濾液樣品配制方法,配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品各6 份,直接進樣分析,按線性回歸方程計算實測濃度,以實測濃度與理論濃度的比值計算方法回收率。表3 結(jié)果顯示,低、中、高濃度水平的回收率在93.8%~101%范圍內(nèi),總回收率為97.9%,同時RSD (%)也符合生物樣品分析要求。

    表3 替考拉寧的方法回收率 (n=6,s)

    表3 替考拉寧的方法回收率 (n=6,s)

    濃度水平(μg/ml)回收率(%)RSD(%)總回收率(%)總RSD(%)0.25 101±7.00 6.91 97.9 5.50 1.50 93.8±2.37 2.53 6.00 98.5±2.96 3.01

    2.5 基質(zhì)效應(yīng)

    取來源不同的6 個空白血漿樣品,按照“1.6”項下質(zhì)控點血漿超濾液樣品配制方法,每個來源都分別配制成低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品(每個濃度3 份),直接進樣分析,得峰面積A1。此外,用超純水配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的替考拉寧對照品溶液(每個濃度3 份),直接進樣分析,得峰面積A2。計算相應(yīng)樣品中替考拉寧的A1/A2值,即為基質(zhì)因子(MF),考察基質(zhì)效應(yīng)。表4 結(jié)果顯示,低、中、高濃度水平所有樣品的平均基質(zhì)因子為0.97,接近1.00,且RSD (%)為2.12%,符合生物樣品分析要求,說明基質(zhì)效應(yīng)不會影響分析方法的準(zhǔn)確性。

    2.6 穩(wěn)定性考察

    2.6.1 血漿超濾液樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性

    配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品,每個濃度有6 個重復(fù)樣品,放置在室溫10 h 后與當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定,考察替考拉寧血漿超濾液樣品在室溫下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表5,室溫放置10 h 后,樣品實測濃度與理論濃度偏差在-4.00%~2.17%,RSD(%)不超過6.00%,在生物樣品分析要求范圍內(nèi),表明樣品在室溫下放置10 h 后穩(wěn)定性較好。

    表4 替考拉寧在血漿超濾液中的基質(zhì)效應(yīng) (n=3,s)

    表4 替考拉寧在血漿超濾液中的基質(zhì)效應(yīng) (n=3,s)

    濃度水平(μg/ml) 基質(zhì)因子0.25 1.50 6.00基質(zhì)A 0.96±0.02 0.96±0.01 0.98±0.02基質(zhì)B 0.95±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01基質(zhì)C 1.00±0.01 0.97±0.01 0.99±0.01基質(zhì)D 0.97±0.02 1.00±0.01 0.98±0.01基質(zhì)E 0.99±0.03 0.98±0.02 0.99±0.03基質(zhì)F 0.97±0.02 0.95±0.01 0.98±0.01各濃度水平均值 0.97 0.97 0.98各濃度水平RSD (%) 2.58 2.21 1.30總均值 0.97總RSD (%) 2.12

    2.6.2 血漿超濾液樣品長期冷凍保存的穩(wěn)定性

    配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品,每個濃度有6 個重復(fù)的樣品,在-20 ℃放置15 d 后與測定當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批進樣分析,考察替考拉寧血漿樣品-20 ℃下的穩(wěn)定性。結(jié)果見表5,-20 ℃下儲存15 d 后,樣品實測濃度與理論濃度偏差在-12.0%~-2.67%,RSD 在5.00%以內(nèi),符合生物樣品分析要求,表明樣品在-20 ℃保存15 d 后穩(wěn)定性達標(biāo)。

    2.6.3 血漿超濾液樣品的凍融穩(wěn)定性

    配制低、中、高濃度(0.25、1.50、6.00 μg/ml)的質(zhì)控點血漿超濾液樣品,每個濃度有6 個重復(fù)的樣品,放置在-20 ℃的冰箱內(nèi)超過24 h,取出放置在室溫條件下完全溶解后,再放置在-20 ℃的冰箱內(nèi),反復(fù)凍融3 次,在第3 次融化后與測定當(dāng)日配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線同批進樣分析,以考察血漿樣品3 次凍融循環(huán)穩(wěn)定性。結(jié)果見表5,反復(fù)凍融3 次后,樣品實測濃度與理論濃度偏差在-12.0%~-4.00%,RSD 在6.50%以內(nèi),符合生物樣品分析要求,表明樣品凍融后穩(wěn)定性仍較好。

