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    花楸樹(shù)小熱激蛋白23.8基因(SpHSP23.8)克隆與表達(dá)分析

    2020-12-04 02:31:12魯儀增常金財(cái)
    關(guān)鍵詞:亞族楸樹(shù)內(nèi)含子

    張 澤,裴 鑫,魯儀增,常金財(cái),鄭 健,①

    (1. 北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院,北京 102206; 2. 山東省林木種質(zhì)資源中心,山東 濟(jì)南 250102;3. 呼倫貝爾市林業(yè)科學(xué)研究所,內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008)

    小熱激蛋白(sHSPs)是理論相對(duì)分子質(zhì)量介于16 000~40 000之間的一類熱激蛋白,是植物中最豐富且分布廣泛的一類熱激蛋白,且相較于其他真核生物,數(shù)目更多,差異也較大[1]。小熱激蛋白不僅參與許多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程及某些蛋白質(zhì)家族成員突變導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂的調(diào)節(jié)[2-3],還能在脅迫下作為中間體,通過(guò)阻止蛋白質(zhì)的不可逆變性保護(hù)蛋白質(zhì)。同時(shí),小熱激蛋白不僅起著“保持酶”伴侶的作用,還積極調(diào)控蛋白質(zhì)富集過(guò)程,提高細(xì)胞在不同應(yīng)激條件下(如高溫或氧化應(yīng)激)恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的能力。除了調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和響應(yīng)細(xì)胞條件的變化,許多小熱激蛋白基因還能在正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中表達(dá)[4-5],通過(guò)調(diào)節(jié)正常蛋白質(zhì)間的相互作用影響多種細(xì)胞功能,包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、分化和凋亡。研究表明:小熱激蛋白不僅參與植物對(duì)高溫或熱激的響應(yīng),而且能響應(yīng)其他生物及非生物脅迫,如病原菌、捕食者、干旱、低溫、鹽害、紫外線、重金屬離子、滲透脅迫、厭氧脅迫甚至是重力的變化等,也能誘導(dǎo)小熱激蛋白基因表達(dá)[6]。高溫脅迫下,F(xiàn)estucaarundinaceaSchreb.中FaHSP18.2基因的表達(dá)量明顯上調(diào),進(jìn)而提高其對(duì)高溫的耐受性[7];干旱脅迫處理后,EucalyptuscladocalyxF. Muell.中EcHSP17.6基因表達(dá)量極顯著升高[8];馬鈴薯(SolanumtuberosumLinn.)中大多數(shù)小熱激蛋白基因在高溫脅迫、鹽脅迫和滲透脅迫下明顯上調(diào)表達(dá)[9];水稻(OryzasativaLinn.)中OsHSP26.7、OsHSP23.2、OsHSP17.9A、OsHSP17.4和OsHSP16.9A基因在熱脅迫下上調(diào)表達(dá)[10];橡膠樹(shù)〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕在低溫脅迫條件下大多數(shù)小熱激蛋白基因明顯上調(diào)表達(dá)[11]。然而,小葉楊(PopulussimoniiCarr.)中PsHSP17.4基因在高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄下調(diào),推測(cè)其可能在小葉楊高溫脅迫過(guò)程中不作為分子伴侶,而是發(fā)揮了其他功能[12]。此外,小熱激蛋白還能參與植物特定的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[13]。

