1株灰鸚鵡源弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

徐 靜 ， 馮永其 ， 段俊堂 ， 劉 蓬

(上海野生動(dòng)物園 ， 上海 浦東 201399)

檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，是發(fā)酵型革蘭陰性菌，周身有鞭毛，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢，廣泛存在于土壤、水、食物等自然環(huán)境中，是水體污染的重要細(xì)菌學(xué)指標(biāo)之一[1-3]。其中，弗氏檸檬酸桿菌常與人和動(dòng)物的感染有關(guān)。弗氏檸檬酸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，并且也普遍存在于自然界中，是條件致病菌。近年來(lái)，不斷有報(bào)道表明該菌可引起人和動(dòng)物腹瀉、肺炎及食物中毒等癥狀，能引起細(xì)菌性的系統(tǒng)敗血癥。本文報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌引起灰鸚鵡敗血癥的病例，為同行診治提供參考。

1 發(fā)病情況

2019年5月17日，本園1只灰鸚鵡死亡，隨即進(jìn)行剖檢診斷，發(fā)現(xiàn)其肝臟腫大，有散在出血點(diǎn)，腸道呈現(xiàn)大片出血。在無(wú)菌條件下，從灰鸚鵡心、肝、脾、肺、腎和腸道取樣，劃線(xiàn)接種于哥倫比亞血瓊脂平板上。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征 各臟器培養(yǎng)均有細(xì)菌生長(zhǎng)，且在哥倫比亞血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)呈圓形、表面光滑、中間隆起、邊緣整齊，有α溶血現(xiàn)象。挑選單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并用鑒定培養(yǎng)基鑒定：在顯色培養(yǎng)基麥康凱上為無(wú)色，S.S.瓊脂上為黑色，伊紅-美藍(lán)上為銅黑色，中國(guó)藍(lán)上為藍(lán)色。革蘭染色結(jié)果為革蘭陰性，短桿狀，兩端鈍圓，無(wú)芽孢。將此分離株命名為SH20190518。

2.2 細(xì)菌16S rDNA檢測(cè) 將細(xì)菌分離株提取核酸，并進(jìn)行16S rDNA鑒定。其PCR擴(kuò)增在1 500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，目的條帶與預(yù)期大小一致(圖1)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 16S rDNA PCR結(jié)果

2.3 測(cè)序結(jié)果比對(duì) 將細(xì)菌分離株SH20190518序列提交到NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，分離株16S rDNA與弗氏檸檬酸桿菌的相似度達(dá)到了97.97%以上。選取同源性較高的弗氏檸檬酸桿菌的16S rDNA基因序列作為內(nèi)群；同時(shí)，選取沙門(mén)菌、大腸桿菌、志賀菌、肺炎克雷伯菌作為外群,利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，分離株與弗氏檸檬酸桿菌聚為一類(lèi)(圖2)。綜上所述，分離株SH20190518為弗氏檸檬酸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離株對(duì)頭孢克洛、頭孢克肟高度敏感；對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中度敏感；對(duì)阿奇霉素、阿莫西林不敏感。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 用6～8周齡雌性的SPF BALB/c 小鼠進(jìn)行細(xì)菌的毒力試驗(yàn)，分為腹腔注射組和空白對(duì)照組，每組3只，每只0.5 mL(細(xì)菌濃度為109CFU/mL)。 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)無(wú)異常；腹腔注射組3只小鼠于24 h內(nèi)全部死亡，取其中1只小鼠進(jìn)行剖檢分析并進(jìn)行臟器細(xì)菌培養(yǎng)。死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎均出現(xiàn)不同程度出血、壞死，分離出的細(xì)菌形態(tài)與接種的弗氏檸檬酸桿菌形態(tài)一致，但是細(xì)菌出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，分離株弗氏檸檬酸桿菌有一定的致病性，并且在小鼠體內(nèi)復(fù)制后致病性增強(qiáng)。

圖2 分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

筆者從患病的灰鸚鵡臟器中分離到1株細(xì)菌，基于該菌的形態(tài)學(xué)及16S rDNA基因序列分析，與弗氏檸檬酸桿菌的相似度達(dá)97.97%以上，確認(rèn)該菌為弗氏檸檬酸桿菌。

弗氏檸檬酸桿菌屬于腸桿菌科，該細(xì)菌主要引起呼吸道、消化道以及泌尿生殖道感染，尤其是在嬰幼兒及免疫功能不全的人群中，可引起腦膜炎、腦膿腫及新生兒敗血癥等。2000—2012年，我國(guó)先后有5起弗氏檸檬酸桿菌引起人食源性中毒，進(jìn)而發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的報(bào)道[4-6]。然而，弗氏檸檬酸桿菌對(duì)動(dòng)物致病的重要性尚未確定。近年來(lái)，該菌引起魚(yú)、鱉、蝦、大鯢、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病的報(bào)道較多[7-9]。弗氏檸檬酸桿菌對(duì)水生動(dòng)物的致病報(bào)道多于非水生動(dòng)物，且對(duì)哺乳動(dòng)物的感染主要集中在腸道內(nèi)，對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)和爬行動(dòng)物的感染主要在腸道外。2011年，Ewers等[10]報(bào)道了該菌對(duì)犬、貓、馬和鸚鵡存在致病性。

有研究表明，弗氏檸檬酸桿菌的致病性與其脂多糖結(jié)構(gòu)、耐藥基因及致病基因有很大關(guān)系。嚴(yán)玉霖等[11]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素為脂多糖中的主要毒力成分，可在細(xì)菌溶解或活躍繁殖時(shí)釋放，并引起宿主免疫應(yīng)答，危害人畜健康。周加利[12]發(fā)現(xiàn)，弗氏檸檬酸桿菌脂多糖中的O抗原種類(lèi)對(duì)人和動(dòng)物有很強(qiáng)的感染力，并且對(duì)內(nèi)毒素的毒力作用有調(diào)控能力。本文根據(jù)分離株的藥敏試驗(yàn)，對(duì)同群灰鸚鵡進(jìn)行頭孢菌素類(lèi)藥物預(yù)防，以減少動(dòng)物死亡。小鼠毒力試驗(yàn)表明，分離株在小鼠體內(nèi)復(fù)制后，毒力增強(qiáng)。因此，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)細(xì)菌的致病基因與其致病性之間的作用機(jī)理的研究。