膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型建立實驗方法及在不同品系中的成模率

姚穎

【摘要】對兩種品系小鼠DBA/1小鼠和FVB/NJ分別采用單次給予高濃度的完全弗氏佐劑（CFA）和膠原的乳化劑;或首次免疫給予低濃度的完全弗氏佐劑（CFA）和膠原的乳化劑，第二次給予不完全弗氏佐劑（IFA）和膠原的乳化劑增強免疫這兩種方法來建立II型膠原誘導性關節(jié)炎模型。通過觀察其外觀、關節(jié)評分來評估模型的成功建立，并觀察兩種品系小鼠在此模型中的差異。結(jié)果顯示：采用兩次免疫的效果更好，且DBA/1小鼠在此模型中成功率為90%-100%;而FVB/NJ小鼠在兩種造模方法中成功率均為0%。

【關鍵詞】膠原誘導型關節(jié)炎;完全弗氏佐劑;不完全弗氏佐劑;牛II型膠原;乳化;DBA/1;FVB/NJ

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA） 是一種種以慢性關節(jié)滑膜炎癥為特征的器官特異性自身免疫系統(tǒng)疾病。在發(fā)病關節(jié)腔內(nèi)有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。主要的病理特征是關節(jié)滑膜及周圍結(jié)締組織異常增生、關節(jié)軟骨進行性破壞?；颊卟粌H具有免疫功能紊亂的特征更嚴重的后果在于患者最終會發(fā)生以四肢關節(jié)為主的全身大小關節(jié)嚴重損傷，致殘率高達15%，而目前RA發(fā)病機制還尚未完全明確。為了進一步研究其發(fā)病機制，揭示有效的臨床干預性治療，建立一個更接近RA的動物模型顯得尤為重要。

CIA（Collagen-induced arthritis）的小鼠模型中顯示與人RA具有相同的免疫學和病理學特征，是較為理想的動物模型。但不同品系的小鼠存在對CIA的遺傳易感性，在成模率上有很大的差異，研究發(fā)現(xiàn)，CIA受多基因控制，主要與 MHC-II 類分子有關。本次實驗選用對CIA高反應的DBA/1小鼠和基因工程中常用到的FVB/NJ小鼠來測試兩種模型方法，觀察這兩種品系在不同模型中的成模率。要想成功地誘發(fā)關節(jié)炎，并能保證有足夠的發(fā)病率和安全性，一些實驗材料、方法以及細節(jié)是必須要去摸索的。本文介紹了成功復制小鼠CIA模型的具體方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8-12周齡，SPF級，DBA/1雌鼠購自維通利華，F(xiàn)VB/NJ雌鼠由上海復旦大學發(fā)育生物學研究所提供，均飼養(yǎng)于上海復旦大學發(fā)育生物學研究所SPF級屏障環(huán)境內(nèi)。在正式實驗前，小鼠需在環(huán)境內(nèi)適應至少一周。每種品系小鼠隨機分為3組，每組10只。

1.1.2 主要試劑和儀器

牛II型膠原（2mg/ml溶于0.05M醋酸）、完全弗氏佐劑（5mlx2mg/ml）、完全弗氏佐劑（5mlx4mg/ml）、不完全弗氏佐劑（均為Chondrex公司產(chǎn)品）;PBS緩沖鹽溶液（Corning公司產(chǎn)品）;渦流振蕩儀（Fisher Scientific）;高通量組織研磨儀（上海萬柏生物）;小鼠固定器（北京翼諾泰科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試劑乳化方法

在超凈工作臺內(nèi)將直徑為2mm的鋼珠浸泡與無水乙醇中15分鐘后取出，吸水紙吸干多余乙醇，將鋼珠置于2ml無菌離心管中。取0.4ml 完全弗氏佐劑（2mg/ml或4mg/ml）加入離心管，再將0.4ml牛II型膠原滴入完全弗氏佐劑中，即滅活結(jié)核分歧桿菌的終濃度分別為1mg/ml和2mg/ml，牛II型膠原的終濃度均為1mg/ml。因為鋼珠在乳化劑中彈跳范圍有限，每管總體積不得超過1ml，這里推薦總體積為0.8ml。渦流振蕩儀混勻后，置于冰上。將離心管插入提前在-20度冰箱里預冷的模塊，蓋上蓋子，65Hz，研磨3分鐘后取出置于冰上冷卻3～4分鐘。重復此步驟3-4次后置于冰上待注射。取少量乳化好的乳化劑于1ml注射器中，滴入水中成固體團塊，不消散即為穩(wěn)定的乳化液。