    花楸樹(shù)〔Sorbuspohuashanensis(Hance) Hedl.〕為落葉小喬木,廣泛分布于中國(guó)北方地區(qū),原生境海拔約800~2 500 m,是一種優(yōu)良的觀葉、觀花、觀果樹(shù)種,在中國(guó)東北地區(qū)作為行道樹(shù)適應(yīng)性良好[14]。除觀賞價(jià)值外,花楸樹(shù)還是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物[15-16]。已有關(guān)于花楸樹(shù)的研究主要集中在地理分布與天然更新[17]、群體遺傳多樣性[18]、種源地理變異[19]、種子發(fā)育與休眠[20-21]、繁殖技術(shù)[22-23]以及引種馴化[24]等方面,而在花楸樹(shù)響應(yīng)高溫脅迫的機(jī)制方面,僅有花楸樹(shù)2年生幼苗響應(yīng)高溫脅迫的生理生化機(jī)制[25-26]以及花楸樹(shù)熱激蛋白70基因克隆和功能[27]方面的初步報(bào)道。花楸樹(shù)自然生境海拔較高,土壤大多為山地棕壤,pH 5.4至pH 6.2,呈弱酸性,腐殖質(zhì)含量高,養(yǎng)分豐富,土壤肥力高。在實(shí)際引種馴化及種質(zhì)資源保存過(guò)程中,難以保證引種地(或保存地)與原生地環(huán)境完全一致,因此,花楸樹(shù)引種到低海拔地區(qū)將面臨包括高溫在內(nèi)的多種非生物脅迫限制,探究其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)有助于研究其馴化適應(yīng)機(jī)制。本研究克隆了花楸樹(shù)小熱激蛋白基因,探討其在非生物脅迫條件下的表達(dá)模式,并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步剖析,明確其在高溫等非生物脅迫下的響應(yīng)表達(dá)模式,以期為花楸樹(shù)引種馴化奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    實(shí)驗(yàn)于2017年3月至2019年5月在北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。供試花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗(營(yíng)養(yǎng)缽栽)用于干旱和NaCl脅迫實(shí)驗(yàn),2年生實(shí)生苗(盆栽)用于高溫脅迫實(shí)驗(yàn),4年生實(shí)生苗用于基因組DNA提取和組織特異性表達(dá)分析。野生型擬南芥(Col背景)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

    實(shí)驗(yàn)用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker、pTOPO-TA Simple克隆載體及EasyPure Quick Gel Extraction Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit、50×TAE Buffer、2×Sybr Green qPCR Mix和抗生素等化學(xué)試劑購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司。Pleela超表達(dá)載體由中國(guó)科學(xué)院植物研究所劉永秀課題組惠贈(zèng)。引物合成及測(cè)序皆由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第1鏈合成 參照劉聰聰?shù)萚27]的方法進(jìn)行花楸樹(shù)葉片基因組DNA的提取,參照EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取,參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第1鏈。

    1.2.2 基因克隆和序列分析 對(duì)花楸樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[28]進(jìn)行分析后,經(jīng)NCBI的BLAST網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中BLASTn在線軟件比對(duì),獲得1條與小熱激蛋白基因相似的序列,依據(jù)所得序列設(shè)計(jì)引物SpHSP23.8-CF和SpHSP23.8-CR(表1),分別以花楸樹(shù)cDNA和gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μL,包括模板1.0 μL、10 μmol·L-1正向和反向引物各0.4 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 10.0 μL和ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶、連接到pTOPO-TA Simple克隆載體進(jìn)行測(cè)序,采用DNAMAN 7.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)分析,獲得該基因的cDNA序列,然后對(duì)該基因的gDNA和cDNA進(jìn)行序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析。

    1.2.3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN 7.0軟件預(yù)測(cè)花楸樹(shù)SpHSP23.8基因編碼的氨基酸序列,利用NCBI的BLAST網(wǎng)站中BLASTp在線軟件進(jìn)行同源性比對(duì);利用ExPasy網(wǎng)站(http:∥www.expasy.org/)的相關(guān)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和理論相對(duì)分子質(zhì)量;通過(guò)ProtParam工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;利用Sopma工具(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用ClustalX 2.1軟件對(duì)花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白以及擬南芥、水稻和毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. et A. Gray ex Hook.)等模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析(鄰接法,neighbor joining method),并采用自檢舉法(bootstrap method)對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行評(píng)估(重復(fù)1 000次)。

    表1 用于花楸樹(shù)SpHSP23.8基因克隆和表達(dá)的引物序列

    1.2.4 基因表達(dá)分析

    1.2.4.1 組織特異性表達(dá)分析 參照劉聰聰?shù)萚27]的研究方法,選取3株花楸樹(shù)4年生實(shí)生苗,分別于2018年3月10日取芽,3月20日取幼葉和莖(1年生枝條的頂部第1和第2節(jié)間部分),4月20日(盛花期)取花,5月20日(花期后20 d)取果實(shí)、成熟葉和根,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。每株作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),重復(fù)3次。