    3 總結(jié)與討論

    近年來,血漿藥物游離濃度的監(jiān)測逐漸受到廣泛關(guān)注。對于臨床上提倡進行治療藥物監(jiān)測,而蛋白結(jié)合率又高于80%的藥物,建議監(jiān)測藥物游離濃度用以指導(dǎo)用藥的劑量調(diào)整。對于高蛋白結(jié)合率的藥物來說,白蛋白水平的改變可能會導(dǎo)致其藥動學(xué)參數(shù)變異性增加[12]。因此,對于低蛋白血癥(Alb<25 g/L)[8-10]、危重癥、酸血癥、腎衰竭、肝硬化、吸煙、多種藥物合用等這類常伴有白蛋白水平降低的患者來說,替考拉寧的蛋白結(jié)合率具有一定的變異性[7,13],即使獲得相同的替考拉寧總濃度,體內(nèi)真正發(fā)揮藥效的游離替考拉寧濃度也可能不同。此時,應(yīng)準(zhǔn)確測定替考拉寧游離濃度來調(diào)整用藥劑量,以防濃度低達不到治療目標(biāo),或用藥過量導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。為實現(xiàn)對替考拉寧游離濃度的監(jiān)測,本研究首次建立了超濾離心結(jié)合UPLCMS/MS 的方法。該方法與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比,優(yōu)點在于檢測速度快,檢測限較低,靈敏度較高,質(zhì)譜檢測可以排除患者所用的其他藥物對替考拉寧的干擾,準(zhǔn)確度較高。替考拉寧在水中易溶,在乙腈、甲醇中幾乎不溶。因此,用超純水作為儲備液溶劑可使對照品完全溶解。替考拉寧成分復(fù)雜,為實現(xiàn)對各組分的有效分離,本研究選用Dikma公司的EndeavorsilTMC18柱,是通用型UPLC 反相柱,具有獨特的選擇性和超高的分離性能,適合于高效、超快速分離分析,且峰形對稱性好。在流動相選擇的前期探索中,發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇可以更好地提高質(zhì)譜響應(yīng),所以,選用乙腈作為有機相。水相則選擇在0.02 mol/L 醋酸銨溶液中加入0.1%甲酸,增加離子化效率,進一步改善峰形,使各組分完全分離。此外,采用電噴霧電離源(ESI)電離方式,發(fā)現(xiàn)替考拉寧在正離子模式下具有較高的離子化效率,且重現(xiàn)性良好。藥物游離濃度的測定具有一定的難度,難點在于如何快速且有效地分離游離型藥物,對血漿樣品的處理有較高的要求。目前,測定藥物游離濃度常見的樣品處理方法主要有平衡透析法、超濾離心法[14]。其中最常用的是超濾離心法,該法不需稀釋,不會改變生理pH 值、離子組成,主要是利用離心力使游離藥物通過半透膜,迅速而有效地從血液及其他生物樣本中分離游離藥物[15]?,F(xiàn)國內(nèi)外常用的超濾離心裝置主要有Centrifree?和 Amicon Ultra 兩種型號。本研究選用Centrifree?超濾裝置進行分離。Roberts 等在替考拉寧游離濃度測定的研究中,使用Amicon Ultra 超濾裝置分離蛋白[10]。但是,在實驗前期探索中,我們發(fā)現(xiàn)Amicon Ultra 裝置所得血漿超濾液中加入乙腈后仍有沉淀析出,蛋白截留不完全;而Centrifree?裝置產(chǎn)品說明書提示Centrifree?裝置可以截留99.9%的蛋白,且使用該裝置所得血漿超濾液中加入等量乙腈后未見明顯沉淀析出。雖然兩者所用濾膜均是再生纖維素膜,但是相比Amicon Ultra 的凹槽設(shè)計、Centrifree?系列的平面設(shè)計,優(yōu)點在于濾面更大,死體積更小,更有利于微溶質(zhì)的濾過,是專用于從血液等生物樣本中分離蛋白結(jié)合微溶質(zhì)的,用于游離型藥物的分離更為合理[15]。其次,為保證游離藥物可以和蛋白有效分離,應(yīng)選擇合適的濾膜孔徑。由于替考拉寧主要與白蛋白結(jié)合,而白蛋白的分子量約為66 000,本研究選用截留分子量為30 000 的濾膜用以截留與白蛋白結(jié)合的藥物,獲得游離型替考拉寧。此外,確定合適的樣品處理條件也是至關(guān)重要的。首先,收集的血漿樣品為保持穩(wěn)定性,需要低溫保存,但溫度較低可能會影響藥物與蛋白的結(jié)合,導(dǎo)致藥物游離濃度偏低,為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,樣品需在37 ℃平衡30 min 后再進行超濾離心[10]。其次,離心力與離心時間也是影響超濾效果的重要因素[16]。離心力(1 000~2 000)×g 可以達到最佳濾過率,離心時間在15~30 min 時超濾液量與離心時間成正比[16],再結(jié)合文獻[10]報道,本研究最終選用離心力1 500×g,離心時間30 min。同時,為保證樣品測定盡可能不受基質(zhì)的影響,本研究所有樣品均采用空白血漿超濾液作為基質(zhì)進行配制。有文獻[17]也指出,游離藥物分析最適宜的基質(zhì)為空白血漿超濾液。方法建立后按照《中國藥典》(2015 年版)附錄《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》進行驗證,驗證結(jié)果均符合該指導(dǎo)原則的要求。綜上,本研究建立了離心超濾結(jié)合UPLC-MS/MS 檢測替考拉寧游離濃度的方法,該方法簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確,可以為臨床開展替考拉寧游離濃度監(jiān)測提供依據(jù)。

    表5 不同儲存條件下替考拉寧樣品的穩(wěn)定性 (n=6,s)

    表5 不同儲存條件下替考拉寧樣品的穩(wěn)定性 (n=6,s)

    儲存條件 理論濃度(μg/ml)實測濃度(μg/ml)RSD (%)準(zhǔn)確度(%)室溫10 h 0.25 0.24±0.01 5.52 -4.00 1.50 1.48±0.03 2.16 -1.33 6.00 6.13±0.12 2.09 2.17-20 ℃ 15 d 0.25 0.22±0.01 4.76 -12.00 1.50 1.46±0.02 1.98 -2.67 6.00 5.79±0.13 2.23 -3.50凍融3次 0.25 0.22±0.01 6.43 -12.00 1.50 1.44±0.05 3.67 -4.00 6.00 5.68±0.18 3.15 -5.33

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