試劑的乳化是決定造模成功與否的關鍵步驟，這里不建議用超聲的方式進行乳化，因為超聲會將膠原切割成碎片而導致造模失敗。

1.2.2 首次免疫

將小鼠置于固定器內(nèi)，露出尾巴。用70%酒精擦拭消毒注射部位，在距離尾巴根部25mm處進針，皮下向前插入針頭7-10mm，注意避開血管且確保針頭可見，如意外插進血管注射會造成栓塞而導致小鼠死亡。每只小鼠緩慢注射100ul乳化劑，注射完后將針頭停留在注射部位10-15秒，再用手輕輕按住注射部位緩慢拔出針頭，以防漏液。注射每只小鼠之前要用滅菌紙擦拭針頭，以防針頭處漏液，且確保每只小鼠一針打進，不可兩處或多處注射，會造成乳化劑從其他針眼處漏出。乳化劑全程置于冰上，且整個注射時間控制在40分鐘內(nèi)，以保證乳化劑的穩(wěn)定性。對照組給予100ulPBS尾部皮下注射。

1.2.3 增強免疫

對于首次已給予高濃度完全弗氏佐劑（終濃度為2mg/ml）與膠原（終濃度為1mg/ml）的乳化劑的組別不再給予第二次增強免疫。對于首次給予低濃度完全弗氏佐劑（終濃度為1mg/ml）與膠原（終濃度為1mg/ml）的乳化劑的組別須在首次免疫后的第21天進行第二針增強免疫，試劑乳化方法同前，將完全弗氏佐劑（CFA）換成不完全弗氏佐劑（IFA）即可，膠原的終濃度仍為1mg/ml。注射部位須為首次注射部位同側(cè)，距離首次注射部位（靠近小鼠頭部方向）數(shù)毫米處。注射方法同前，每只小鼠注射100ul不完全弗氏佐劑與膠原的乳化劑。對照組再次給予100ulPBS尾部皮下注射。

1.2.4 CIA模型關節(jié)評分

小鼠關節(jié)評分采用5級評分法：0分：正常;1分：一只腳趾發(fā)炎腫脹;2分：不止一只腳趾（但不是整個爪子）發(fā)炎和腫脹，或整個爪子輕度腫脹;3分：整個爪子嚴重發(fā)炎腫脹;4分：包括踝關節(jié)在內(nèi)全部足爪嚴重發(fā)炎、腫脹或僵硬，小鼠不能負重，也不能抓住籠子頂部的鐵絲網(wǎng)（圖1）。關節(jié)評分用于評估各組小鼠的發(fā)病情況并進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)使用Prism（Graphpad）軟件進行分析。使用配對t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示具有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 關節(jié)評分曲線及關節(jié)炎發(fā)病癥狀

首次免疫后第21天開始每周觀察各組小鼠關節(jié)發(fā)病情況，并依據(jù)評分標準進行評分結(jié)果。DBA/1小鼠2mg/ml完全弗氏佐劑加膠原單次免疫組和1mg/ml 完全弗氏佐劑加膠原合并不完全弗氏佐劑加膠原增強免疫組均從第28天開始出現(xiàn)關節(jié)炎發(fā)病跡象，隨著時間的推移，癥狀愈加嚴重，達到高峰后可持續(xù)一段時間，之后癥狀開始逐漸減輕。2mg/ml完全弗氏佐劑加膠原單次免疫組在第49天達到高峰，可持續(xù)21天，之后癥狀開始減輕;1mg/ml 完全弗氏佐劑加膠原合并不完全弗氏佐劑加膠原增強免疫組則在第56天達到高峰，可持續(xù)7天，之后癥狀開始減輕（圖2）。而FVB/NJ小鼠在兩種模型組中均未出現(xiàn)關節(jié)炎癥狀（圖3）。觀察首次免疫后第49天各組小鼠關節(jié)炎發(fā)病情況，DBA/1小鼠1mg/ml 完全弗氏佐劑加膠原合并不完全弗氏佐劑加膠原增強免疫組最嚴重，2mg/ml完全弗氏佐劑加膠原單次免疫組次之，與對照組比較有明顯的關節(jié)腫脹癥狀;FVB/NJ小鼠兩組模型組與對照組比較無差異（圖4）。

2.2 模型成功率

以高峰期關節(jié)評分達到8-12分作為模型成功標準，統(tǒng)計各組模型成功率：在DBA/1小鼠中1mg/ml 完全弗氏佐劑加膠原合并不完全弗氏佐劑加膠原增強免疫組模型成功率為92.5%，2mg/ml完全弗氏佐劑加膠原單次免疫組為47.5%;FVB/NJ小鼠在兩種造模方法中成功率均為0%（圖5）。

3 結(jié)論

DBA/1小鼠在首次免疫給予低濃度的完全弗氏佐劑（CFA）和膠原的乳化劑，第二次給予不完全弗氏佐劑（IFA）和膠原的乳化劑增強免疫的模型效果明顯優(yōu)于高濃度完全弗氏佐劑（CFA）加膠原單次免疫組。首次免疫后28-35天逐漸成模，并在49-63天模型達到高峰，模型成功率可達90%-100%。而FVB/NJ小鼠的在此模型中成功率為0%，有研究指出盡管FVB/NJ小鼠攜帶一種誘導小鼠關節(jié)炎的易感MHC單倍型（H2q），但它對CIA具有抗性。本次實驗結(jié)果也證明了FVB/NJ小鼠不能形成CIA模型。

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