    1.2.4.2 響應(yīng)高溫脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)2年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料,置于晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中預(yù)處理3 d后,進(jìn)行溫度42 ℃、全光照、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1熱激脅迫處理,期間正常澆灌清水避免干旱,分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對(duì)照。每個(gè)處理3株,重復(fù)3次。

    1.2.4.3 響應(yīng)NaCl脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料,在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m·s-1的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng),分別澆灌200和300 mmol·L-1NaCl溶液100 mL,分別于處理2和7 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以澆灌等體積蒸餾水為對(duì)照。每個(gè)處理10株,重復(fù)3次。

    1.2.4.4 響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析 以花楸樹(shù)1年生實(shí)生苗為實(shí)驗(yàn)材料,在晝溫25 ℃、夜溫23 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度300 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中,分別于干旱脅迫(不澆灌清水)處理5和10 d從植株頂端往下數(shù)取第3枚葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以正常澆灌清水為對(duì)照。每個(gè)處理10株,重復(fù)3次。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1),均以花楸樹(shù)β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,引物為Spβ-actinQF和Spβ-actinQR(表1),PCR反應(yīng)體系參照2×Sybr Green qPCR Mix說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán)。

    1.2.5 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析

    采用Gateway方法[29],構(gòu)建SpHSP23.8-Pella(35S驅(qū)動(dòng))超表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101+MPK90,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。在含有100 μg·mL-1草銨膦(PPT)的固體MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)3代篩選獲得2個(gè)超表達(dá)純合轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2,用于后續(xù)試驗(yàn)。載體構(gòu)建使用的引物為SpHSP23.8-TF和SpHSP23.8-TR(表1)。

    1.2.5.1 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)高溫脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料,將其置于溫度42 ℃、全光照、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的人工氣候箱中,分別于處理0.00、0.25、1.00、2.00、6.00、12.00和24.00 h取蓮座葉片(處理期間正常澆灌清水),經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以高溫脅迫0.00 h為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株,重復(fù)3次。

    1.2.5.2 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)NaCl脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料,在晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中,分別澆灌150 mmol·L-1NaCl溶液100 mL,每3 d澆灌1次,分別于處理0、3、6和9 d取蓮座葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以處理0 d為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株,重復(fù)3次。

    1.2.5.3 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析 以4周齡OE1和OE2為實(shí)驗(yàn)材料,在光照時(shí)間16 h·d-1、晝溫22 ℃、夜溫18 ℃、光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中,分別于干旱脅迫(不澆灌清水)0、3、6和9 d取蓮座葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。以干旱脅迫0 d為對(duì)照。每個(gè)基因型每個(gè)處理收集3株,重復(fù)3次。

    qRT-PCR分析使用的引物為SpHSP23.8-QF和SpHSP23.8-QR(表1),以擬南芥β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因,引物為Atβ-actinQF和Atβ-actinQR(表1),參照2×Sybr Green qPCR Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR分析,PCR反應(yīng)程序同1.2.4.4,每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    定量結(jié)果采用2-ΔΔCT方法[30]進(jìn)行計(jì)算。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較[31]。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 花楸樹(shù)小熱激蛋白基因cDNA和gDNA序列分析

    根據(jù)花楸樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以花楸樹(shù)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序,獲得1條長(zhǎng)度為648 bp的片段(圖1),經(jīng)與其他植物比對(duì),發(fā)現(xiàn)該片段為花楸樹(shù)小熱激蛋白20家族基因。將PCR產(chǎn)物純化并成功連入pTOPO-TA Simple克隆載體,測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)后,確定克隆得到的序列為小熱激蛋白20基因的ORF序列,該序列共包含648個(gè)堿基,編碼215個(gè)氨基酸,編碼氨基酸序列理論相對(duì)分子質(zhì)量約23 800,該基因命名為SpHSP23.8(圖2)。以花楸樹(shù)gDNA為模板的PCR產(chǎn)物堿基序列與SpHSP23.8基因ORF堿基序列比較,發(fā)現(xiàn)該基因gDNA序列共包含953個(gè)堿基,在238至633位點(diǎn)插入1個(gè)長(zhǎng)度為305 bp的內(nèi)含子(圖1-B)。

    M: Marker; 1,2: 分別為SpHSP23.8基因的cDNA和gDNA的PCR擴(kuò)增條帶PCR amplified bands of cDNA and gDNA of SpHSP23.8 gene,respectively; ATG: 起始密碼子Initiation codon; TAG: 終止密碼子Termination codon.

    2.2 花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白的基本特性

    蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示:花楸樹(shù)SpHSP23.8基因編碼215個(gè)氨基酸,組成結(jié)構(gòu)為C1034H1685N297O334S7,不穩(wěn)定系數(shù)66.61,屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白包含帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)33個(gè),帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)31個(gè)(圖2),理論等電點(diǎn)為pI 5.47,屬于酸性蛋白質(zhì)。

    箭頭示內(nèi)含子插入位點(diǎn)The arrow shows the insertion site of intron; 方框示小熱激蛋白特有保守序列The boxes show the specific and conserved sequences of small heat shock protein; *: 終止密碼子Termination codon.

    蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示:花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白中α螺旋包含50個(gè)氨基酸殘基,占總氨基酸殘基數(shù)的23.26%;β轉(zhuǎn)角包含9個(gè)氨基酸殘基,占總氨基酸殘基數(shù)的4.19%;延伸鏈包含28個(gè)氨基酸殘基,占總氨基酸殘基數(shù)的13.02%;無(wú)規(guī)卷曲包含128個(gè)氨基酸殘基,占總氨基酸殘基數(shù)的59.53%。

    h: α螺旋α-helix; t: β轉(zhuǎn)角β-turn; e: 延伸鏈Extended strand; c: 無(wú)規(guī)卷曲Random coil.

    蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4)顯示:SpHSP23.8蛋白包含28個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中,絲氨酸磷酸化位點(diǎn)23個(gè),蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)5個(gè)。

    : 絲氨酸Serine; : 酪氨酸Tyrosine; : 蘇氨酸Threonine; : 閾值Threshold.

    SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)顯示:Y分值的最大值為0.214,C分值的最大值為0.126,S分值的最大值為0.444,D值(S分值的平均值和Y分值的最大值的平均值)為0.224(小于0.500),說(shuō)明SpHSP23.8蛋白不具有信號(hào)肽。

    : C分值C-score; : S分值S-score; : Y分值Y-score; : 閾值Threshold.

    將SpHSP23.8蛋白的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)SpHSP23.8蛋白中ACD序列分別位于119~200位點(diǎn),其羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L(圖2)。與同源性較高的植物的比對(duì)結(jié)果(圖6)顯示:SpHSP23.8蛋白與枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕EjsHSP6蛋白(登錄號(hào)AKP06201.1)的同源性最高,為94.88%;與白梨(PyrusbretschneideriRehd.)PbsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_009348586.1)、梅(PrunusmumeSieb.)PmHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_008238549.1)、桃〔Prunuspersica(Linn.) Batsch〕PpHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_007209602.1)和歐洲甜櫻桃〔Prunusavium(Linn.) Linn.〕PaHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_021831941.1)的同源性也較高,分別為93.95%、83.26%、82.33%和81.86%;與月季花(RosachinensisJacq.)RcHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_024172893.1)、大桉(EucalyptusgrandisW. Mill ex Maiden)EgsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_010053471.1)、野草莓(FragariavescaLinn.)FvHSP22蛋白(登錄號(hào)XP_004299444.1)、中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)AcsHSP蛋白(登錄號(hào)PSS11530.1)和南瓜(CucurbitamoschataDuch.)CmsHSP蛋白(登錄號(hào)XP_022937223.1)的同源性較低,分別為64.94%、64.53%、63.20%、61.09%和61.01%。

    Sp: 花楸樹(shù)Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl.; Ej: 枇杷Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.; Pb: 白梨Pyrus bretschneideri Rehd.; Pm: 梅Prunus mume Sieb.; Pp: 桃Prunus persica (Linn.) Batsch; Pa: 歐洲甜櫻桃Prunus avium (Linn.) Linn.; Rc: 月季花Rosa chinensis Jacq.; Eg: 大桉Eucalyptus grandis W. Mill ex Maiden; Fv: 野草莓Fragaria vesca Linn.; Ac: 中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.; Cm: 南瓜Cucurbita moschata Duch.

    對(duì)花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白與擬南芥、水稻和毛果楊3種模式植物不同亞族小熱激蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類分析,結(jié)果(圖7)顯示:花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白與毛果楊PtHSP24.0蛋白在進(jìn)化上關(guān)系最近,且與毛果楊、擬南芥和水稻線粒體亞族的小熱激蛋白聚為一支,推測(cè)SpHSP23.8蛋白定位于花楸樹(shù)的線粒體中。

    Pt: 毛果楊Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.; Os: 水稻Oryza sativa Linn.; Sp: 花楸樹(shù)Sorbus pohuashanensis (Hance) Hedl. CⅠ,CⅡ,CⅢ,CⅣ,CⅤ,CⅥ: 分別為細(xì)胞質(zhì)亞族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ Cytosol subgroup Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,and Ⅵ,respectively; ER: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亞族Endoplasmic reticulum subgroup; PX: 過(guò)氧化物酶體亞族Peroxisome subgroup; CP: 葉綠體亞族Chloroplast subgroup; MⅠ,MⅡ: 分別為線粒體亞族Ⅰ和Ⅱ Mitochondria subgroup Ⅰ and Ⅱ,respectively. 分支上數(shù)據(jù)表示重復(fù)次數(shù)Datums in the branches indicate repeats.

    2.3 花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的表達(dá)分析

    花楸樹(shù)不同器官中SpHSP23.8基因的表達(dá)情況見(jiàn)圖8;高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫下,花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的表達(dá)情況分別見(jiàn)圖9、圖10和圖11。

    YL: 幼葉Young leaf; ML: 成熟葉Mature leaf; B: 芽Bud; Fl: 花Flower; Fr: 果實(shí)Fruit; S: 莖Stem; R: 根Root. 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

    由圖9可以看出:隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。高溫脅迫0.25 h,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量即顯著升高,隨后急劇升高;高溫脅迫2.00 h,其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值,隨后其相對(duì)表達(dá)量顯著降低。

    不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercases indicate the significant (P<0.05) difference.

    由圖10可以看出:200和300 mmol·L-1NaCl脅迫下,花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(蒸餾水)。NaCl脅迫2 d,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量隨著NaCl濃度的提高顯著升高;NaCl脅迫7 d,其相對(duì)表達(dá)量隨著NaCl濃度的提高先顯著升高后顯著降低。

    : 對(duì)照The control; : 200 mmol·L-1 NaCl; : 300 mmol·L-1 NaCl.

    由圖8可以看出:花楸樹(shù)莖中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量最高,顯著(P<0.05)高于其他器官;果實(shí)和根中的相對(duì)表達(dá)量也較高;花中的相對(duì)表達(dá)量最低。

    由圖11可以看出:干旱脅迫5 d,花楸樹(shù)葉片中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照(正常澆灌清水)無(wú)顯著差異;干旱脅迫10 d,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照。

    : 對(duì)照The control; : 干旱處理Drought treatment.

    2.4 轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的表達(dá)分析

    為進(jìn)一步探究SpHSP23.8基因響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)模式,構(gòu)建了SpHSP23.8基因的超表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,通過(guò)草銨膦(PPT)篩選獲得超表達(dá)純合轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2(圖12)。

    M: Marker; WT: 野生型擬南芥Wild type of Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.

    對(duì)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2分別進(jìn)行高溫脅迫、NaCl脅迫和干旱脅迫,結(jié)果(圖13)顯示:隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì),其中,高溫脅迫0.25 h,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量即較對(duì)照(高溫脅迫0.00 h)顯著升高;高溫脅迫6.00 h,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值;高溫脅迫24.00 h,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照。隨著NaCl脅迫和干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系OE1和OE2中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸升高的變化趨勢(shì),且均較對(duì)照(脅迫0 d)顯著升高。上述結(jié)果說(shuō)明:轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因能夠被高溫脅迫、NaCl脅迫以及干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

    : OE1株系OE1 line; : OE2株系OE2 line.

    3 討論和結(jié)論

    植物小熱激蛋白的高度多樣化以及與穩(wěn)定蛋白結(jié)合等特點(diǎn)反映了植物對(duì)特定應(yīng)激條件的適應(yīng)性,表明小熱激蛋白在植物抗逆性中起重要作用[32]。本研究從花楸樹(shù)中分離出1個(gè)小熱激蛋白20家族基因SpHSP23.8,該基因的開(kāi)放閱讀框包含648個(gè)堿基,編碼215個(gè)氨基酸;SpHSP23.8蛋白氨基酸序列的羧基端存在小熱激蛋白中保守的氨基酸殘基序列P-x(14)-x-V/L/I-V/L/I和P-x(14)-G-V-L,進(jìn)一步證實(shí)該基因?yàn)榛ㄩ睒?shù)小熱激蛋白基因[33]。同時(shí),這些保守基序的存在也是小熱激蛋白二聚體形成的前提[34],推測(cè)該小熱激蛋白能夠發(fā)揮分子伴侶的功能。

    植物小熱激蛋白中內(nèi)含子數(shù)量多變,且插入位點(diǎn)也存在較大差異。大多數(shù)小熱激蛋白不含或含有1個(gè)內(nèi)含子,如:馬鈴薯48個(gè)小熱激蛋白基因中,20個(gè)不含內(nèi)含子,23個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子,5個(gè)含有2個(gè)及以上內(nèi)含子[9];水稻39個(gè)小熱激蛋白基因中,19個(gè)不含內(nèi)含子,17個(gè)含有1個(gè)內(nèi)含子,3個(gè)含有2個(gè)及以上內(nèi)含子[35]。另有研究發(fā)現(xiàn),一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)Ⅰ和Ⅱ亞族中小熱激蛋白不含內(nèi)含子,而在葉綠體和線粒體亞族中小熱激蛋白含有1個(gè)內(nèi)含子,且內(nèi)含子插入位點(diǎn)相似,這些亞族小熱激蛋白具有較近的親緣關(guān)系[36]。本研究中,花楸樹(shù)SpHSP23.8基因包含1個(gè)內(nèi)含子,該小熱激蛋白屬于線粒體亞族,這一結(jié)果進(jìn)一步論證了含有1個(gè)內(nèi)含子的線粒體亞族小熱激蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系較近。

    花楸樹(shù)SpHSP23.8蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含23.26%的α螺旋、4.19%的β轉(zhuǎn)角、13.02%的延伸鏈和59.53%的無(wú)規(guī)卷曲,其中,β轉(zhuǎn)角有助于SpHSP23.8蛋白形成反向平行結(jié)構(gòu)[37-38],進(jìn)而發(fā)揮功能。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程中較為重要和普遍的調(diào)節(jié)方式之一,SpHSP23.8蛋白包含28個(gè)磷酸化位點(diǎn),分別為23個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明在非生物脅迫時(shí),SpHSP23.8蛋白在翻譯后可能通過(guò)磷酸化修飾發(fā)揮抗性作用[39]。

    花楸樹(shù)SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)不同器官中均有表達(dá),表明該基因參與了花楸樹(shù)各器官正常的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)蘭州百合〔Liliumdavidiivar.willmottiae(E. H. Wilson) Raffill〕小熱激蛋白的研究結(jié)果顯示:LimHSP16.45基因在花藥中特異性高表達(dá)[40]。而本研究中SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)花中的相對(duì)表達(dá)量最低,推測(cè)該基因在花的發(fā)育過(guò)程中參與較少。對(duì)橡膠樹(shù)HbHSP23.8基因的組織特異性表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因在膠乳中的相對(duì)表達(dá)量最高,且在葉片不同發(fā)育時(shí)期也存在明顯差異[41]。茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.) Kuntze〕4個(gè)小熱激蛋白基因在組織中的相對(duì)表達(dá)量也存在差異,其中,CsHSP22.4和CsHSP27.4基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高,CsHSP17.5和CsHSP25.2基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高[42]。本研究中,SpHSP23.8基因在花楸樹(shù)莖中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是果實(shí)和根。不同植物小熱激蛋白基因在不同組織中的差異表達(dá)也進(jìn)一步表明小熱激蛋白進(jìn)化存在差異。

    在對(duì)花楸樹(shù)進(jìn)行高溫(42 ℃)脅迫的過(guò)程中,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先急劇升高后降低的變化趨勢(shì),高溫脅迫0.25 h時(shí)SpHSP23.8基因即出現(xiàn)顯著性變化,高溫脅迫2.00 h時(shí)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。這一結(jié)果與大多數(shù)植物小熱激蛋白基因在高溫脅迫下的變化趨勢(shì)一致,如:茶樹(shù)CsHSP17.2基因表達(dá)量在38 ℃下0.5 h出現(xiàn)顯著變化,于1.0 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降[43];水稻中OsHSP18.2基因的表達(dá)量在45 ℃下0.25 h出現(xiàn)顯著變化,于2.00 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降[44]。高溫脅迫下,植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝進(jìn)程、活性氧和抗氧化物質(zhì)含量、信號(hào)傳導(dǎo)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量都會(huì)產(chǎn)生變化,此時(shí)小熱激蛋白寡聚體與底物結(jié)合殘基隨著溫度升高而被解離和激活[45],增強(qiáng)了其分子伴侶活性,起到維持植物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用?;ㄩ睒?shù)SpHSP23.8基因在高溫脅迫不同時(shí)間的差異表達(dá)表明其可能參與了花楸樹(shù)對(duì)高溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。對(duì)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系的高溫(42 ℃)脅迫結(jié)果亦顯示:轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)趨勢(shì)一致,進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因參與了花楸樹(shù)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)。

    花楸樹(shù)原生境土壤偏酸性,低海拔引種地區(qū)土壤的偏堿性可能對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)一定影響。本研究中,200 mmol·L-1NaCl脅迫2 d,花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量隨NaCl濃度升高而顯著升高,表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)NaCl脅迫;而高濃度(300 mmol·L-1)NaCl脅迫7 d,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量降低,這可能是由于花楸樹(shù)幼苗在高濃度NaCl脅迫下出現(xiàn)萎蔫所致。此外,在150 mmol·L-1NaCl脅迫下,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)相一致,進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)NaCl脅迫。

    干旱脅迫5 d,花楸樹(shù)SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量未出現(xiàn)顯著變化,可能是此時(shí)花楸樹(shù)尚未受到明顯的干旱脅迫;干旱脅迫10 d,土壤含水量持續(xù)下降,SpHSP23.8基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高,表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)干旱脅迫。此外,在干旱脅迫下,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系中SpHSP23.8基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與其內(nèi)源表達(dá)相一致,也進(jìn)一步表明SpHSP23.8基因能夠響應(yīng)干旱脅迫。

    綜上所述,花楸樹(shù)SpHSP23.8基因表現(xiàn)出對(duì)高溫、干旱及NaCl等非生物脅迫的應(yīng)激響應(yīng),這為揭示SpHSP23.8基因響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但與野生型擬南芥相比,2個(gè)轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥株系未表現(xiàn)出明顯的表型差異。究其原因,一方面,依據(jù)微效多基因假說(shuō),推測(cè)SpHSP23.8基因的單一超表達(dá)不足以提升擬南芥整個(gè)抗逆網(wǎng)絡(luò)對(duì)非生物脅迫的抵抗;另一方面,植物對(duì)于非生物脅迫的響應(yīng)包括感知、傳導(dǎo)和應(yīng)答等方面,而SpHSP23.8蛋白作為分子伴侶可能需要其他蛋白質(zhì)或者轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同參與,因此,轉(zhuǎn)SpHSP23.8基因擬南芥響應(yīng)和參與非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)還有待進(jìn)一步的深入研究。

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